用于肝癌診斷及預(yù)后評估的基因群及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一組基于二代測序技術(shù)的用于肝癌診斷及預(yù)后評估的基因群，以及針對該組基因群設(shè)計的用于肝癌診斷及預(yù)后評估的基因檢測試劑盒。根據(jù)已知數(shù)據(jù)庫建立26個中國肝癌患者熱點基因突變組合，對肝癌病人循環(huán)腫瘤DNA進行到高效靶向富集，可用于指導(dǎo)肝癌病人的預(yù)后及療效的監(jiān)控。本發(fā)明試劑盒具有檢測通量高、靈敏度高、特異性高的特性，靈敏度可以達到0.02％，樣本的DNA量可以低至10ng。
【專利說明】
用于肝癌診斷及預(yù)后評估的基因群及試劑盒 (一)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一組基于二代測序技術(shù)的用于肝癌診斷及預(yù)后評估的基因群，以及針 對該組基因群設(shè)計的用于肝癌診斷及預(yù)后評估的基因檢測試劑盒。 (二)
【背景技術(shù)】
[0002] 原發(fā)性肝細胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC，簡稱肝癌)是惡性程度最高 的腫瘤之一，其發(fā)病率居全球腫瘤的第6位，病死率居第3位。以手術(shù)為主的綜合治療模式對 肝癌的治療取得了顯著成效，但由于肝癌病人經(jīng)常發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期且伴有不同程度的 肝硬化，手術(shù)切除率低，復(fù)發(fā)率高，預(yù)后差。目前蛋白質(zhì)類血清標志物篩查及影像學(xué)診斷是 檢測肝癌患者術(shù)后或化療后殘瘤，復(fù)發(fā)，轉(zhuǎn)移病灶的主要手段，但二者均存在靈敏度及特異 性不足等問題。尤其蛋白質(zhì)類血清標志物的靈敏度和特異性較差，在血中的半衰期較長，其 濃度水平與病變程度相關(guān)性較差等。
[0003] 游離循環(huán)核酸(Cell Free nucleic acids，cfDNA)是指存在血衆(zhòng)或血清、腦脊液 等細胞外游離狀態(tài)的核酸片段，約160-180bp，是細胞DNA在生理或病理條件下降解的產(chǎn)物。 目前研究表明腫瘤病人外周血中存在的cfDNA顯著高于健康人群，并且這些cfDNA攜帶有腫 瘤患者的基因信息(包括腫瘤基因的異常突變，甲基化和異常拷貝數(shù)等），稱之為循環(huán)腫瘤 DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)。其主要來源于壞死的腫瘤細胞，循環(huán)腫瘤細胞，凋亡 的腫瘤細胞及來自于腫瘤細胞的外分泌小體，在cfDNA中的占比低，約占整個cfDNA的1 %， 甚至只有0.01%。已有多篇文獻證明ctDNA與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著密切的關(guān)系，是目 前最具發(fā)展?jié)摿Φ哪[瘤無創(chuàng)診斷和實時療效監(jiān)測手段，可用于腫瘤早期診斷、發(fā)展過程監(jiān) 測、預(yù)后判斷、以及個性化用藥指導(dǎo)等方面。相對于常規(guī)的蛋白類診斷標志物及血液中的循 環(huán)腫瘤細胞，檢測ctDNA具有更高的靈敏度和特異性，更適合成為癌癥的生物學(xué)指標。香港 中文大學(xué)Peiyong Jiang應(yīng)用全基因測序研究血楽;中ctDNA的大小分布，發(fā)現(xiàn)肝癌病人的血 衆(zhòng)中存在兩種不同長度的DNA分子：短鏈DNA分子（<150bp)和長鏈DNA分子(>180bp);短鏈 DNA分子與ctDNA突變率及拷貝數(shù)異常相關(guān)，且與ctDNA濃度正相關(guān);長鏈DNA分子不攜帶腫 瘤相關(guān)ctDNA特征，且與ctDNA濃度負相關(guān)，顯示對肝癌中的ctDNA進行定量和定性分析，對 肝癌的診斷具有較高的靈敏性和特異性，可作為肝癌有效的分子診斷工具。Atsushi Ono利 用二代測序和PCR技術(shù)回顧性地檢測46例肝癌患者血清，在其中7例病人血清檢出了ctDNA， 研究顯示ctDNA陽性的肝癌患者的預(yù)后顯著差于陰性患者;ctDNA的濃度可真實地反映腫瘤 的進程，很好地預(yù)測病人復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。暗示肝癌病人血液中的ctDNA可作為生物標志物用于預(yù) 后，監(jiān)測肝癌的發(fā)生發(fā)展。 (三)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是提供一組基于二代測序技術(shù)的用于肝癌診斷及預(yù)后評估的基因群， 以及針對該組基因群設(shè)計的用于肝癌診斷及預(yù)后評估的基因檢測試劑盒。
[0005] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0006] 用于肝癌診斷及預(yù)后評估的基因群，由以下26個基因片段組成：
[0007] 表1:26個基因片段
[0010] 發(fā)明人通過定制了 26個癌癥基因的肝癌易感位點的測序引物分析了原發(fā)性肝細 胞癌病人的癌旁組織，腫瘤組織，癌栓或轉(zhuǎn)移瘤，及配對的術(shù)前血漿和術(shù)后血漿樣本中 ctDNA，表明肝癌病人血液ctDNA中的這些基因可以真實地反應(yīng)患者腫瘤組織及轉(zhuǎn)移瘤中的 基因信息，及經(jīng)手術(shù)治療后對腫瘤負荷的反饋，可用于肝癌的預(yù)后評估及療效監(jiān)測等。
[0011] 本發(fā)明還涉及一種用于肝癌診斷及預(yù)后評估的試劑盒，主要包括PCR反應(yīng)試劑(可 直接采用Master Mix成品）和特異性PCR擴增引物，其特征在于特異性PCR擴增引物如下表 所示：
[0012] 表2:26個基因片段對應(yīng)的引物

[0015] 本發(fā)明根據(jù)已知數(shù)據(jù)庫建立包含26個癌癥相關(guān)基因的熱點基因突變組合，對肝癌 病人循環(huán)腫瘤DNA進行到高效靶向富集，使用二代測序平臺對靶向測序文庫進行靶向測序， 經(jīng)過分析得到靶向區(qū)域的DNA序列。這將大大縮小測序通量，在降低測序成本的同時，有效 加深測序深度，發(fā)現(xiàn)一些普通測序難以發(fā)現(xiàn)但對診斷治療有重要意義的低頻突變。該試劑 盒檢測通量高、靈敏度高、特異性強，一次檢測能夠覆蓋26個中國肝癌患者熱點基因突變。
[0016] 本發(fā)明用于測序和文庫構(gòu)建的步驟為:待測DNA樣品采用多重PCR酶進行擴增后構(gòu) 建文庫與陰性樣品、質(zhì)控品一起進行大規(guī)模平行測序(二代測序），儀器獲得的結(jié)果經(jīng)數(shù)據(jù) 處理和生物信息學(xué)分析，得出樣本中含有的SNP位點等信息。
[0017] 待測DNA樣品為人類基因組DNA，包括人類細胞DNA、腫瘤組織基因組DNA、外周血細 胞DNA、體液DNA或排泄物細胞DNA。
[0018] 本發(fā)明引物是針對已知數(shù)據(jù)庫建立26個癌癥相關(guān)基因的中國肝癌患者熱點基因 突變的特定序列進行設(shè)計。引物偏向性擴增的程度低，各引物之間相互干擾性小，特異性 強，擴增效果好。這些引物以混合物形式溶解于一管中，在實驗中同時加入。
[0019] 測序反應(yīng)過程:DNA模板多重PCR反應(yīng)、模板文庫構(gòu)建、上機模板準備和富集反應(yīng)、 上機測序反應(yīng)和測試數(shù)據(jù)處理分析。
[0020] 上機模板準備和富集反應(yīng)過程包括模板油包水?dāng)U增和陽性模板富集，所述兩個過 程中利用標準的建庫流程及富集進行測序。上機反應(yīng)獲得的數(shù)據(jù)結(jié)果通過序列篩選、拼接 和比對等方法以及生物信息學(xué)分析，最終獲得測試樣本的SNP位點信息。
[0021] 所述檢測結(jié)果數(shù)據(jù)處理、生物信息學(xué)分析得出26個癌癥相關(guān)基因的中國肝癌患者 熱點基因突變。
[0022] 測試數(shù)據(jù)處理分析包括測序數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)換、拼接、質(zhì)控和突變位點分析等過程，通過 數(shù)據(jù)的處理最終獲得檢測樣本SNP位點的信息。
[0023] 本發(fā)明還涉及利用所述的試劑盒對肝癌病人基因群進行檢測的方法，所述方法包 括：
[0024] (1)在不同階段(例如術(shù)前，術(shù)后等階段），提取待測病人基因組樣品cfDNA及基因 組 DNA;
[0025] (2)基因組DNA打斷成長度為180~280bp的片段，打斷后的基因組DNA和cfDNA進行 末端修復(fù)，再作為模板DNA，加入所述特異性PCR擴增引物和PCR反應(yīng)試劑，組成PCR反應(yīng)體 系，進行PCR擴增；
[0026] (3)將不同階段獲得的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行數(shù)據(jù)對比，獲得肝癌病人在不同階段的 ctDNA水平變化數(shù)據(jù)。
[0027] 所述PCR擴增反應(yīng)參數(shù)如下：95°C預(yù)變性2~5min;95°C變性10~3(^，50~65°(：退 火10~30s，70~75°C延伸10~20s，10~20個循環(huán)。
[0028] 本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明提供了一組基于二代測序技術(shù)的用于肝癌 診斷及預(yù)后評估的基因群，以及針對該組基因群設(shè)計的用于肝癌診斷及預(yù)后評估的基因檢 測試劑盒，具有檢測通量高、靈敏度高、特異性高的特性，靈敏度可以達到0.02%，樣本的 DNA量可以低至10ng。 (四）
【附圖說明】
[0029]圖1為實施例1肝癌患者術(shù)前、術(shù)后、隨訪血漿中ctDNA含量水平；
[0030]圖2為實施例2肝癌患者術(shù)前、術(shù)后、隨訪血漿中ctDNA含量水平。 (五)
【具體實施方式】
[0031]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此：
[0032]方法步驟：
[0033] (1)血漿提取 cfDNA
[0034] 收集原發(fā)性肝細胞癌病人術(shù)前術(shù)后血漿及隨訪血漿4ml，加入至50ml離心管，后嚴 格按照QIAamp '^Circulating Nucleic Acid提取試劑盒操作聚提取cfDNA。收集原發(fā)性 肝細胞癌病人全血，分離出淋巴細胞，提取基因組DNA。
[0035] (2)測序文庫的構(gòu)建和捕獲(Library Construction)
[0036] 首先將基因組DNA經(jīng)Covaris破碎儀隨機打斷成長度為180~280bp的片段，打斷后 的基因組DNA和cfDNA進行末端修復(fù)再利用本發(fā)明定制的26個中國肝癌患者熱點基因突變 組合引物(參見表2)，進行多重PCR反應(yīng)擴增富集，模板文庫構(gòu)建和上機模板準備，上機測 序。
[0037] PCR反應(yīng)體系組成：Master Mix(Thermo，DreamTaq?Green PCR Master Mix)llyL、 包含所述26對引物的pane 1 5 · 5yL、待測DNA樣品4 · 5yL;
[0038] PCR擴增反應(yīng)參數(shù)如下：95°C預(yù)變性2~5min; 95 °C變性10~30s，50~65 °C退火10 ~30s，70~75°C延伸10~20s，10~20個循環(huán)。
[0039] (3)測序及生物信息學(xué)分析
[0040]使用二代測序平臺對靶向測序文庫進行靶向測序，經(jīng)過分析得到靶向區(qū)域的DNA 序列。以病人淋巴細胞為對照，通過一系列生物信息學(xué)分析，檢測腫瘤分群特異性突變，建 立測定病人腫瘤負荷的指標體系，并使用這些基因突變頻率在病人不同時期血液樣本中的 分布情況評估肝癌病人的預(yù)后情況，指導(dǎo)進一步治療。
[0041 ] 實施例1:
[0042]收集某肝癌患者術(shù)前，術(shù)后及隨訪血漿，提取cfDNA及淋巴細胞提取基因組DNA，并 利用以上所述的測序方法進行檢測。經(jīng)測序后通過使用病人淋巴細胞的基因組序列作為對 照，根據(jù)基因突變在循環(huán)腫瘤DNA與淋巴細胞中分布的差異情況，依據(jù)兩者突變頻率計算血 液樣本中該體細胞突變的突變頻率差值作為反映病人ctDNA含量的指標。結(jié)果顯示其術(shù)后 ctDNA的含量水平顯著下調(diào)，但在隨訪血漿中發(fā)現(xiàn)ctDNA含量水平顯著上升，暗示病人腫瘤 復(fù)發(fā)風(fēng)險提高，經(jīng)過影像學(xué)診斷證明其復(fù)發(fā)(參見圖1)。
[0043] 實施例2:
[0044]收集某肝癌患者術(shù)前，術(shù)后及隨訪血漿，提取cfDNA及淋巴細胞提取基因組DNA，并 利用以上所述的測序方法進行檢測，經(jīng)測序后通過使用病人淋巴細胞的基因組序列作為對 照，根據(jù)基因突變在循環(huán)腫瘤DNA與淋巴細胞中分布的差異情況，依據(jù)兩者突變頻率計算血 液樣本中該體細胞突變的突變頻率差值作為反映病人ctDNA含量的指標。其術(shù)后ctDNA的水 平顯著下調(diào)，但在隨訪血漿中發(fā)現(xiàn)ctDNA水平與術(shù)后無明顯變化，提示預(yù)后良好，經(jīng)過影像 學(xué)診斷證明其未出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移(參見圖2)。
[0045] 本發(fā)明的重要癌癥相關(guān)基因用于對肝癌病人循環(huán)腫瘤DNA進行靶向富集:根據(jù)已 知數(shù)據(jù)庫建立26個中國肝癌患者熱點基因突變組合，對肝癌病人循環(huán)腫瘤DNA進行到高效 靶向富集，可用于指導(dǎo)肝癌病人的預(yù)后及療效的監(jiān)控。這些基因涵蓋了對中國肝癌患者診 斷治療有重要意義的大部分基因。
[0046] 依據(jù)本發(fā)明的設(shè)計，制備相應(yīng)的PCR引物，并與DNA樣品進多重PCR反應(yīng)、模板文庫 構(gòu)建、上機模板準備和富集反應(yīng)，富集對中國肝癌患者診斷治療有重要意義的基因，這些基 因只占全部分基因組的很小一部分，有效降低測序成本，并提高測序深度，結(jié)果對肝癌患者 的診斷及個性化用藥有很強的參考意義。
【主權(quán)項】
1. 用于肝癌診斷及預(yù)后評估的基因群，由以下26個基因片段組成：〇2. -種用于肝癌診斷及預(yù)后評估的試劑盒，主要包括PCR反應(yīng)試劑和特異性PCR擴增引 物，其特征在于特異性PCR擴增引物如下表所示：3. 利用權(quán)利要求2所述的試劑盒對肝癌病人基因群進行檢測的方法，所述方法包括： (1) 在不同階段，提取待測病人基因組樣品cf DNA及基因組DNA; (2) 基因組DNA打斷成長度為180~280bp的片段，打斷后的基因組DNA和cfDNA進行末端 修復(fù)，再加入所述特異性PCR擴增引物和PCR反應(yīng)試劑，組成PCR反應(yīng)體系，進行PCR擴增； (3) 將不同階段獲得的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行數(shù)據(jù)對比，獲得肝癌病人在不同階段的ctDNA 水平變化數(shù)據(jù)。4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述PCR擴增反應(yīng)參數(shù)如下：95°C預(yù)變性2~ 5min;95°C 變性 10 ~308,50~65°(：退火10~308,70~75°(：延伸10~208，10~20個循環(huán)。
【文檔編號】C12N15/11GK105950750SQ201610403001
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月8日
【發(fā)明人】劉小龍, 劉景豐, 蔡志雄, 陳耕, 董秀清
【申請人】福州市傳染病醫(yī)院