專利名稱：對癌特異的基因和采用該基因的診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對癌特異的基因和采用該基因制備的試劑盒，還涉及應(yīng)用該基因的方法。
背景技術(shù)：
癌癥的早期發(fā)現(xiàn)，是癌癥對策最重要的課題。特別是發(fā)生在大腸上部的癌癥，由于很少有自覺癥狀，發(fā)現(xiàn)時(shí)病情正在發(fā)展，危險(xiǎn)性較高，因而早期發(fā)現(xiàn)尤為重要。
對于大腸癌，一直采用的方法是通過便潛血反應(yīng)進(jìn)行篩選，用CEA或CA19-9等血清標(biāo)記進(jìn)行診斷，同時(shí)在治療過程中進(jìn)行診斷。但是這些方法都是在進(jìn)行性癌癥中陽性率高的診斷方法，而在早期癌癥中的陽性率極低，因而難于正確診斷。
另一方面，已經(jīng)提出了用癌組織特異性蛋白質(zhì)標(biāo)記的分子生物學(xué)診斷方法，這種方法有可能既簡便又確切地早期診斷惡性腫瘤。這種方法不需要大型設(shè)備，被檢測對象的負(fù)擔(dān)較少，因而可以廣泛地對多數(shù)沒有自覺癥狀的對象進(jìn)行檢驗(yàn)。例如在日本特開平7-51065號公報(bào)中，公開了利用糖蛋白39作為腫瘤標(biāo)記物的方法。
同時(shí)，在國際上公布的第2004/018679號單行本中，記述了有關(guān)采用CENP-A(著絲粒蛋白A)制備癌診斷試劑盒的技術(shù)。
然而，單靠上述專利文獻(xiàn)1中記述的技術(shù)，還不能完全確診癌的表達(dá)，仍存有課題，必須采用多種手段才能作出更確切的判斷。
本發(fā)明以提供新的與癌癥表達(dá)有關(guān)的基因的進(jìn)一步鑒定，并采用該基因的診斷試劑盒為目的。
發(fā)明的公開根據(jù)以上情況，本發(fā)明采取了以下具體手段。
首先第一種手段是下述(a)至(c)所述之任何一種多核苷酸。
(a)由序列編號1所述的堿基序列或與該堿基序列互補(bǔ)的堿基序列組成的多核苷酸、(b)由相似性與序列編號1所述的堿基序列或其互補(bǔ)序列至少在70％以上的堿基序列組成的多核苷酸、(c)編碼由序列編號2所述的氨基酸序列或該該氨基酸序列中一個(gè)至數(shù)個(gè)氨基酸發(fā)生了缺失、置換或添加的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
在采用這一手段時(shí)，應(yīng)該使用檢測癌癥的標(biāo)記。為了確認(rèn)這一手段中多核苷酸會在癌組織中高度表達(dá)，可以主要靠使用標(biāo)記來診斷癌癥。而且與序列編號1所述的堿基序列的相似性應(yīng)該在70％以上，較好的應(yīng)在80％，最好的應(yīng)在90％以上。
第二種手段是含有第一種手段中的多核苷酸的核酸分子。
第三種手段是采用了對第一種手段中的多核苷酸特異的因子的癌癥診斷試劑盒。本說明書中所謂“特異的基因”，是指對多核苷酸的親和性比對無關(guān)的(特別是相似性低于30％的)多核苷酸的親和性明顯要高的基因。
親和性可以借助諸如雜交檢測、結(jié)合性檢測等來測定。
同時(shí)，在這種手段中，特異性因子是包括核酸分子、多肽、脂類、糖鏈、有機(jī)低分子，以及由它們組成的復(fù)合分子在內(nèi)的一群物質(zhì)中至少任何一種。上述癌癥診斷試劑盒診斷的癌癥，最好是直腸癌或結(jié)腸癌。
第四種手段是序列編號3所述堿基序列組成之引物。
第五種手段是序列編號4所述堿基序列組成之引物。
第六種手段是序列編號3所述堿基序列組成之引物和序列編號4所述堿基序列組成之引物組成的引物對。
第七種手段是包括求出分別從兩種細(xì)胞取得的樣品中的由序列編號2所述氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)表達(dá)量，以及計(jì)算出表達(dá)量之比等兩個(gè)步驟的方法。此時(shí)一種樣品采自非癌組織，另一種樣品采自疑似癌組織，當(dāng)兩者的表達(dá)量不同時(shí)，可以判定高危的可疑癌癥患者。
在此過程中，還應(yīng)該包括采用蛋白質(zhì)印跡法求得蛋白質(zhì)表達(dá)量的步驟，取樣的兩種細(xì)胞中(其中之一是取自非癌組織中的細(xì)胞，另一種是取自癌組織中)計(jì)算出的表達(dá)量之比是否在1.7以上的判定步驟。
通過以上手段，可以提供一種新的與癌癥表達(dá)有關(guān)的基因的進(jìn)一步鑒定，以及采用了該基因的診斷試劑盒。


圖1是表示對CENP-H進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果的圖。
圖2是表示對hMis12進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果的圖。
圖3是表示用抗人CENP-H多克隆抗體對直腸癌組織及與其鄰接的非直腸癌組織切面進(jìn)行染色的結(jié)果的圖。
圖4是表示用RT-PCR和實(shí)時(shí)定量PCR分別檢測直腸癌組織和正常組織表面的CENP-H的mRNA含量的結(jié)果的圖。
圖5是表示用RT-PCR和實(shí)時(shí)定量PCR分別檢測直腸癌組織和正常組織表面的CENP-H的mRNA含量的結(jié)果的圖。
為實(shí)施發(fā)明的最佳方式以下就本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例加以詳細(xì)說明。
(組織的取樣)用外科方法取得15名早期結(jié)腸直腸癌患者的身體組織。分別采集癌的組織(以下簡稱“癌組織”)和距離癌組織5～10厘米部分的組織(以下簡稱“非癌組織”)。需要說明的是，將采集的組織立即浸入液氮中，-80℃冷凍保存。
(蛋白質(zhì)的提取)然后向冷凍保存的組織中加入裂解緩沖液[lysis buffer，(7M urea、2M thiourea、2％3-[(3-cholamidopropyl)Dimethylammonio]-1-Propane-sulfonate、0.1M DTT、2％IPG buffer(AmershamPharmacia Biotech公司出品)、40mM Tris)，用Polytron勻漿器(Kinematica公司出品)裂解，4℃下10000×g離心分離1小時(shí)后，取上清液，提取出蛋白質(zhì)。
(免疫印跡)蛋白質(zhì)在槽式轉(zhuǎn)錄裝置(Bio-Rad公司出品)中轉(zhuǎn)錄到聚偏二氟乙烯膜上，該膜先用含5％脫脂牛奶的由磷酸鹽緩沖液(PBS)中封閉，然后將分別在封閉緩沖液中以1∶5000稀釋的兔抗CENP-H、以1∶100稀釋的兔抗hMis12、以1∶500稀釋的羊抗β肌動(dòng)蛋白抗體作為一次抗體、將分別在封閉緩沖液中以1∶3000稀釋的羊抗兔IgG HRP、以1∶500稀釋的兔抗羊IgG HRP作為二次抗體。
另外，用強(qiáng)化化學(xué)發(fā)光檢測試劑(Amersham Pharmacia Biotech公司出品)檢測抗原膜上的抗體。并且，各條帶的強(qiáng)度通過NIH圖像進(jìn)行測定。
(PCR及實(shí)時(shí)定量PCR)用Rneasy Mini試劑盒(Qiagen公司出品)分別由癌組織和非癌組織中抽提總RNA。并且，以適用于RT-PCR的第一鏈cDNA合成試劑盒(1stStrand cDNA synthesis kit for RT-PCR，Roche公司出品)分別由總RNA合成cDNA。
然后，通過上述合成獲得的各自的cDNA作為模板，用PCR擴(kuò)增CEMP-H的cDNA。需要說明的是，使用PCR時(shí)，將含有序列編號3所述堿基序列的引物作為正向引物，將含有序列編號4所述堿基序列的引物作為反向引物，用GAPDH的cDNA或β肌動(dòng)蛋白作為對照進(jìn)行擴(kuò)增。
然后，在LightCycler毛細(xì)管中進(jìn)行CENP-H的cDNA的實(shí)時(shí)定量PCR。在此反應(yīng)中，PCR反應(yīng)混合液采用LightCycler DNA Master SYBRGreen I(快速啟動(dòng)Taq DNA聚合酶、dNTP、緩沖液、SYBR Green I)，向其中加入3.0mM MgCl2、序列編號3所述引物和序列編號4所述引物各0.5μM，總體積2.0μl。
然后用LightCycler軟件3.3(Roche公司出品)進(jìn)行分析。
(免疫組織染色法)冷凍的組織切片在載波片上干燥后，于4℃的丙酮中固定。然后，用PBS洗滌3次后，在封閉緩沖液(10％牛胎血清/PBS)中封閉1小時(shí)。
樣品采用以1∶2000稀釋的兔抗CENP-H抗體和以1∶1000稀釋的抗人CENP-A的單克隆抗體，或其二者之一，在3％的牛血清白蛋白/PBS中保溫1小時(shí)。用PBS洗滌后，將樣品與1∶1000稀釋的結(jié)合了AlexaFluorTM488或594的羊抗兔抗鼠IgG二次抗體(Molecular Probes公司出品)和/或結(jié)合了Alexa FluorTM594的羊抗鼠IgG二次抗體一起保溫1小時(shí)。
用DAPI III對比染色劑(Vysis公司出品)對DNA進(jìn)行對比染色。用熒光顯微鏡(Leica QFISH公司出品)觀察樣品。需要說明的是，為了進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，將組織切片在蘇木精中染色30分鐘，用100％的乙醇和二甲苯干燥，用Permount(一種封埋膠)將其封固。
(結(jié)果)圖1中表示用蛋白印跡法獲得的結(jié)果。如圖1所示，在15個(gè)病例中，在癌組織中都表達(dá)出非常多量的CENP-H。特別是在非癌組織和癌組織中的CENP-H的表達(dá)量之比為1.7～9.6，在癌組織和非癌組織中可見到很大的差異。另一方面，當(dāng)為著絲粒蛋白hMis12時(shí)，則在癌組織和非癌組織中則未能見到特別的差異(參考圖2，圖中病例編號與圖1中病例的組織編號相同。)然后，為了確定CENP-H不是在間質(zhì)細(xì)胞，而是在癌細(xì)胞中表達(dá)的，對大腸直腸癌組織和與其鄰接的非癌部位的組織的切面用抗人CENP-H多克隆抗體進(jìn)行染色。圖3中表示了其結(jié)果。需要說明的是，圖3(a)顯示癌癥部位的HE染色圖像、圖3(b) (c) (d)顯示癌癥部位CENP-H抗體免疫染色圖像、圖3(e)顯示非癌癥部位的HE染色圖像、圖3(f)顯示非癌癥部位CENP-H染色圖像。
這些結(jié)果，肯定了CENP-H、CENP-A或CENP-C等著絲粒蛋白一樣，與著絲粒保持一致，在細(xì)胞核的中心部位，呈較小的斑點(diǎn)狀存在。確認(rèn)了CENP-H在癌部分比起非癌組織(圖3(f))中，在數(shù)量和大小上有所增加(參看圖3(c)和(d))。而且還確認(rèn)了，染色后的CENP-H不是在間質(zhì)細(xì)胞中，而是在癌的上皮部位。并且，在各種組織切片中進(jìn)行了本實(shí)驗(yàn)，都表現(xiàn)同樣的結(jié)果。
根據(jù)以上結(jié)果，可以肯定CENP-H是在癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
其次，為了確認(rèn)CENP-H的過量表達(dá)是由于轉(zhuǎn)錄增加引起的結(jié)果，用RT-PCR和實(shí)時(shí)定量PCR對大腸直腸癌組織中的CENP-H的mRNA含量和非癌組織中CENP-H的mRNA含量的進(jìn)行了分析。圖4和圖5表示了分析結(jié)果。
如圖4所示，得知癌組織中CENP-H的mRNA的表達(dá)水平比非癌部位組織的增加得非常多。而且，得知CENP-H的mRNA表達(dá)水平，和圖1所示的非癌組織與癌組織的CENP-H表達(dá)量之比呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性。而用作對照的GAPDH中已經(jīng)確認(rèn)，癌組織和非癌組織中未見差異。
圖5是將圖4所示的mRNA表達(dá)水平在非癌組織和癌組織之間進(jìn)行比較用Stat View軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析求出的結(jié)果。由圖5可見，癌組織(Cancer)是非癌組織(Normal)表達(dá)量的約5倍。據(jù)此得知通過檢測CENP-H的表達(dá)可以肯定癌的存在。
產(chǎn)業(yè)上應(yīng)用可能性通過以上所述之本發(fā)明，可以鑒定新的與癌癥表達(dá)有關(guān)的基因，而且能夠采用該基因提供出診斷試劑盒。
序列表<110>國立大學(xué)法人千葉大學(xué)(Chiba University)<120>對癌特異的基因和采用該基因的診斷試劑盒(A gene in a cancer and a diagnostic kit using the same)<160>4<210>1<211>744<212>DNA<213>Homo sapiensatggaggagc agccccagat gcaagacgcc gacgagcccg cggactccgg aggggaaggc60cgggcaggcg ggccaccgca ggtcgccggc gcccaggcgg cgtgcagcga ggaccgcatg120accctgctcc tcaggctgag agcacagaca aaacaacaac tcttagaata taaatcaatg180gttgatgcaa gtgaagaaaa aactccagaa caaattatgc aagaaaagca aatcgaagct240aaaattgaag acctggaaaa tgaaattgaa gaggtaaaag ttgcttttga gataaaaaag300cttgcattag acaggatgag actttcaact gcacttaaaa aaaacctgga gaaaattagc360agacagtcta gtgtgctcat ggataacatg aaacacctat tagagctaaa taaattaata420atgaaatcac agcaggaatc ttgggattta gaggaaaaac tgcttgatat tagaaagaag480agattgcaat taaaacaagc ttcagaaagt aagcttttag aaatacagac tgaaaagaac540aaacagaaga ttgatttgga cagtatggaa aactcagaga ggataaagat catacgacaa600aacctacaga tggagataaa aattactact gttattcaac atgtgttcca gaaccttatt660ttggggagta aagtcaattg ggcagaggat cctgccctta aggaaattgt tctgcagctt720gagaagaata ttgacatgat gtaa 744<210>2<211>247<212>PRT<213>Homo sapiens<400>
Met Glu Glu Gln Pro Gln Met Gln Asp Ala Asp Glu Pro Ala Asp Ser1 5 10 15Gly Gly Glu Gly Arg Ala Gly Gly Pro Pro Gln Val Ala Gly Ala Gln20 25 30Ala Ala Cys Ser Glu Asp Arg Met Thr Leu Leu Leu Arg Leu Arg Ala35 4045Gln Thr Lys Gln Gln Leu Leu Glu Tyr Lys Ser Met Val Asp Ala Ser50 55 60
Glu Glu Lys Thr Pro Glu Gln Ile Met Gln Glu Lys Gln Ile Glu Ala65 70 75 80Lys Ile Glu Asp Leu Glu Asn Glu Ile Glu Glu Val Lys Val Ala Phe85 9095Glu Ile Lys Lys Leu Ala Leu Asp Arg Met Arg Leu Ser Thr Ala Leu100 105 110Lys Lys Asn Leu Glu Lys Ile Ser Arg Gln Ser Ser Val Leu Met Asp115 120125Asn Met Lys His Leu Leu Glu Leu Asn Lys Leu Ile Met Lys Ser Gln130 135140Gln Glu Ser Trp Asp Leu Glu Glu Lys Leu Leu Asp Ile Arg Lys Lys145 150155 160Arg Leu Gln Leu Lys Gln Ala Ser Glu Ser Lys Leu Leu Glu Ile Gln165 170175Thr Glu Lys Asn Lys Gln Lys Ile Asp Leu Asp Ser Met Glu Asn Ser180 185190Glu Arg Ile Lys Ile Ile Arg Gln Asn Leu Gln Met Glu Ile Lys Ile195 200205Thr Thr Val Ile Gln His Val Phe Gln Asn Leu Ile Leu Gly Ser Lys210 215220Val Asn Trp Ala Glu Asp Pro Ala Leu Lys Glu Ile Val Leu Gln Leu225 230 235 240Glu Lys Asn Val Asp Met Met245<210>1<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens<400>cagtctagtg tgctcatgga t 21<210>1<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens<400>tccatctgta ggttttgtcg20
權(quán)利要求
1.下述(a)至(c)中任何一項(xiàng)所述的多核苷酸(a)由序列編號1所述的堿基序列或其互補(bǔ)序列組成的多核苷酸；(b)由相似性與序列編號1所述的堿基序列或其互補(bǔ)序列至少在70％以上的堿基序列組成的多核苷酸；(c)編碼由序列編號2所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸發(fā)生了缺失、置換或添加的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
2.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，為用于癌癥檢測的標(biāo)記。
3.一種核酸分子，包含如權(quán)利要求1所述的多核苷酸。
4.一種癌癥診斷試劑盒，采用與權(quán)利要求1所述的多核苷酸有特異性的因子。
5.如權(quán)利要求5所述的癌癥診斷試劑盒，其中所述特異性因子是由核酸分子、多肽、脂類、糖鏈、有機(jī)低分子，以及它們的復(fù)合分子組成的組中的至少任何一種。
6.如權(quán)利要求5所述的癌癥診斷試劑盒，所述癌癥診斷試劑盒所診斷的癌癥是直腸癌或結(jié)腸癌。
7.由序列編號3所述的堿基序列組成的引物。
8.由序列編號4所述的堿基序列組成的引物。
9.引物對，由權(quán)利要求7所述的引物和權(quán)利要求8所述的引物組成。
10.一種方法，包括如下步驟分別求出所采集的兩種細(xì)胞中由序列編號2所述的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)表達(dá)量以及計(jì)算出所求得的表達(dá)量之比。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征是所述求出蛋白質(zhì)表達(dá)量的步驟采用蛋白質(zhì)印跡法。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，所述采集的兩種細(xì)胞中，其中之一是非癌組織中的細(xì)胞。
13.如權(quán)利要求10所述的方法，所述采集的兩種細(xì)胞中，其中之一是癌組織中的細(xì)胞。
14.如權(quán)利要求10所述的方法，包括判定所述計(jì)算出的表達(dá)量之比是否在1.7以上的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供一種新的與癌癥表達(dá)有關(guān)的基因的進(jìn)一步鑒定，以及采用了該基因的診斷試劑盒。
文檔編號C12N15/09GK101090965SQ200680001350
公開日2007年12月19日 申請日期2006年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月5日
發(fā)明者島田英昭, 朝長毅, 松下一之, 落合武德, 野村文夫 申請人:國立大學(xué)法人千葉大學(xué)