明 的保護范圍并不限于以下具體的實施例。
[0017] 除非另有定義，下文中所使用的所有專業(yè)術(shù)語與本領域技術(shù)人員通常理解的含義 相同，本發(fā)明所使用的專業(yè)術(shù)語只是為了描述具體實施例的目的，并不是旨在限制本發(fā)明 的保護范圍。
[0018] 除非另有特殊說明，本發(fā)明中所用到的各種原材料、試劑、儀器和設備等均可通過 市場購買得到或課通過現(xiàn)有方法制備得到。
[0019] 實施例1 : 一種納米探針的制備方法，所述納米探針以ZnS為殼層的核殼結(jié)構(gòu)的熒光量子點為載 體，通過表面修飾單抗GC-33制備得到，其制備步驟如下： (101-1)制備以ZnS為殼層的核殼結(jié)構(gòu)量子點； 其中，以ZnS為殼層的核殼結(jié)構(gòu)量子點為ZnO/ZnS，其制備方法包括如下步驟： (101-1-1)將3. 5g乙酸鋅和0. 4g乙酸鈉加入到裝有200mL乙醇的圓底燒瓶中； (101-1-2)加熱溶解后，迅速加入I. 0 mol/1的氧化鈉乙醇溶液19. 5 mL，反應30分鐘， 冷卻至室溫； (101-1-3)在溶液中以1滴/秒的滴速滴加過量乙酸乙酯至有沉淀產(chǎn)生，離心分離出沉 淀物，用乙酸乙酯洗滌3~5次，然后把沉淀物重新分散在乙醇中，制得ZnO納米顆粒； (101-1-4)向ZnO納米顆粒的懸浮液中依次滴加0. 2 mol/1的乙酸鋅3. 5 ml和等體積 的0. 2 mol/1的硫代乙酰胺的乙醇溶液，滴速保持1滴/秒，滴加完成后加熱； (101-1-5 )按照S-Zn-S-Zn逐層對其進行ZnS殼層包覆，形成ZnO/ZnS量子點，反應5小 時后終止，再次使用乙酸乙醋沉淀出不同粒徑的ZnO/ZnS核殼納米顆粒，離心分離出ZnO/ ZnS核殼結(jié)構(gòu)量子點。
[0020] (101-2)取5. 0 ml的以ZnS為殼層的核殼結(jié)構(gòu)量子點溶液超生分散，15000 rpm 轉(zhuǎn)離心30 min，加超純水0.5 ml，備用； (101-3)取IOmg的碳化二亞胺，2 mg N-羥基硫代琥珀酰亞胺加水I. 0 ml溶解； (101-4)取上述溶液0. 5 ml加入以ZnS為殼層的核殼結(jié)構(gòu)量子點溶液中，定容至I. 0 ml，37°C搖床反應1~2小時； (101-5) 15000 rpm高速離心30分鐘，棄上清，用pH 8. 5的PBS溶液250 μ 1重新溶 解； (101-6)加5 μ 1的靶向GPC-3的單抗GC-33溶液，37°C的恒溫下，搖床反應2小時， 將單抗GC-33修飾到以ZnS為殼層的核殼結(jié)構(gòu)量子點的表面； (101-7) 15000 rpm離心30分鐘，溶于pH 7. 2的PBS溶液中，分離提純得到靶向腫瘤 標志物GPC-3的熒光納米探針。
[0021] 實施例2: 一種基于天然產(chǎn)物單體和納米探針的納米藥物的制備方法，通過酰胺化反應，將天然 產(chǎn)物單體與氨基化PEG連接成藥物分子-PEG的聚合物，然后通過相轉(zhuǎn)移的方法將該聚合物 連接到量子點表面，進而形成具有靶向性的熒光納米藥物。
[0022] 其中，本發(fā)明中的天然產(chǎn)物單體選用具備藥效作用的天然活性單體，優(yōu)選分子結(jié) 構(gòu)帶羧基且為非活性基團的天然活性單體，本實施例中以雷公藤紅素為藥物分子為例，進 一步描述納米藥物的制備方法。
[0023] 具體步驟如下： (102-1)按實施例1制備納米探針GC-QDs ; (102-2)取雷公藤紅素配置成2. Omg/ml的藥物溶液，備用； (102-3)取IOmg的碳化二亞胺EDC、2 mg N-羥基硫代琥珀酰亞胺NHSS加水1.0 ml溶 解； (102-4)取步驟（102-3)所制溶液0. 5 ml，加入到0. 5ml按步驟（102-2)配置的藥物溶 液中，定容至I. 0 ml，37°C搖床反應1小時； (102-5 )向上述混合溶液中以2滴/秒滴加2mg/ml的氨基化PEG溶液Iml，然后在37 °C 的恒溫下混合反應2小時，制備成藥物分子-PEG的聚合物，純化后用PBS重新溶解，備用； (102-6)將藥物分子-PEG的聚合物溶液與步驟（102-1)配置的納米探針GC-QDs溶液 按照等質(zhì)量濃度混合，室溫下攪拌反應4小時，將藥物分子連接到納米探針的表面； (102-7) 15000 rpm離心30分鐘，收集上清液，并將沉淀物重新溶于PBS中，制成靶向 GPC-3的熒光納米藥物GC-QDs-Drug。
[0024] 上述制備的納米藥物的應用，包括納米藥物體外藥物控制釋放曲線的測定、納米 藥物對體外培養(yǎng)的肝癌細胞H印G2生長抑制率的測定、納米藥物促進肝癌細胞H印G2凋亡 的體外測試實驗、納米藥物對肝癌細胞的標記。
[0025] (-）納米藥物體外藥物控制釋放曲線的測定，步驟如下： (103-1)將制備的熒光納米藥物溶解于5 mL的PBS緩沖溶液中，并轉(zhuǎn)移至透析袋中； (103-2)將透析袋置于盛有95 mL、pH 7. 4緩沖溶液中，在37°C恒溫水浴中100 rpm勻 速攪拌緩沖液； (103-3)分別于0、2、4、6、8、10、12、16、20、24 h定時取樣0. 2 mL，同時補進同體積的相 應緩沖溶液； (103-4)所得到的不同時間點的樣品用高效液相法檢測雷公藤紅素的濃度；色譜條件 為：色譜柱：Dikma Technologies C18(250 mm X4. 6 mm, 5 μm)，流動相為甲醇：10 mL/L 醋酸溶液（87 :13);檢測波長：425 nm ;柱溫：25 °C ;流速：1. 0 mL/min ;進樣量：20 yL ; (103-5)計算不同時間點時納米藥物GC-QDs-Drug釋放的雷公藤紅素的量，再計算累 積釋放量并繪制體外釋放曲線；以累積釋放量和時間擬合方程，設CSL-CdTe中雷公藤紅素 CSL的質(zhì)量為Mdrug，釋放緩沖溶液PBS的體積為V。（即100 mL)，PBS的置換體積為Vs (即 0. 2 mL)，第i時刻取出的樣品中藥物濃度為C1，用下面的公式計算雷公藤紅素的累積釋放 量：
[0026] (103-6)相同步驟下測量緩沖液pH 6.0的媒介環(huán)境中，納米藥物對藥物分子的藥 物釋放曲線； (103-7)附圖1是在pH 6. 0和pH 7. 4條件下藥物累積釋放百分率隨時間變化曲線。
[0027] 由曲線可知：所制備的納米藥物中藥物分子的釋放在開始階段時具有較快的釋放 速率，之后釋放速度趨于平緩。并且藥物分子的釋放率與所處的pH環(huán)境具有相關(guān)性，呈現(xiàn) 明顯的PH敏感性。結(jié)果顯示，在pH7. 4的釋放介質(zhì)中，經(jīng)過一個較快的藥物釋放階段之后， 釋放速度逐漸趨于緩慢，24小時內(nèi)累積釋放率為30. 9%。而在pH 6.0的酸性環(huán)境中，前8 h 之內(nèi)藥物分子均具有較快的藥物釋放速度和藥物釋放率，8 h的藥物釋放率為56. 4%，24小 時內(nèi)累積釋放率達到86. 5%。
[0028] (二）納米藥物對體外培養(yǎng)的肝癌細胞HepG2生長抑制率的測定，步驟如下： (104-1)胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的肝癌細胞!fepG2,制成密度為I X IO5個/mL 單細胞懸液，接種于96孔板中； (104-2)細胞處于37 °C，含有5% CO2的濕潤培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后更換新鮮培養(yǎng) 液，用濃度分別為 〇· 0625 μ g/mL、0. 125 μ g/mL、0. 25 μ g/mL、0. 50 μ g/mL、L 00 μ g/mL、2. 00 μ g/mL的雷公藤紅素溶液干預肝癌細胞，作為陰性對照組；以相當于雷公藤紅素濃度的納 米藥物GC-QDs-Drug干預肝癌細胞H印G2并作為陽性組；并設立空白對照組； (104-3)細胞在培養(yǎng)箱中繼續(xù)分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，每個濃度點設三個復孔； (104-4)培養(yǎng)時間終止后每孔加入5 mg/mL的噻唑藍（MTT)溶液20 PL繼續(xù)培養(yǎng)4 h ; (104-5)吸去上清液，每孔加