納米探針的制備方法、基于天然產(chǎn)物單體和納米探針的納米藥物的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種靶向納米探針的制備方法、基于天然產(chǎn)物單 體和納米探針的納米藥物的制備方法及應(yīng)用，以納米探針GC-QDs為載體，負(fù)載天然產(chǎn)物單 體之后制備成具有熒光性質(zhì)的靶向納米藥物，可用于肝細(xì)胞性肝癌的診斷標(biāo)記和治療。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝細(xì)胞性肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC)是由病毒和化學(xué)致癌物等多因 素的作用引起肝細(xì)胞生長失控而致癌變。HCC惡性程度極高，預(yù)后很差，早診早治是提高 HCC患者生存率的唯一途徑。GPC-3的表達(dá)與肝細(xì)胞癌的形成關(guān)系密切，具癌胚性，可作為 早期HCC的血清標(biāo)志物和潛在的靶向治療目標(biāo)。通過建立高特異性和高靈敏度的GPC-3監(jiān) 測方法，可有望實(shí)現(xiàn)靶向HCC的準(zhǔn)確診斷和及時(shí)治療。
[0003] 雷公藤紅素是一種具有顯著抗腫瘤活性的天然活性單體。由于雷公藤紅素的毒副 作用也相對較大，因此，對雷公藤紅素的結(jié)構(gòu)優(yōu)化以及劑型的改造是得到具有高效低毒特 性的抗腫瘤化合物的重要途徑。關(guān)于雷公藤紅素新劑型的研究，目前報(bào)道不多，主要包括 口服自微乳以及固體脂質(zhì)納米粒等幾種劑型，通過表面負(fù)載的方式制備納米藥物的研究不 多。
[0004] 量子點(diǎn)可以作為一種理想的熒光探針以及納米載體材料，可用于疾病的診斷、治 療及藥物研發(fā)等研究領(lǐng)域。但是常用量子點(diǎn)的細(xì)胞毒性較大，生物安全性和生物靶向性較 差。通過結(jié)構(gòu)改造和功能化修飾，可以顯著改善量子點(diǎn)的諸多缺點(diǎn)，進(jìn)而應(yīng)用到生物醫(yī)學(xué)的 研究領(lǐng)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種納米探針的制備方法、基于天然產(chǎn)物單體和 納米探針的納米藥物的制備方法及應(yīng)用，制備的納米藥物更有利于藥物的釋放，提高藥物 利用率，并且表面修飾之后，納米探針的熒光特性沒有影響。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的實(shí)施例提供一種納米探針的制備方法，所述納米 探針以ZnS為殼層的核殼結(jié)構(gòu)的熒光量子點(diǎn)為載體，通過表面修飾單抗GC-33制備得到，其 制備步驟如下： (1-1)制備以ZnS為殼層的核殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn)； (1-2)取2~10 ml以ZnS為殼層的核殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn)溶液超生分散，15000 rpm轉(zhuǎn)離心 30~50 min，加超純水0. 5 ml，備用； (1-3)取5~20 mg的碳化二亞胺，l~10mg N-羥基硫代琥珀酰亞胺加水I. 0 ml溶解； (1-4)取上述溶液0. 3~1. 0 ml加入以ZnS為殼層的核殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn)溶液中，定容至 I. 0~5. 0 ml，37°C搖床反應(yīng)1~2小時(shí)； (1-5) 15000 rpm高速離心30~50分鐘，棄上清，用pH 8. 5的PBS溶液250~1000 μ 1 重新溶解； (1-6)加5~20 μ 1的靶向GPC-3的單抗GC-33溶液，37°C的恒溫下，搖床反應(yīng)2~3小 時(shí)，將單抗GC-33修飾到以ZnS為殼層的核殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn)的表面； (1-7)15000 rpm離心30~50分鐘，溶于pH 7. 2的PBS溶液中，分離提純得到靶向腫瘤 標(biāo)志物GPC-3的熒光納米探針。
[0007] 其中，所述步驟（1-1)中的以ZnS為殼層的核殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn)為ZnO/ZnS，具體制備 步驟如下： (2-1)將3~8g乙酸鋅和0. 3~1. 5g乙酸鈉加入到裝有200mL乙醇的圓底燒瓶中； (2-2)加熱溶解后，迅速加入I. 0 mol/1的氧化鈉乙醇溶液18~50 mL，反應(yīng)30~60分 鐘，冷卻至室溫； (2-3)在溶液中以0. 5~2. 0滴/秒的滴速滴加過量乙酸乙酯至有沉淀產(chǎn)生，離心分離 出沉淀物，用乙酸乙酯洗滌3~5次，然后把沉淀物重新分散在乙醇中，制得ZnO納米顆粒； (2-4)向ZnO納米顆粒的懸浮液中依次滴加0. 2 mol/1的乙酸鋅3~10 ml和等體積的 0. 2 mol/1的硫代乙酰胺的乙醇溶液，滴速保持0. 5~2. 0滴/秒，滴加完成后加熱； (2-5)按照S-Zn-S-Zn逐層對其進(jìn)行ZnS殼層包覆，形成ZnO/ZnS量子點(diǎn)，反應(yīng)4~8小 時(shí)后終止，再次使用乙酸乙醋沉淀出不同粒徑的ZnO/ZnS核殼納米顆粒，離心分離出ZnO/ ZnS核殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn)。
[0008] 本發(fā)明還提供一種基于天然產(chǎn)物單體和納米探針的納米藥物的制備方法，通過酰 胺化反應(yīng)，將天然產(chǎn)物單體與氨基化PEG連接成藥物分子-PEG的聚合物，然后通過相轉(zhuǎn)移 的方法將該聚合物連接到量子點(diǎn)表面，進(jìn)而形成具有靶向性的熒光納米藥物。
[0009] 上述納米藥物的制備方法包括如下步驟： (3-1)以ZnS為殼層的核殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn)為載體，通過表面修飾單抗GC-33制備靶向腫瘤 標(biāo)志物GPC-3的熒光納米探針GC-QDs 1~10 ml ; (3-2)取天然產(chǎn)物單體配置成I. 0~10. 0 mg/ml的藥物溶液，備用； (3-3)取5~15mg的碳化二亞胺、1~5 mg N-羥基硫代琥珀酰亞胺加水I. 0~5. Oml溶解； (3-4)取步驟（3-3)所制溶液0. 5 ml，加入到0. 3~1.0ml按步驟（3-2)配置的藥物溶 液中，定容至I. 0 ml，37°C搖床反應(yīng)1~3小時(shí)； (3-5)向上述混合溶液中以1~2滴/秒滴加2mg/ml的氨基化PEG溶液l~5ml，然后在 37°C的恒溫下反應(yīng)2~4小時(shí)，攪拌速度200~1000轉(zhuǎn)/min，制備成藥物分子-PEG的聚合物， 純化后用PBS重新溶解，備用； (3-6)將藥物分子-PEG的聚合物溶液與步驟（3-1)配置的納米探針GC-QDs溶液，按照 等質(zhì)量濃度混合，室溫下攪拌反應(yīng)3~6小時(shí)，將藥物分子連接到納米探針的表面； (3-7)15000 rpm離心30~50分鐘，收集上清液，并將沉淀物重新溶于PBS中，制成靶向 GPC-3的熒光納米藥物GC-QDs-Drug。
[0010] 其中，所述步驟（3-1)中納米探針GC-QDs的制備步驟參照前面所述。
[0011] 本發(fā)明還提供一種上述的納米藥物的應(yīng)用，包括納米藥物體外藥物控制釋放曲線 的測定、納米藥物對體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞HepG2生長抑制率的測定、納米藥物促進(jìn)肝癌細(xì) 胞H印G2凋亡的體外測試實(shí)驗(yàn)、納米藥物對肝癌細(xì)胞的標(biāo)記。
[0012] 本發(fā)明的上述技術(shù)方案的有益效果如下： 1.本發(fā)明通過簡單可行的方法將天然產(chǎn)物單體負(fù)載到納米探針的表面，相比于常用 的口服自微乳、固體脂質(zhì)納米粒等幾種劑型，該微納結(jié)構(gòu)的納米藥物更有利于藥物的釋放， 提高藥物利用率，并且表面修飾之后，納米探針的熒光特性沒有影響。
[0013] 2.本發(fā)明所制備的熒光納米藥物具有較高的載藥率（20. 31±6. 76%)和包封率 (82. 85± 10. 33%)，且體外藥物釋放呈現(xiàn)pH敏感性，相比于pH7. 4的環(huán)境，在pH6. 0的酸性 介質(zhì)中，納米藥物具有更快的藥物釋放速度和藥物釋放率，這一特性減少了納米藥物在體 循環(huán)中的藥物釋放量和毒副作用，同時(shí)有利于在腫瘤部位的被動(dòng)靶向作用。
[0014] 3.本發(fā)明所制備的靶向熒光納米藥物可對肝癌細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記和成像，通過 對癌細(xì)胞的標(biāo)記、示蹤和治療的一體化動(dòng)態(tài)監(jiān)測，發(fā)展基于新型標(biāo)志物GPC-3標(biāo)記和成像 指導(dǎo)下肝癌的準(zhǔn)確治療。
【附圖說明】
[0015] 圖1是本發(fā)明的熒光納米藥物在不同pH值的介質(zhì)中，對雷公藤紅素分子的體外藥 物釋放曲線； 圖2是本發(fā)明中肝癌細(xì)胞經(jīng)過納米藥物干預(yù)之后產(chǎn)生明顯凋亡的DAPI染色結(jié)果； 圖3是本發(fā)明的納米探針及熒光納米藥物對肝癌細(xì)胞的體外熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 為了便于理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但本發(fā)