專利名稱：：用于肝癌的預(yù)后和治療的組合物和方法本申請(qǐng)要求2003年8月13日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序號(hào)60/495,081和2003年9月4日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序號(hào)為60/500,844的優(yōu)先權(quán)，以上兩個(gè)臨時(shí)申請(qǐng)的內(nèi)容均通過(guò)引用結(jié)合于本文中。在本申請(qǐng)全文中，引用了不同的出版物。對(duì)這些出版物的全部的引用可在權(quán)利要求書(shū)之前找得。為了更加全面地描述到在此描述的和權(quán)利要求的本發(fā)明的申請(qǐng)日為止的現(xiàn)有技術(shù)的狀況，這些出版物的公開(kāi)在此通過(guò)引用結(jié)合于本申請(qǐng)中。
背景技術(shù)：
：肝細(xì)胞癌(HCC)是常見(jiàn)的致死性惡性腫瘤并且為全球前五位癌癥死亡病因。在美國(guó)、英國(guó)和日本，其發(fā)病率正在上升。在中國(guó)，肝癌是第二大癌癥致死病因。流行病學(xué)研究已經(jīng)顯示乙型和丙型肝炎(B型和C型肝炎)感染、酒精所致的肝損傷以及黃曲霉毒素的攝入與肝癌有著密切的關(guān)聯(lián)。為更加理解臨床病理學(xué)特征，以改善對(duì)HCC患者的臨床處理，已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的研究。然而，常規(guī)的臨床病理學(xué)參數(shù)限制了預(yù)測(cè)能力，并且處于相同疾病階段的患者可能有不同的疾病結(jié)局。微陣列技術(shù)提供了生物學(xué)方法以在無(wú)偏頗的基礎(chǔ)上收集大量的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。由腫瘤基因表達(dá)模式所回顧的分子肖像，已經(jīng)被用于確定不同的癌癥類型包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌和腦瘤的預(yù)后的新的分子標(biāo)準(zhǔn)。使用cDNA微陣列方法，肝癌細(xì)胞系和人樣本的表達(dá)譜已有報(bào)道。甲胎蛋白(AFP)的表達(dá)使HCC細(xì)胞系的分子亞型突顯出來(lái)。已經(jīng)觀察到細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑和新陳代謝相關(guān)基因的反常，且表達(dá)譜與腫瘤分化狀態(tài)相關(guān)。針對(duì)由基因表達(dá)引起的HCC早期復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)的新近研究?jī)H報(bào)道在一小組患者1年內(nèi)的肝內(nèi)復(fù)發(fā)并且使用6000個(gè)基因的基因芯片。在本研究中，在48例HCCs上使用Cox回歸和Kaplan-Meier分析，以鑒定從印記有23000個(gè)克隆的微陣列中的一組26個(gè)的基因。然后此預(yù)后性基因集(prognosticgeneset)還被描繪為包含前排的12個(gè)基因，其預(yù)測(cè)肝切除術(shù)后3年內(nèi)疾病的復(fù)發(fā)和死亡的準(zhǔn)確率分別為97.8％和89.3％。由此產(chǎn)生的基因表達(dá)譜，與基于臨床和組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)相比較，可提供更為準(zhǔn)確的預(yù)后以預(yù)測(cè)疾病的復(fù)發(fā)和死亡。這個(gè)結(jié)果還提供選擇預(yù)后不良的患者以作積極的輔助治療的方法。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供包含下列多核苷酸探針的組合物IL7R(AA485865)、NDRG1(AA486403)、EST1(H50345)、TRPC1(AA017132)、GFRA1(AA512935)、EST2(AA454543)、CLDN10(R54559)、DNALI1(R93087)、RBP5(AA453198)、EST3(AA621761)、EST4(N63706)、PCOLCE(AA670200)、TDO2(T72398)、EST5(T47454)、HIST1H2BD(N33927)、PXMP2(N70714)、ACAS2(AA455146)、ANAPC7(T68445)、EST6(AA576580)、RBP5(N92148)、ANXA1(H63077)、CKB(AA894557)、ITGBL1(N52533)、KPNA2(AA676460)、EST7(W90740)和MEG3(W85841)，或其任何的聯(lián)合。本發(fā)明還提供包括下列多核苷酸探針的組合物IL7R(AA485865)、NDRG1(AA486403)、EST1(H50345)、TRPC1(AA017132)、GFRA1(AA512935)、EST2(AA454543)、CLDN10(R54559)、DNALI1(R93087)、RBP5(AA453198)、EST3(AA621761)、EST4(N63706)和PCOLCE(AA670200)。本發(fā)明提供確定肝細(xì)胞癌(HCC)在罹患HCC的患者中復(fù)發(fā)的可能性的方法，所述方法包括(a)從患者中獲取腫瘤樣本；(b)確定在腫瘤樣本中的一組預(yù)后性基因的基因表達(dá)模式；(c)計(jì)算基因表達(dá)模式的預(yù)后性基因評(píng)分；和(d)將預(yù)后性基因評(píng)分與HCC復(fù)發(fā)相關(guān)的預(yù)后性基因評(píng)分作比較，由此確定在患者中HCC復(fù)發(fā)的可能性。本發(fā)明提供確定肝細(xì)胞癌(HCC)引起受累患者死亡的可能性的方法，所述方法包括(a)從患者中獲取腫瘤樣本；(b)確定在腫瘤樣本中的一組預(yù)后性基因的基因表達(dá)模式(pattern)；(c)計(jì)算基因表達(dá)模式的預(yù)后性基因評(píng)分；和(d)將預(yù)后性基因評(píng)分與HCC相關(guān)死亡相關(guān)的預(yù)后性基因評(píng)分作比較，由此確定患者死亡的可能性。本發(fā)明也提供確定是否給予罹患肝細(xì)胞癌(HCC)的患者輔助治療的方法，所述方法包括(a)從患者中獲取腫瘤樣本；(b)確定在腫瘤樣本中的一組預(yù)后性基因的基因表達(dá)模式；和(c)計(jì)算基因表達(dá)模式的預(yù)后性基因評(píng)分；以及(d)將預(yù)后性基因評(píng)分與HCC復(fù)發(fā)相關(guān)的預(yù)后性基因評(píng)分作比較，由此確定是否給予輔助治療。本發(fā)明還提供確定罹患肝細(xì)胞癌(HCC)的患者預(yù)后的方法，所述方法包括(a)從患者中獲取腫瘤樣本；(b)確定在腫瘤樣本中的CLDN10核酸轉(zhuǎn)錄物的水平；(c)將從步驟(b)所得的CLDN10核酸轉(zhuǎn)錄物的水平與正常組織樣本中的CLDN10核酸轉(zhuǎn)錄物的水平比較，由此，從步驟(b)所得的較高水平的CLDN10核酸轉(zhuǎn)錄物表明預(yù)后不良。本發(fā)明還提供確定罹患肝細(xì)胞癌(HCC)的患者預(yù)后的方法，所述方法包括(a)從患者中獲取腫瘤樣本；(b)確定在腫瘤樣本中的AA454543核酸轉(zhuǎn)錄物的水平；(c)將從步驟(b)所得的AA454543核酸轉(zhuǎn)錄物的水平與正常組織樣本中的AA454543核酸轉(zhuǎn)錄物的水平比較，由此，從步驟(b)所得的較高水平的AA454543核酸轉(zhuǎn)錄物表明預(yù)后不良。本發(fā)明還提供確定罹患肝細(xì)胞癌(HCC)的患者預(yù)后的方法，所述方法包括(a)從患者中獲取腫瘤樣本；(b)確定在腫瘤樣本中的DNALI1核酸轉(zhuǎn)錄物的水平；(c)將從步驟(b)所得的DNALI1核酸轉(zhuǎn)錄物的水平與正常組織樣本中的DNALI1核酸轉(zhuǎn)錄物的水平比較，由此，從步驟(b)所得的較高水平的DNALI1核酸轉(zhuǎn)錄物表明預(yù)后不良。最后，本發(fā)明提供確定在罹患肝細(xì)胞癌(HCC)的患者中HCC復(fù)發(fā)的可能性的方法，所述方法包括(a)從患者中獲取血清樣本；(b)檢測(cè)DNALI1核酸轉(zhuǎn)錄物的存在；和(c)確定步驟(b)的DNALI1核酸轉(zhuǎn)錄物的密碼子65的核苷酸194多態(tài)性的存在，以確定哪個(gè)等位基因存在，由此，T-等位基因的存在表明HCC復(fù)發(fā)的概率較高。圖的簡(jiǎn)述圖1基因表達(dá)和患者預(yù)后。(A)針對(duì)48例HCCs的全局表達(dá)數(shù)據(jù)矩陣。在樣本中有1404個(gè)顯著性表達(dá)差異的cDNA克隆。每一列代表一種腫瘤而每一行代表一種單個(gè)基因?；谟梅旨?jí)聚類算法(hierarchicalclusteringalgorithm)在樣本上測(cè)量的其表達(dá)模式上的相似性將基因聚類。同樣地，基于其在基因表達(dá)模式上的相似性將樣本聚類(clustered)。(B)最佳基因集確定以最大標(biāo)準(zhǔn)效應(yīng)對(duì)所使用的基因的數(shù)量作圖，以納入預(yù)后性基因評(píng)分中。(C)用于48例HCCs的12個(gè)預(yù)后性基因的表達(dá)數(shù)據(jù)矩陣。將基因名稱標(biāo)記在每一行的右邊末尾。所有“好”基因，即相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)低于1并且在與更長(zhǎng)的無(wú)病期相關(guān)的高水平表達(dá)的基因，在上方的面板(upperpanel)上聚類為一個(gè)分支?！皦摹被颍聪鄬?duì)風(fēng)險(xiǎn)大于1并且在與更短的無(wú)病期相關(guān)的高水平表達(dá)的基因，在下方的面板(lowerpanel)上都聚類為另一個(gè)分支。同樣地，HCCs基于其在這些基因表達(dá)水平的相似性上聚類，且分開(kāi)(segregated)為兩個(gè)主要的組群。在圖左邊的HCCs顯示好的基因的向上調(diào)節(jié)和壞的基因的向下調(diào)節(jié)，并且認(rèn)為它們證實(shí)了“良好的預(yù)后標(biāo)記”。在圖右邊的HCCs顯示壞的基因的向上調(diào)節(jié)和好的基因的向下調(diào)節(jié)，并且認(rèn)為它們顯示了“壞的預(yù)后標(biāo)記”。在數(shù)據(jù)矩陣底部的黑盒子顯示復(fù)發(fā)事件。實(shí)線為基因預(yù)后分類線(classifier)，虛線為患者預(yù)后分類線。圖2在獨(dú)立樣本集上的CLDN10基因表達(dá)的驗(yàn)證分析。由定量RT-PCR所產(chǎn)生的CLDN10表達(dá)水平的散點(diǎn)圖。每個(gè)樣本的表達(dá)水平是相對(duì)于樣本集的表達(dá)的中值而言的。CLDN10表達(dá)水平高于中值的患者被標(biāo)識(shí)在圖的上部，伴有大于1的相對(duì)倍數(shù)變化。基因表達(dá)低于中值的患者被標(biāo)識(shí)在圖的下部，伴有小于1的相對(duì)的倍數(shù)變化。圖3基因表達(dá)的預(yù)測(cè)。(A)基于12個(gè)頂端排位基因(top-rankedgenes)的預(yù)后性基因評(píng)分。如同Youden(尤登)指數(shù)所確定的，用于預(yù)測(cè)疾病復(fù)發(fā)和死亡的最優(yōu)的截止值(cut-offvalue)分別是0.416(虛線)和0.600(實(shí)線)。(B)用于預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的接受器工作特征(ROC)曲線。(C)用于預(yù)測(cè)死亡的ROC曲線。圖4將預(yù)后性基因評(píng)分與pTNM系統(tǒng)作比較。依據(jù)在(A)和(C)中的預(yù)后性基因評(píng)分，以及在(B)和(D)中的pTNM分段系統(tǒng)的，用于HCC患者的Kaplan-Meier無(wú)病生存曲線和總體生存曲線。在每個(gè)案例中，用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)(logranktest)計(jì)算p值。圖5Kaplan-Meier無(wú)病生存圖。(A)將所有患者分成低或高封閉蛋白-10(claudin-10)表達(dá)組。(B)早期(I期和II期)患者依據(jù)封閉蛋白-10表達(dá)水平被進(jìn)一步細(xì)分。(C)晚期(III期和IVa期)患者依據(jù)封閉蛋白-10表達(dá)水平被進(jìn)一步細(xì)分。圖6用于總體生存預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確率由在接受器工作特征曲線下的面積測(cè)量而得。以“敏感性”(真陽(yáng)性分?jǐn)?shù)(truepositivefraction))對(duì)“1-特異性”(假陽(yáng)性分?jǐn)?shù)(falsepositivefraction))作圖，分別用于轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)水平(范圍0-11.50)和pTNM分期(I、II、III和IVa)。圖7Kaplan-Meier總體生存圖。(A)將所有患者分成低或高轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)組。(B)早期(I期和II期)患者依據(jù)轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)水平被進(jìn)一步細(xì)分。(C)晚期(III期和IVa期)患者依據(jù)轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)水平被進(jìn)一步細(xì)分。圖8在人肝樣本中的轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)，以及由實(shí)時(shí)RT-PCR定量的轉(zhuǎn)錄物水平。圖9使用定量RT-PCR在獨(dú)立樣本集中的DNALI1基因表達(dá)的驗(yàn)證分析。在無(wú)病生存上的DNALI1水平的預(yù)后重要性在伴有高和低腫瘤DNALI1水平的患者之間評(píng)價(jià)，用75％作為截止值進(jìn)行分層。圖10在腫瘤中的DNALI1表達(dá)水平是通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR定量的。在核苷酸194(nt194)的多態(tài)性由血液DNA直接測(cè)序檢測(cè)。箱形圖顯示在伴有T-等位基因的患者中比伴有C-等位基因的患者有顯著高的DNALI1水平。發(fā)明詳述定義在本申請(qǐng)中使用的下列每個(gè)術(shù)語(yǔ)，除非在此另有明確所指，將有以下給出的含義。在此使用的“患者”意指任何動(dòng)物，諸如靈長(zhǎng)類動(dòng)物、小鼠、大鼠、豚鼠或兔子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該患者是人。在此使用的“組合物”意指一組預(yù)后性基因。在此使用的“可雜交的陣列元件(arrayelement)”意指任何可通過(guò)堿基配對(duì)與互補(bǔ)的核酸鏈結(jié)合的核酸鏈。在此使用的“基因表達(dá)模式”意指代表一組預(yù)后性基因的核酸水平的一組值。在此使用的“預(yù)后性基因評(píng)分”是評(píng)價(jià)基因表達(dá)模式統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義。預(yù)后性基因評(píng)分是在證明與不良的預(yù)后相關(guān)的表達(dá)水平的基因集里的基因的比例基礎(chǔ)上產(chǎn)生的。因?yàn)楦咚奖磉_(dá)的基因與不良的預(yù)后(壞的基因，相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)大于1)相關(guān)，表達(dá)水平高于平均表達(dá)值被賦值1個(gè)點(diǎn)(表達(dá)水平低于平均值，得到0點(diǎn)的分值)。因?yàn)楦咚奖磉_(dá)的基因與良好的預(yù)后(好的基因，相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)小于1)相關(guān)，表達(dá)水平低于平均表達(dá)值被賦值1個(gè)點(diǎn)(表達(dá)水平高于平均值，得到0點(diǎn)的分值)。因此適于每個(gè)個(gè)體的預(yù)后性基因評(píng)分為所有基因的平均評(píng)分(全部所得的點(diǎn)/全部被研究的基因的數(shù)量)。為1的預(yù)后性基因評(píng)分，對(duì)于所有壞的基因是高水平表達(dá)而對(duì)于所有好的基因是低水平表達(dá)，提示為預(yù)后不良。同樣地，預(yù)后性基因評(píng)分為0表明預(yù)后良好。本發(fā)明的實(shí)施方案本發(fā)明提供包含下列多核苷酸探針的組合物IL7R(AA485865)、NDRG1(AA486403)、EST1(H50345)、TRPC1(AA017132)、GFRA1(AA512935)、EST2(AA454543)、CLDN10(R54559)、DNALI1(R93087)、RBP5(AA453198)、EST3(AA621761)、EST4(N63706)、PCOLCE(AA670200)、TDO2(T72398)、EST5(T47454)、HIST1H2BD(N33927)、PXMP2(N70714)、ACAS2(AA455146)、ANAPC7(T68445)、EST6(AA576580)、RBP5(N92148)、ANXA1(H63077)、CKB(AA894557)、ITGBL1(N52533)、KPNA2(AA676460)、EST7(W90740)和MEG3(W85841)，或其任何的組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸探針是互補(bǔ)的DNAs。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸探針是克隆的cDNAs。多核苷酸探針可固定于底物上且可以是可雜交的陣列元件。本發(fā)明提供包含下列多核苷酸探針的組合物IL7R(AA485865)、NDRG1(AA486403)、EST1(H50345)、TRPC1(AA017132)、GFRA1(AA512935)、EST2(AA454543)、CLDN10(R54559)、DNALI1(R93087)、RBP5(AA453198)、EST3(AA621761)、EST4(N63706)和PCOLCE(AA670200)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供包含下列多核苷酸探針的組合物IL7R(AA485865)、NDRG1(AA486403)、EST1(H50345)、TRPC1(AA017132)、GFRA1(AA512935)、EST2(AA454543)、CLDN10(R54559)、DNALI1(R93087)、RBP5(AA453198)、EST3(AA621761)、EST4(N63706)、PCOLCE(AA670200)和一個(gè)或多個(gè)下列多核苷酸探針TDO2(T72398)、EST5(T47454)、HIST1H2BD(N33927)、PXMP2(N70714)、ACAS2(AA455146)、ANAPC7(T68445)、EST6(AA576580)、RBP5(N92148)、ANXA1(H63077)、CKB(AA894557)、ITGBL1(N52533)、KPNA2(AA676460)、EST7(W90740)和MEG3(W85841)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸探針是互補(bǔ)的DNAs。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸探針是克隆的cDNAs。多核苷酸探針可固定于底物上和可以是可雜交的陣列元件。本發(fā)明還提供用于確定罹患HCC的患者中肝細(xì)胞癌(HCC)復(fù)發(fā)的可能性的方法，所述方法包括(a)從患者中獲取腫瘤樣本；(b)確定在腫瘤樣本中的一組預(yù)后性基因的基因表達(dá)模式；(c)計(jì)算基因表達(dá)模式的預(yù)后性基因評(píng)分；和(d)將預(yù)后性基因評(píng)分和與HCC復(fù)發(fā)相關(guān)的預(yù)后性基因評(píng)分作比較，由此確定在患者中HCC復(fù)發(fā)的可能性。在本方法的優(yōu)選的實(shí)施方案中，基因表達(dá)模式由微陣列方法確定。在另一個(gè)實(shí)施方案中，基因表達(dá)模式由RT-PCR確定。在本方法的優(yōu)選的實(shí)施方案中，小于0.416的預(yù)后性基因評(píng)分表明HCC復(fù)發(fā)的可能性低，而等于或大于0.416的預(yù)后性基因評(píng)分表明HCC復(fù)發(fā)的可能性高。本發(fā)明還提供確定肝細(xì)胞癌(HCC)引起罹患此病的患者死亡的可能性的方法，所述方法包括(a)從患者中獲取腫瘤樣本；(b)確定在腫瘤樣本中的一組預(yù)后性基因的基因表達(dá)模式；(c)計(jì)算基因表達(dá)模式的預(yù)后性基因評(píng)分；和(d)將預(yù)后性基因評(píng)分與由HCC所致死亡相關(guān)的預(yù)后性基因評(píng)分作比較，由此確定患者與HCC相關(guān)的死亡的可能性。在本方法的優(yōu)選的實(shí)施方案中，低于0.600的預(yù)后性基因評(píng)分表明與HCC相關(guān)的死亡的可能性低，而等于或大于0.600的預(yù)后性基因評(píng)分表明與HCC相關(guān)的死亡的可能性高。本發(fā)明還提供確定是否給予罹患肝細(xì)胞癌(HCC)的患者輔助治療的方法，所述方法包括(a)從患者中獲取腫瘤樣本；(b)確定在腫瘤樣本中的一組預(yù)后性基因的基因表達(dá)模式；和(c)計(jì)算基因表達(dá)模式的預(yù)后性基因評(píng)分；以及(d)將預(yù)后性基因評(píng)分與HCC復(fù)發(fā)相關(guān)的預(yù)后性基因評(píng)分作比較，由此確定是否給予輔助治療。在本方法的優(yōu)選的實(shí)施方案中，低于0.416的預(yù)后性基因評(píng)分表明HCC復(fù)發(fā)的可能性低，而等于或大于0.416的預(yù)后性基因評(píng)分表明HCC復(fù)發(fā)的可能性高。本發(fā)明還提供確定罹患肝細(xì)胞癌(HCC)的患者預(yù)后的方法，所述方法包括(a)從患者中獲取腫瘤樣本；(b)確定在腫瘤樣本中的CLDN10核酸轉(zhuǎn)錄物的水平；(c)將從步驟(b)所得的CLDN10核酸轉(zhuǎn)錄物的水平與正常組織樣本中的CLDN10核酸轉(zhuǎn)錄物的水平比較，由此，從步驟(b)所得的較高水平的CLDN10核酸轉(zhuǎn)錄物表明預(yù)后不良。本發(fā)明還提供確定罹患肝細(xì)胞癌(HCC)的患者預(yù)后的方法，所述方法包括(a)從患者中獲取腫瘤樣本；(b)確定在腫瘤樣本中的AA454543核酸轉(zhuǎn)錄物的水平；(c)將從步驟(b)所得的AA454543核酸轉(zhuǎn)錄物的水平與正常組織樣本中的AA454543核酸轉(zhuǎn)錄物的水平比較，由此，從步驟(b)所得的較高水平的AA454543核酸轉(zhuǎn)錄物表明預(yù)后不良。本發(fā)明還提供確定罹患肝細(xì)胞癌(HCC)的患者預(yù)后的方法，所述方法包括(a)從患者中獲取腫瘤樣本；(b)確定在腫瘤樣本中的DNALI1核酸轉(zhuǎn)錄物的水平；(c)將從步驟(b)所得的DNALI1核酸轉(zhuǎn)錄物的水平與正常組織樣本中的DNALI1核酸轉(zhuǎn)錄物的水平比較，由此，從步驟(b)所得的較高水平的DNALI1核酸轉(zhuǎn)錄物表明預(yù)后不良。最后，本發(fā)明提供確定在罹患肝細(xì)胞癌(HCC)的患者中HCC復(fù)發(fā)的可能性的方法，所述方法包括(a)從患者中獲取血清樣本；(b)檢測(cè)DNALI1核酸轉(zhuǎn)錄物的存在；和(c)確定步驟(b)的DNALI1核酸轉(zhuǎn)錄物的密碼子65的核苷酸194多態(tài)性的存在，以確定哪個(gè)等位基因存在，由此，T-等位基因的存在表明HCC復(fù)發(fā)的概率較高。實(shí)施例I概要處于相同疾病分期的肝細(xì)胞癌(HCC)患者在疾病結(jié)局上可具有明顯的差異。用Cox回歸和Kaplan-Meier分析評(píng)價(jià)本研究的微陣列基因表達(dá)譜，并確定可提供比常規(guī)的臨床病理學(xué)體系更準(zhǔn)確的預(yù)后的一組12個(gè)基因。每個(gè)患者的預(yù)后性基因評(píng)分是基于在已證明與不良的預(yù)后相關(guān)的表達(dá)水平的最佳基因集里的基因的比例而產(chǎn)生的。具有良好的和不良的預(yù)后性基因評(píng)分的患者差異顯著，并且預(yù)后性基因評(píng)分是與pTNM分期比較來(lái)預(yù)測(cè)疾病復(fù)發(fā)的獨(dú)立因素。預(yù)后性基因集可幫助選擇預(yù)后不良的患者以作積極的輔助治療。材料與方法患者與樣本在本研究中，包括從48例經(jīng)歷對(duì)HCC有效的部分肝切除術(shù)的患者中獲得的基因表達(dá)譜，用于對(duì)患者預(yù)后的分析。如果被切除的標(biāo)本的病理學(xué)檢查顯示陽(yáng)性切除邊緣(positiveresectionmargin)或其它腫瘤細(xì)胞類型(如膽管細(xì)胞癌)的混合物、如果他們?cè)谇谐g(shù)之前或之后接受了化療、接受了肝移植而不是部分肝切除術(shù)，該切除術(shù)針對(duì)復(fù)發(fā)或該切除術(shù)引起醫(yī)院內(nèi)死亡，則患者被從本疾病結(jié)局分析中排除出去。復(fù)發(fā)的診斷是基于在對(duì)比增強(qiáng)CT掃描典型的成像中的結(jié)果和增高的血清AFP水平。在不確定的情況下，進(jìn)行肝動(dòng)脈造影術(shù)和碘油后CT掃描，如果需要，使用細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)方法以確診。截止到分析的日期(2003年5月)，27例患者發(fā)生復(fù)發(fā)且中位無(wú)病期為4.5個(gè)月(范圍為0.9-32.7個(gè)月)，他們中的17人死于疾病，他們的中位生存期為12.4個(gè)月(范圍為4.5-34.1個(gè)月)。對(duì)于那些沒(méi)有復(fù)發(fā)的21例患者，中位隨訪期為40.9個(gè)月(范圍為29.8-48.8個(gè)月)。另外47例HCCs隨后用定量RT-PCR進(jìn)行獨(dú)立檢驗(yàn)。在此第二批樣本中，患者中的26個(gè)發(fā)生復(fù)發(fā)且中位無(wú)病期為5.5個(gè)月(范圍為2.2-19.3個(gè)月)；對(duì)于21個(gè)無(wú)病的患者，中位隨訪期為23.3個(gè)月(范圍為11.5-31.1個(gè)月)。微陣列表達(dá)研究cDNA微陣列晶片被印記約23,000個(gè)cDNA克隆。已經(jīng)建立樣本和RNA制備以及雜交方案。選擇從至少2個(gè)樣本的平均值起到至少四倍的不同表達(dá)水平的總數(shù)1404個(gè)cDNA克隆用于下一步分析。使用皮爾森(Pearson)相關(guān)系數(shù)作為相似性量度標(biāo)準(zhǔn)，既將分級(jí)聚類算法應(yīng)用于基因又應(yīng)用于陣列。結(jié)果用TreeView(Eisen；http//rana.lb1.gov)作進(jìn)一步分析。定量RT-PCR實(shí)施定量RT-PCR。使用人18srRNA引物和探針試劑(Pre-DevelopedTaqManAssayReagents，應(yīng)用生物系統(tǒng)(AppliedBiosystems)，F(xiàn)osterCity，CA)作為用于隨后的倍增反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)照。對(duì)每個(gè)樣本的轉(zhuǎn)錄物按一式三份進(jìn)行量化。使用ABIPrism7700序列檢測(cè)系統(tǒng)(AppliedBiosystems，應(yīng)用生物系統(tǒng))實(shí)施定量。用于CLDN10的引物和探針是CLDN10-F、5′-CTGTGGAAGGCGTGCGTTA-3′；CLDN10-R、5′-CAAAGAAGCCCAGGCTGACA-3′；和CLDN10-P、5′-6FAMCCTCCATGCTGGCGCMGBNFQ-3′。預(yù)后性基因評(píng)分針對(duì)每個(gè)患者的預(yù)后性基因評(píng)分是基于在已證明的表達(dá)水平與不良的預(yù)后相關(guān)的基因集里的基因的比例而產(chǎn)生的。因?yàn)楦咚奖磉_(dá)的基因與不良的預(yù)后相關(guān)(壞的基因，相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)大于1)，表達(dá)水平高于平均表達(dá)值被賦值1個(gè)點(diǎn)(表達(dá)水平低于平均值，得到0點(diǎn)的分值)。因?yàn)楦咚奖磉_(dá)的基因與良好的預(yù)后相關(guān)(好的基因，相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)小于1)，表達(dá)水平低于平均表達(dá)值被賦值1個(gè)點(diǎn)(表達(dá)水平高于平均值的分值為0點(diǎn))。因此，針對(duì)每個(gè)個(gè)體的預(yù)后性基因評(píng)分是所有基因的平均分值(全部所得的點(diǎn)/全部被研究的基因的數(shù)量)。為1的預(yù)后性基因評(píng)分，對(duì)于所有壞的基因是高水平表達(dá)，而對(duì)于所有好的基因是低水平表達(dá)，提示為預(yù)后不良。同樣地，預(yù)后性基因評(píng)分為0表明預(yù)后良好。統(tǒng)計(jì)方法為了確定用于預(yù)測(cè)疾病復(fù)發(fā)的基因集，使用Cox回歸分析對(duì)在1404個(gè)克隆的每個(gè)上的表達(dá)水平對(duì)復(fù)發(fā)的影響進(jìn)行檢查。選擇P值小于0.05的基因。第二步，當(dāng)用Kaplan-Meier對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)時(shí)，通過(guò)包含那些P值小于0.05的基因進(jìn)一步描繪基因集。為了進(jìn)行該檢驗(yàn)，針對(duì)每組基因數(shù)據(jù)將患者分為兩組。分組是依據(jù)在平均表達(dá)值這個(gè)截止點(diǎn)的基因表達(dá)水平進(jìn)行的。第三步，使用“逐步減少(step-down)”法以確定可提供最好的復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)的具有最少數(shù)量基因的最佳基因集。在某一時(shí)間，在基因集里的一個(gè)基因被臨時(shí)性去除，并對(duì)所得的基因評(píng)分進(jìn)行Cox回歸分析。當(dāng)基因的去除具有最大的標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)(即對(duì)數(shù)相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)/標(biāo)準(zhǔn)誤)時(shí)，基因被從集里去除。該過(guò)程一直持續(xù)直到一個(gè)基因留在集里。取在所得最高的標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)的相應(yīng)的基因評(píng)分時(shí)的基因的數(shù)量作為最佳值。通過(guò)使用在StatisticalAnalysisSystem(統(tǒng)計(jì)分析系統(tǒng)，SAS)Version8.2(版本8.2)中的宏語(yǔ)言將該分析編入程序。通過(guò)接受器工作特性(ROC)曲線下的面積測(cè)量應(yīng)用針對(duì)復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)的基因評(píng)分的準(zhǔn)確率。分析用于3年的預(yù)測(cè)能力。在預(yù)測(cè)研究中，無(wú)病但少于3年隨訪的患者被排除在外，分析其中的27個(gè)發(fā)生復(fù)發(fā)的45例患者。與生存預(yù)測(cè)相似的，分析其中17個(gè)死亡的44例患者。Youden指數(shù)，即敏感性和(1-特異性)的總和，被用于確定最佳的截止點(diǎn)。SAS被用于該分析。用帶有由SPSS版本11.0軟件包(SPSS有限公司，芝加哥，伊利諾伊州)輔助的向前逐步選取法(forwardstepwiseselectionprocedure)的Cox比例危險(xiǎn)模型回歸法檢查臨床病理學(xué)參數(shù)與患者預(yù)后的相關(guān)性。表1.對(duì)26基因的無(wú)病生存單變量分析a用逐步減少法將用于預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的基因的相對(duì)重要性排序(ranked)。結(jié)果基因表達(dá)譜將掃描成像的熒光強(qiáng)度量化、規(guī)格化和校正，以得到富含基因的轉(zhuǎn)錄物，以樣本池(samplepool)的平均值作為強(qiáng)度比?？倲?shù)1404個(gè)cDNA克隆在兩個(gè)樣本中具有至少4倍差異的48例HCC樣本的組之間被顯著地調(diào)節(jié)。使用分級(jí)聚類算法，48例HCCs基于它們?cè)?404個(gè)重要克隆的相似性被聚類(clustered)。將HCC樣本分開(kāi)為截然不同的兩個(gè)分支(分別為25和23例HCCs)并與臨床病理學(xué)參數(shù)，諸如血清AFP水平、腫瘤的大小、靜脈浸潤(rùn)的出現(xiàn)、pTNM分期和復(fù)發(fā)相關(guān)。26例患者發(fā)生復(fù)發(fā)且中位無(wú)病期為4.5個(gè)月(范圍為0.9-32.7個(gè)月)。至于22個(gè)沒(méi)有復(fù)發(fā)的患者，隨訪的中位持續(xù)時(shí)間為37.2個(gè)月(范圍為26.1-45.4個(gè)月)。然而，這些臨床病理學(xué)參數(shù)與綜合表達(dá)特征(globalexpressionsignatures)無(wú)相互關(guān)系。結(jié)果期望的是HCC的綜合基因表達(dá)譜與腫瘤的增殖和代謝率、腫瘤細(xì)胞的去分化狀態(tài)相關(guān)。然后，具體地調(diào)查在48例患者中1404個(gè)克隆與腫瘤復(fù)發(fā)的相關(guān)。評(píng)估對(duì)基因表達(dá)水平與疾病復(fù)發(fā)之間相關(guān)的Cox回歸分析，發(fā)現(xiàn)54個(gè)基因與腫瘤復(fù)發(fā)之間有顯著相關(guān)(P＜0.05，1404個(gè)中有3.8％為重要克隆)。在第二步中，為了進(jìn)一步將用于復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)的基因數(shù)量減到最少，通過(guò)Kaplan-Meier分析檢查54個(gè)基因。通過(guò)對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)確定26個(gè)基因，P值小于0.05(表1)。如在方法部分所述產(chǎn)生每個(gè)單個(gè)患者的預(yù)后性基因評(píng)分。評(píng)分是以在已證明的表達(dá)水平與不良的預(yù)后相關(guān)的基因集里的基因的比例為基礎(chǔ)的。采用逐步減少法以確定可提供具有最佳預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的預(yù)后基因評(píng)分的最小集的基因。將對(duì)于復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)相對(duì)重要的基因排序，且按去除秩序的最后的基因是預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)最重要的基因(表1)。以標(biāo)準(zhǔn)效應(yīng)對(duì)被考慮的基因的數(shù)量繪曲線圖(圖1B)。當(dāng)基因的數(shù)量被最優(yōu)化至預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的最高排序前12個(gè)基因時(shí)，達(dá)到最大標(biāo)準(zhǔn)效應(yīng)。圖1C顯示48例HCC樣本中的12個(gè)基因的表達(dá)模式(圖1C)。基因根據(jù)它們?cè)跇颖旧媳挥梅旨?jí)聚類算法測(cè)量到的相似性而被聚類。在基因樹(shù)狀圖中顯示了截然不同的兩組基因。明顯地，頂部面板含有經(jīng)Cox分析相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)(RR)小于1的“好的”基因。通過(guò)Kaplan-Meier分析，這些“好的”基因的高水平的表達(dá)與更長(zhǎng)的無(wú)病期相關(guān)。在底部面板的基因是相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)(RR)大于1的“壞的”基因，其高水平的表達(dá)與更短的無(wú)病期相關(guān)。同樣，基于他們?cè)诖?2個(gè)預(yù)后性基因上測(cè)量的相似性，HCCs被劃分為在數(shù)據(jù)矩陣的底部指明的復(fù)發(fā)事件的兩組。在左邊聚類的HCCs顯示伴有好的基因向上調(diào)節(jié)和壞的基因向下調(diào)節(jié)的好的基因表達(dá)特征。相反，在右邊聚類的HCCs表現(xiàn)為伴有壞的基因向上調(diào)節(jié)和好的基因向下調(diào)節(jié)的壞的基因表達(dá)特征。與在有好的預(yù)后特征的患者中復(fù)發(fā)的低發(fā)生率(3/20，15％)相比，有壞的預(yù)后特征的大多數(shù)患者發(fā)生復(fù)發(fā)(24/28，85.7％)；Fisher′s精確檢驗(yàn)，P＜0.001。確認(rèn)使用獨(dú)立集的HCCs。為了驗(yàn)證用于預(yù)后的基因，使用原發(fā)性HCCs的附加獨(dú)立集(independentset)，從12個(gè)基因的集中任意地選擇基因以檢驗(yàn)微陣列表達(dá)數(shù)據(jù)。不同的實(shí)驗(yàn)方法，定量RT-PCR，被用于檢查封閉蛋白10(CLDN10)的表達(dá)水平。通過(guò)使用他們的中位表達(dá)值作為截止點(diǎn)將患者分成兩組。具有高水平的CLDN10表達(dá)的患者，18例患者中的14個(gè)(77.8％)發(fā)生復(fù)發(fā)；而29個(gè)具有低水平表達(dá)的患者中的12個(gè)(41.4％)發(fā)生復(fù)發(fā)(Fisher′s精確檢驗(yàn)，P＝0.015)(圖2)。高水平的CLDN10表達(dá)與增加的疾病復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)；RR為3倍(95％置信區(qū)間(CI)，1.4-6.6；P＝0.006)。用Kaplan-Meier分析，在具有高CLDN10水平的患者中的中位無(wú)病生存期為5.5個(gè)月，與在具有低水平表達(dá)的患者中的＞17.5個(gè)月比較(對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)，P＝0.004)。這樣，在確認(rèn)樣本集中，微陣列和RT-PCR在CLDN10上顯示可比較的結(jié)果?；虮磉_(dá)和臨床病理學(xué)特征對(duì)基于最佳集的12個(gè)基因的預(yù)后性基因評(píng)分排序并且與患者預(yù)后作比較(圖3A)。由預(yù)后性基因評(píng)分的患者結(jié)果預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確率通過(guò)接受器工作特性(ROC)曲線下的面積測(cè)量。3年內(nèi)的復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為97.8％(CI95％，94.8-100％)(圖3B)。用Youden指數(shù)測(cè)定的用于復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)的最佳截止值為0.416。3年內(nèi)的復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)的特異性和敏感性分別為94.4％(95％CI，72.7-99.9％)和92.6％(95％CI，75.7-99.1％)。對(duì)3年內(nèi)的復(fù)發(fā)的發(fā)生的預(yù)估RR為57.7倍。通過(guò)ROC曲線對(duì)于死于疾病的患者的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為89.3％(CI95％，79.4-99.2％)(圖3C)。通過(guò)Youden指數(shù)用于生存預(yù)測(cè)的最佳截止值為0.600。3年內(nèi)的死亡預(yù)測(cè)的特異性和敏感性分別為88.9％(95％CI，70.8-97.7％)和82.4％(95％CI，56.6-96.2％)。對(duì)3年內(nèi)死亡的預(yù)估RR為16.9倍。已經(jīng)分析臨床病理學(xué)特征與HCC復(fù)發(fā)之間的相互關(guān)系(表2)。靜脈入侵的存在、腫瘤尺寸大于5cm和晚期的pTNM分期均與疾病復(fù)發(fā)顯著相關(guān)。此3個(gè)特征和微陪靜脈(microsatellite)結(jié)節(jié)的存在均與疾病死亡顯著相關(guān)。性別、年齡、HBV感染史、血清AFP水平、肝硬化、腫瘤包囊形成(encapsulation)和Edmondson分級(jí)既不與復(fù)發(fā)顯著相關(guān)又不與死亡顯著相關(guān)。如由RR所提示的，預(yù)后性基因評(píng)分勝過(guò)(outperformed)所有臨床病理學(xué)參數(shù)。(B)淡青鏈霉菌MTCC5115的生物學(xué)和生理學(xué)特征結(jié)果顯示在表2中。在淡青鏈霉菌MTCC5115中，類黑素色素形成是陽(yáng)性的，而在較早知道的FK-506的生產(chǎn)者中是陰性的。在YMA上生長(zhǎng)的溫度范圍為22-35℃，最佳溫度是28℃。與已知的FK-506生產(chǎn)菌株相比，MTCC5115的糖利用模式顯示易于利用果糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖醇、蔗糖；鼠李糖的利用少，不利用阿拉伯糖、m-肌醇、棉子糖、水楊苷和木糖(表3)。淡青鏈霉菌MTCC5115有節(jié)制地利用苯丙氨酸和脯氨酸，但容易地利用組氨酸。表3淡青鏈霉菌MTCC5115的糖利用模式**Pridham，T.G.和GottliebD.；“TheutilizationofcarboncompoundsbysomeActinomycetalesasanaidforspeciesdetermination”，J.Bacteriology56，107-117，1948。用Kaplan-Meier分析對(duì)預(yù)后性基因評(píng)分和pTNM分期作進(jìn)一步研究(圖4)。具有不同預(yù)后性基因評(píng)分的患者在無(wú)病生存和總體生存上顯著差異(對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)P＜0.05)。在評(píng)分A和B的患者之間的總體生存分析中，他們中的大多數(shù)仍然存活，此2組間沒(méi)有觀察到顯著性差異；不過(guò)，評(píng)分B的患者的大多數(shù)在3年內(nèi)發(fā)生復(fù)發(fā)，在較長(zhǎng)時(shí)間的隨訪中，總體生存結(jié)局將預(yù)期比評(píng)分A的患者差。然而，具有不同pTNM分期的患者在無(wú)病生存和總體生存上沒(méi)有顯著差異。將I期和II期對(duì)比，或II期與III期對(duì)比，沒(méi)有觀察到顯著性差異。僅III期的患者與IVa期的患者有顯著性差異。因此，預(yù)后性基因評(píng)分可提供比pTNM分期系統(tǒng)更準(zhǔn)確的預(yù)后分隔(segregation)。討論這些結(jié)果表明對(duì)HCC患者的預(yù)后可源自原發(fā)性腫瘤的基因表達(dá)譜。預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的最佳基因集被描繪為與復(fù)發(fā)有顯著性相關(guān)的26個(gè)基因中排序中的前12個(gè)基因。盡管預(yù)后性基因集由復(fù)發(fā)事件相關(guān)性確定，此結(jié)果還可應(yīng)用于總體生存預(yù)測(cè)。因此產(chǎn)生預(yù)后性基因評(píng)分針對(duì)預(yù)測(cè)3年內(nèi)的復(fù)發(fā)和死亡分別有97.8％和89.3％的準(zhǔn)確率。如由相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)所提示的，預(yù)后性基因評(píng)分的預(yù)測(cè)能力勝過(guò)所有臨床病理學(xué)參數(shù)。多變量分析表明由基因評(píng)分的預(yù)后獨(dú)立于pTNM分期。因此，與臨床和病理學(xué)數(shù)據(jù)一起的基因表達(dá)數(shù)據(jù)將明確地提供對(duì)于疾病預(yù)后更加準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)。這是第一次報(bào)道基因表達(dá)譜用于在肝切除術(shù)后的HCC患者中無(wú)病生存和總體生存的預(yù)測(cè)。近來(lái)的研究解釋了3年內(nèi)肝內(nèi)和肝外的復(fù)發(fā)，如在肝臟之外復(fù)發(fā)對(duì)于疾病的診治也是重要的并且更長(zhǎng)的隨訪期將包括根治性手術(shù)后的復(fù)發(fā)的多數(shù)。在臨床終點(diǎn)考慮中的根本的差異可說(shuō)明兩個(gè)報(bào)告之間的預(yù)后性基因列表差異。然而，差異也可由于用于兩個(gè)中心的不同的微陣列，包括在基因芯片中不同的基因集引起。此外，在Iizuka等的研究中，患者主要是與HCV相關(guān)的，而我們的大多數(shù)患者是與HBV相關(guān)的，因此疾病的預(yù)后實(shí)際上可涉及不同的基因?；虻墓δ茏⒔馓峁?duì)導(dǎo)致快速?gòu)?fù)發(fā)的潛在的生物學(xué)機(jī)制的進(jìn)一步了解?？赡苌婕凹?xì)胞入侵和轉(zhuǎn)移的基因是在不良預(yù)后組中顯著地向上調(diào)節(jié)的。例如，CLDN10家族成員已經(jīng)顯示促進(jìn)入侵和遷移；動(dòng)力蛋白、軸索、輕中間型多肽1(DNALI1)是一種動(dòng)力蛋白并且可調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移/運(yùn)動(dòng)性。近期的綜述表明對(duì)于根治性手術(shù)后的局部的HCC的新輔助治療和輔助治療在總體生存或無(wú)病生存上已經(jīng)有了適度的改進(jìn)。挫折是預(yù)料之中的，因?yàn)榧词故菦](méi)有輔助治療，約半數(shù)患者將不發(fā)生疾病復(fù)發(fā)(圖4A)。這些預(yù)后良好的患者可不受益于輔助治療，但是可能死于輔助治療的副作用。因此，預(yù)后性基因評(píng)分可幫助選擇那些將受益于輔助治療的高風(fēng)險(xiǎn)的患者，并且顯著地減少根本不需要治療的患者的數(shù)量。此外，在具有不良預(yù)后的腫瘤中解除調(diào)節(jié)(deregulated)的基因是可能的新的抗癌癥藥物合理開(kāi)發(fā)的標(biāo)靶以及治療對(duì)象。在本研究中，RBP5在HCC患者的子集中是向下調(diào)節(jié)的(圖1C)并且因此它們可以是由視黃酸(retinoicacid)進(jìn)行化學(xué)預(yù)防的侯選者。顯示高水平的RBP5的患者可意味著對(duì)視黃酸無(wú)應(yīng)答，或?yàn)榱酥委煻鴮BP5水平拉低所必須采取的措施。這些標(biāo)靶的確認(rèn)也可改進(jìn)研究治療其它腫瘤的效率。這些結(jié)果表明基于12個(gè)基因的表達(dá)模式的預(yù)后性基因評(píng)分可準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)根治性手術(shù)后的HCC患者的疾病復(fù)發(fā)和生存，并且意味著入侵和轉(zhuǎn)移行為是在原發(fā)性腫瘤中啟動(dòng)的生物學(xué)本性。實(shí)施例II概要具有相同臨床病理學(xué)特征的肝細(xì)胞癌(HCC)的患者在根治性肝切除后可能有明顯不同的疾病結(jié)局。為了處理這一問(wèn)題，評(píng)價(jià)HCCs的cDNA微陣列基因表達(dá)譜并確定封閉蛋白-10表達(dá)水平與疾病復(fù)發(fā)相關(guān)。本研究的目的是通過(guò)可適用于常規(guī)操作的備選的研究方法驗(yàn)證以上微陣列數(shù)據(jù)。使用定量RT-PCR以驗(yàn)證在封閉蛋白-10表達(dá)水平上的微陣列數(shù)據(jù)。該化驗(yàn)在單獨(dú)的HCC樣本集上重復(fù)該試驗(yàn)，以證實(shí)封閉蛋白-10的預(yù)后的意義。通過(guò)定量RT-PCR和微陣列測(cè)量法所得的封閉蛋白-10表達(dá)水平顯示高度一致(r＝0.602，P＜0.001)。在單獨(dú)的HCC樣本集上重復(fù)定量RT-PCR并且封閉蛋白-10表達(dá)與復(fù)發(fā)的相關(guān)性被再次證實(shí)(風(fēng)險(xiǎn)比1.2，95％CI1.0-1.4，P＝0.011)。通過(guò)多變量Cox回歸分析，封閉蛋白-10表達(dá)和pTNM分期為獨(dú)立的預(yù)測(cè)疾病復(fù)發(fā)的因素。因此，HCC的封閉蛋白-10表達(dá)可被用作對(duì)根治療性肝切除術(shù)后的疾病復(fù)發(fā)的分子標(biāo)記。材料與方法患者與樣本從在1999年3月至2000年4月期間于香港瑪麗女王醫(yī)院(QueenMaryHospital，HongKong)做了根治性部分肝切除術(shù)的48例HCC患者得來(lái)的基因表達(dá)譜被納入用于患者預(yù)后分析。如果被切除的標(biāo)本的病理學(xué)檢查顯示陽(yáng)性切除邊緣(切除外緣有殘癌)或其它腫瘤細(xì)胞類型(如膽管細(xì)胞癌)的混合物；如果他們?cè)谇谐g(shù)之前或之后接受了化療；如果他們接受了肝移植而不是部分肝切除術(shù)；如果該切除術(shù)是為了復(fù)發(fā)或減輕的意圖；或如果該切除術(shù)引起醫(yī)院內(nèi)死亡，則患者被從本疾病預(yù)后分析中排除出去。在相同的研究機(jī)構(gòu)中，將在2000年4月至2002年3月期間動(dòng)過(guò)手術(shù)的、使用相同的排除標(biāo)準(zhǔn)的其它53例HCCs補(bǔ)充進(jìn)來(lái)用于驗(yàn)證研究。為標(biāo)本收集，已經(jīng)取得備告知者的同意。研究方案經(jīng)香港大學(xué)倫理規(guī)范委員會(huì)核準(zhǔn)。HCC復(fù)發(fā)的診斷基于在計(jì)算機(jī)X線斷層攝影增強(qiáng)掃描術(shù)中的典型的成像結(jié)果和增加的血清AFP水平。在不確定的情況下，進(jìn)行肝動(dòng)脈造影術(shù)和碘油計(jì)算機(jī)X線斷層攝影掃描術(shù)，且如果需要，使用細(xì)針穿刺(抽吸)細(xì)胞學(xué)確認(rèn)。直至分析的那天，總數(shù)101例患者中有59人發(fā)生復(fù)發(fā)且中位無(wú)病期為5.7個(gè)月(范圍為0.9-32.7個(gè)月)。對(duì)剩余的42個(gè)無(wú)病的患者，中位隨訪期為34.0個(gè)月(范圍為14.9-48.8個(gè)月)?；颊吣挲g范圍為從13歲至79歲，年齡中位數(shù)為52歲。有81個(gè)男性和20個(gè)女性。92例患者的血清乙型肝炎表面抗原(HBsAg)為陽(yáng)性(91.1％)。腫瘤依據(jù)UICCpTNM腫瘤分類1997版分期(18)，因?yàn)?002版沒(méi)有依生存率明確地將患者劃分為不同的期(19)。臨床病理學(xué)特征將前瞻性地收錄HCC臨床數(shù)據(jù)庫(kù)中。微陣列表達(dá)研究。cDNA微陣列載玻片印記有包含17,400個(gè)基因的約23,000個(gè)cDNA克隆。樣本、RNA制備物和雜交方案已確定并且在此之前已詳細(xì)描述(14，20)。數(shù)據(jù)存放入斯坦福微陣列數(shù)據(jù)庫(kù)(http//genome-www5.stanford.edu/MicroArray/SMD/)(21)。通過(guò)對(duì)每個(gè)陣列用平均數(shù)中間值(mean-centering)處理基因使熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化，然后通過(guò)所有陣列用平均數(shù)中間值處理每個(gè)基因。在至少50％的試驗(yàn)樣本中，或者為Cy5-標(biāo)記的樣本或者為Cy3-標(biāo)記的參照物，只有經(jīng)過(guò)良好檢測(cè)的基因才被納入下一步的分析中，并定義為具有信號(hào)強(qiáng)度對(duì)背景噪音的比率大于1.5倍且比背景大50單位的凈信號(hào)強(qiáng)度的基因。選擇總共1,404個(gè)cDNA克隆用于Cox回歸的進(jìn)一步分析，這些克隆具有4倍于至少兩個(gè)樣本的平均數(shù)的不同表達(dá)水平。定量RT-PCR。對(duì)RT-PCR進(jìn)行定量。使用人18srRNA引物和探針試劑(Pre-DevelopedTaqManAssayReagents，AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)作為后續(xù)的倍增反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)照物。相對(duì)數(shù)量的封閉蛋白-10(其已被適于RNA數(shù)量變異的對(duì)照物18s和適于板與板間變異的校準(zhǔn)器(calibrator標(biāo)準(zhǔn)化)作為以2為底的對(duì)數(shù)的相對(duì)倍數(shù)變化存在。轉(zhuǎn)錄物量化)按每一個(gè)樣本至少一式三份進(jìn)行。使用ABIPrism7700測(cè)序系統(tǒng)(AppliedBiosystems)進(jìn)行量化。適于封閉蛋白-10的引物和探針為CLDN10-F、5′-CTGTGGAAGGCGTGCGTTA-3′CLDN10-R、5′-CAAAGAAGCCCAGGCTGACA-3′；和CLDN10-P、5′-6FAMCCTCCATGCTGGCGCMGBNFQ-3′。統(tǒng)計(jì)方法。有基因表達(dá)數(shù)據(jù)作為連續(xù)變量的Cox回歸分析用計(jì)算機(jī)計(jì)算檢驗(yàn)與根治性切除術(shù)后疾病復(fù)發(fā)相關(guān)的基因表達(dá)。使用適于驗(yàn)證的定量RT-PCR處理微陣列數(shù)據(jù)重現(xiàn)性的技術(shù)性問(wèn)題。微陣列的表達(dá)數(shù)據(jù)和定量RT-PCR數(shù)據(jù)為由Pearson′s相關(guān)系數(shù)(r)估算的連續(xù)變量。封閉蛋白-10表達(dá)與無(wú)病生存的相關(guān)性在另一個(gè)獨(dú)立的樣本集中被驗(yàn)證，我們使用定量RT-PCR作為差異分析技術(shù)用于獨(dú)立樣本集中的轉(zhuǎn)錄物定量。封閉蛋白-10表達(dá)數(shù)據(jù)僅在Kaplan-Meier分析中被模擬為分類變量。使用Youden指數(shù)(敏感性+特異性-1)(23)以確定用于3年無(wú)病生存預(yù)測(cè)的封閉蛋白-10表達(dá)的最佳截止點(diǎn)。包括均值、中位數(shù)和第75個(gè)百分點(diǎn)的其它截止值也被考慮和檢查，它們均能以臨床含義劃分患者。使用Youden指數(shù)同時(shí)使預(yù)測(cè)的敏感性和特異性達(dá)最高。用逐步選取法結(jié)合多變量Cox比例危險(xiǎn)模型回歸，研究基因表達(dá)和臨床病理學(xué)參數(shù)與患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)。封閉蛋白-10表達(dá)數(shù)據(jù)被模擬為連續(xù)變量，并且所有的臨床病理學(xué)參數(shù)在Cox回歸分析中被模擬為分類變量。適當(dāng)時(shí)，用斯皮爾曼(Spearman)相關(guān)和Mann-WhitneyU檢驗(yàn)評(píng)估封閉蛋白-10表達(dá)水平與臨床病理學(xué)特征的關(guān)聯(lián)。當(dāng)P值小于0.05時(shí)，差異是相當(dāng)顯著的。統(tǒng)計(jì)分析由SPSS版本11.0軟件包(SPSS有限公司，芝加哥，伊利諾伊州)輔助進(jìn)行。額外的微陣列信息。微陣列研究按照由微陣列基因表達(dá)數(shù)據(jù)集團(tuán)(MicroarrayGeneExpressionDataGroup)發(fā)行的MIAME指導(dǎo)原則進(jìn)行(24)?？衫肧tanfordMicroarrayDatabase(http//genome-www5.stanford.edu)中的原始數(shù)據(jù)。還可利用向作者索取的信息。結(jié)果封閉蛋白-10表達(dá)與復(fù)發(fā)。用連續(xù)變量模擬的基因表達(dá)的Cox回歸分析被計(jì)算以確定預(yù)測(cè)根治性切除術(shù)后的疾病復(fù)發(fā)的基因表達(dá)(HCCsn＝48)。封閉蛋白-10在預(yù)后預(yù)測(cè)中排序很高并且是具有潛在治療價(jià)值的膜結(jié)合蛋白。封閉蛋白-10編碼其中封閉蛋白為整聯(lián)膜蛋白(integralmembraneproteins)和緊密連接鏈(tightjunctionstrands)的成分的封閉蛋白家族的成員。由cDNA微陣列的封閉蛋白-10水平與復(fù)發(fā)有顯著的關(guān)聯(lián)(風(fēng)險(xiǎn)比[HR]1.7，95％置信區(qū)間[CI]1.1-2.6，P＝0.014)。為了核實(shí)在cDNA微陣列重現(xiàn)性上的技術(shù)顧慮，在相同的HCC樣本集上進(jìn)行定量RT-PCR。源自兩個(gè)研究方法的結(jié)果被證明是高度一致的(Pearson相關(guān)系數(shù)，r＝0.602，P＜0.001)。為了提供獨(dú)立檢驗(yàn)封閉蛋白-10表達(dá)與疾病復(fù)發(fā)之間的關(guān)聯(lián)，使用第二個(gè)集的原發(fā)性HCCs(n＝53)。應(yīng)用定量RT-PCR以檢測(cè)封閉蛋白-10轉(zhuǎn)錄物的豐量。將封閉蛋白-10水平當(dāng)作連續(xù)變量，并使用Cox回歸分析以檢查轉(zhuǎn)錄物水平與根治性HCC手術(shù)后的患者的疾病復(fù)發(fā)之間的關(guān)系。結(jié)果表明封閉蛋白-10的轉(zhuǎn)錄物水平與復(fù)發(fā)顯著關(guān)聯(lián)(HR1.2，95％CI1.0-1.4，P＝0.011)。這樣，經(jīng)不同技術(shù)檢驗(yàn)的兩個(gè)樣本集都表明在HCC中封閉蛋白-10的較高表達(dá)水平與根治性手術(shù)后的疾病復(fù)發(fā)相關(guān)。由封閉蛋白-10表達(dá)和臨床病理學(xué)特征評(píng)估預(yù)后。所有在這兩個(gè)樣本集中的101例患者被包括在疾病復(fù)發(fā)分析中。封閉蛋白-10表達(dá)數(shù)據(jù)是基于定量RT-PCR，并且在該分析中被模擬作為連續(xù)變量。根據(jù)臨床病理學(xué)參數(shù)，相應(yīng)地對(duì)患者進(jìn)行對(duì)分研究(dichotomized)(表3)。表3.針對(duì)無(wú)病生存的基因表達(dá)和臨床病理學(xué)參數(shù)的Cox回歸分析aP＞0.05的無(wú)顯著意義的變量沒(méi)有列于此表中，這些變量包括性別(男性與女性比較)、年齡(≤60歲、＞60歲)、與乙型肝炎病毒的關(guān)聯(lián)(不存在與存在血清乙型肝炎表面抗原比較)、慢性肝病(正常和肝炎與肝殘留部分硬化)、腫瘤包囊形成(不存在與存在腫瘤包囊比較)、Edmondson-Steiner病理學(xué)分級(jí)(1級(jí)和2級(jí)與3級(jí)和4級(jí)比較)。b在本分析中由定量RT-PCR檢驗(yàn)的封閉蛋白-10表達(dá)水平(為以2為底的對(duì)數(shù)的相對(duì)倍數(shù)變化)被模擬為連續(xù)變量。通過(guò)單變量Cox回歸分析，封閉蛋白-10表達(dá)(HR1.2，95％CI1.1-1.3，P＝0.002)、晚期pTNM分期(HR3.0，95％CI1.7-5.4，P＜0.001)、靜脈侵害(HR2.6，95％CI1.5-4.5，P＜0.001)、大腫瘤尺寸(HR2.2，95％CI1.2-3.8，P＝0.006)、多腫瘤結(jié)節(jié)(HR1.9，95％CI1.1-3.3，P＝0.025)，以及微陪靜脈結(jié)節(jié)(HR1.7，95％CI1.0-2.9，P＝0.037)均顯著性地與疾病復(fù)發(fā)相關(guān)。性別、年齡、HBV關(guān)聯(lián)、血清AFP水平、剩余肝的硬化、腫瘤包囊組織形成，以及Edmondson-Steiner組織學(xué)分期均與復(fù)發(fā)無(wú)顯著性相關(guān)。通過(guò)多變量Cox回歸分析，封閉蛋白-10表達(dá)(HR1.2，95％CI1.1.1-1.3，P＜0.001)、晚期pTNM分期(HR2.6，95％CI1.4-4.7，P＝0.002)、大腫瘤尺寸(HR2.7，95％CI1.5-4.9，P＝0.001)和高血清AFP水平(HR2.2，95％CI1.2-4.0，P＝0.010)為疾病復(fù)發(fā)的獨(dú)立的預(yù)后因素。其它的臨床病理學(xué)特征不增加獨(dú)立的預(yù)后信息。應(yīng)用Kaplan-Meier圖進(jìn)一步檢查由單獨(dú)使用封閉蛋白-10表達(dá)水平或與pTNM分期系統(tǒng)一起使用的預(yù)測(cè)能力，因?yàn)檫@兩個(gè)因素為適于Cox回歸分析的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。用Youden指數(shù)，封閉蛋白-10表達(dá)的最佳截止值為1.23(為以2為底的對(duì)數(shù)的相對(duì)倍數(shù)變化)，以將患者劃分為低或高封閉蛋白-10表達(dá)組。使用這個(gè)截止值，有60例患者在低封閉蛋白-10表達(dá)組(范圍0-1.15)和41例患者在高封閉蛋白-10表達(dá)組(范圍1.30-11.21)。單獨(dú)使用封閉蛋白-10因素劃分患者，低和高封閉蛋白-10水平的患者的3年累計(jì)無(wú)病生存，分別為53.3％(32/60)和24.4％(10/41)，(對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)，P＜0.001)(圖1)?；诨颊叩姆忾]蛋白-10水平與pTNM期重復(fù)該分析。對(duì)于具有低封閉蛋白-10水平的早期(I期和II期)患者，3年累計(jì)無(wú)病生存為75％(21/28)，對(duì)于具有高封閉蛋白-10的早期患者則為40.0％(6/15)，對(duì)于具有低封閉蛋白-10的晚期(III期和IVa期)患者，3年累計(jì)無(wú)病生存為34.4％(11/32)，而對(duì)于具有高封閉蛋白-10的晚期患者則為15.4％(4/26)(對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)，P＜0.001)。減少的封閉蛋白-10表達(dá)與年長(zhǎng)的患者、腫瘤包囊的出現(xiàn)和未硬化的肝相關(guān)聯(lián)。為了更好地理解封閉蛋白-10表達(dá)的重要性，分析了封閉蛋白-10表達(dá)水平與HCC患者的臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)聯(lián)。腫瘤中的封閉蛋白-10表達(dá)的向下調(diào)節(jié)與老年患者(r＝-0.223，P＝0.025)、腫瘤包囊的出現(xiàn)(P＝0.011)和剩余部分的未硬化的肝(non-cirrhoticliver)(r＝0.257，P＝0.009)顯著地相關(guān)。在腫瘤中的封閉蛋白-10表達(dá)水平與pTNM分期、靜脈浸潤(rùn)、腫瘤大小、多腫瘤結(jié)節(jié)、微陪靜脈結(jié)節(jié)、性別、HBV相關(guān)性、血清AFP水平或Edmondson-Steiner組織學(xué)分級(jí)顯著地不相關(guān)。討論在本研究中，顯示了封閉蛋白-10表達(dá)水平及其作為用于HBV相關(guān)的HCC的新的分子標(biāo)記的預(yù)后價(jià)值。封閉蛋白-10基因由Ensembl自動(dòng)化分析管線(http//www.ensembl.org)注釋(annotated)。封閉蛋白-10基因定位于含有5個(gè)外顯子的25.51Kb的染色體13q31-q34區(qū)域，且預(yù)測(cè)蛋白含4個(gè)電位跨膜結(jié)構(gòu)域。此基因編碼其中封閉蛋白為整聯(lián)膜蛋白和緊密連接鏈的成分的封閉蛋白家族的成員(參見(jiàn)參考文獻(xiàn)16的綜述)。緊密連接鏈起物理屏障的作用，以防止溶質(zhì)和水自由地通過(guò)上皮細(xì)胞層和內(nèi)皮細(xì)胞層之間的細(xì)胞旁空隙(paracellularspace)。封閉蛋白-10的確切功能還不清楚，其在癌癥發(fā)生和進(jìn)展的作用還是一個(gè)謎。有趣的是，封閉蛋白家族成員已經(jīng)顯示促進(jìn)細(xì)胞侵襲和遷移(16)。已報(bào)道兩個(gè)編碼不同的異構(gòu)體可變剪切轉(zhuǎn)錄物變體用于封閉蛋白-10基因(NM_006984和NM_182848)。此兩個(gè)轉(zhuǎn)錄物在C-末端是相同的并且同樣編碼155個(gè)氨基酸。在數(shù)據(jù)庫(kù)(GenAtlas，GeneCard，和SwissProt)中，封閉蛋白-10主要涉及封閉蛋白-10b或封閉蛋白-10轉(zhuǎn)錄物變體2(NM_006984，編碼228個(gè)氨基酸)，還有報(bào)道該轉(zhuǎn)錄物在肺癌細(xì)胞系中被過(guò)度表達(dá)(17)。不過(guò)，封閉蛋白-10變體涉及封閉蛋白-10a或封閉蛋白-10轉(zhuǎn)錄物變體1(NM_182848，編碼226個(gè)氨基酸)。在本報(bào)告中，封閉蛋白-10(NM_006984)以其臨床的重要性為特點(diǎn)，因?yàn)槠錇樵诙喾N組織器官(NCBIGenBank)和肝臟(未出版的資料)中觀測(cè)到的主要的同工型。對(duì)有不同的疾病復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的患者的確認(rèn)對(duì)患者的利益變得尤其重要。這里，在另一個(gè)獨(dú)立的樣本集中微陣列數(shù)據(jù)得到驗(yàn)證，應(yīng)用定量RT-PCR以對(duì)在獨(dú)立的樣本集中的轉(zhuǎn)錄物定量。由不同分析技術(shù)檢驗(yàn)的兩組數(shù)據(jù)集證明封閉蛋白-10表達(dá)的向下調(diào)節(jié)與根治手術(shù)后的延長(zhǎng)的無(wú)病期相關(guān)聯(lián)。我們的結(jié)果表明HCC患者的預(yù)后可源自于原發(fā)性腫瘤的基因表達(dá)。應(yīng)用定量RT-PCR以評(píng)估封閉蛋白-10水平是特別可行的臨床標(biāo)度，因?yàn)樵摍z驗(yàn)是敏感的并且對(duì)于實(shí)際應(yīng)用而言，檢驗(yàn)設(shè)備在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室中是普通易得的。Cox回歸多變量分析指出在預(yù)測(cè)預(yù)后中，封閉蛋白-10表達(dá)是獨(dú)立于pTNM分期的，且所用的基因表達(dá)數(shù)據(jù)與pTNM分期一起可形成協(xié)力，以提供對(duì)疾病預(yù)后的更加準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)(圖5)。這是有關(guān)封閉蛋白-10表達(dá)與在肝切除術(shù)后的HCC患者中的無(wú)病生存相關(guān)的首次報(bào)告。已經(jīng)有關(guān)于用微陣列方法的HCCs表達(dá)譜的報(bào)告(14，20，25-30)，盡管很少有報(bào)告是關(guān)于基因表達(dá)與HCC患者預(yù)后相關(guān)的。值得注意的是，由Iizuka及其同事所作的近期的報(bào)告證明基因表達(dá)與肝切除術(shù)后1年內(nèi)早期肝內(nèi)復(fù)發(fā)相關(guān)(31)。在那個(gè)報(bào)告中，封閉蛋白-10沒(méi)有顯示預(yù)后重要性。此偏差可歸于許多原因。首先，在Iizuka等的研究中，患者主要是HCV-相關(guān)的(22/33，66.7％)，而我們的大多數(shù)患者是HBV-相關(guān)的(92/101，91.1％)。不同的HCC病因?qū)W實(shí)際上可涉及不同的基因，因而在HBV-相關(guān)的HCC中和在HCV-相關(guān)的HCC中與復(fù)發(fā)相關(guān)聯(lián)的基因可能是不同的。再者，在臨床終點(diǎn)考慮因素中的根本的差異(在Iizuka等的報(bào)告中僅報(bào)告了在手術(shù)后第一年內(nèi)肝內(nèi)復(fù)發(fā)；在我們的報(bào)告中報(bào)告了3年內(nèi)肝內(nèi)復(fù)發(fā)和/或肝外復(fù)發(fā))可解釋這種差異，因?yàn)椴煌幕蚩赡苁窃斐稍缙趶?fù)發(fā)(第一年內(nèi))或晚期復(fù)發(fā)(第一年后)的原因。此外，我們認(rèn)為3年內(nèi)肝內(nèi)和肝外復(fù)發(fā)都是臨床終點(diǎn)的評(píng)估，因?yàn)樵诟闻K之外的復(fù)發(fā)對(duì)于疾病的治療也是重要的，并且較長(zhǎng)的隨訪期將包括根治性手術(shù)后復(fù)發(fā)的多數(shù)。因此，重要的是評(píng)價(jià)封閉蛋白-10表達(dá)水平是否能夠預(yù)測(cè)在HCV相關(guān)的HCCs中3年疾病復(fù)發(fā)?；虻墓δ艿淖⑨屘峁┝藢?duì)導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)潛在的生物學(xué)機(jī)理的進(jìn)一步了解。封閉蛋白-10的生物學(xué)功能不清楚。特別地，封閉蛋白家族成員已經(jīng)顯示與細(xì)胞侵襲和遷移相關(guān)(16)。封閉蛋白-2的過(guò)度表達(dá)使在上皮細(xì)胞中的“緊密的”緊密連接轉(zhuǎn)換為“疏漏的(leaky)”緊密連接(32)。封閉蛋白-11的過(guò)度表達(dá)在少突膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞系引起增殖以及促進(jìn)遷移。雖然如此，在人癌癥中的封閉蛋白的作用仍然存有爭(zhēng)議。已經(jīng)報(bào)告在胰腺癌(34，35)、結(jié)腸直腸癌(36)和卵巢癌(37)中封閉蛋白-4/-3的過(guò)度表達(dá)。值得注意的是，封閉蛋白-4表達(dá)降低胰腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的潛力(38)。另外，已經(jīng)報(bào)告在頭和頸部鱗狀上皮細(xì)胞癌(39)和乳腺癌(40，41)的封閉蛋白-7/-1的向下調(diào)節(jié)。封閉蛋白-10尚未被充分地進(jìn)行特征鑒定(16)。尤其是，封閉蛋白-10被報(bào)告在肺癌細(xì)胞系中高度表達(dá)(17)。在HCC中低的封閉蛋白-10表達(dá)與包括老年患者、腫瘤包囊的出現(xiàn)和剩余部分未硬化的肝的更有利的特征相關(guān)。在年輕的患者觀察到更晚期的HCCs(9，42)。缺乏腫瘤包囊是有侵襲性的HCC的特征并且與早期復(fù)發(fā)相關(guān)(7，10)。在肝硬化的患者中手術(shù)死亡率較高，其與肝功能儲(chǔ)備有關(guān)(11，43)。降低的封閉蛋白-10水平的生物學(xué)作用對(duì)有利于HCC預(yù)后的作用尚不清楚。對(duì)于封閉蛋白-10的細(xì)胞起源的初步免疫組織化學(xué)分析表明，在具有高水平封閉蛋白-10轉(zhuǎn)錄物的HCCs中，在肝細(xì)胞腫瘤中觀察到強(qiáng)的膜信號(hào)和顆粒細(xì)胞質(zhì)著色。但是，需要進(jìn)一步的研究以闡釋預(yù)后性基因封閉蛋白-10在癌變發(fā)生中的作用，以便描述導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)的確切的分子路徑。這些結(jié)果表明封閉蛋白-10表達(dá)可預(yù)測(cè)根治手術(shù)后的疾病復(fù)發(fā)。實(shí)施例III概要在顯示預(yù)后意義與鄰近的非腫瘤肝組織相比的腫瘤中過(guò)度表達(dá)的基因中，轉(zhuǎn)錄物AA454543有潛在的實(shí)際用途。本研究的目的是用備選的研究方法并在HCC患者的分開(kāi)的組別中驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄物AA454543的預(yù)后意義。得自于接受了根治性部分肝切除術(shù)(組1)的48例患者的微陣列分析的轉(zhuǎn)錄物AA454543的數(shù)據(jù)，由定量RT-PCR驗(yàn)證(r＝0.618，p＜0.001)。對(duì)得自于53例患者(組2)的分開(kāi)的HCCs樣本集檢查，AA454543表達(dá)水平與總體生存的關(guān)聯(lián)再次得到驗(yàn)證(p＝0.027)。用Cox回歸分析，轉(zhuǎn)錄物AA454543(風(fēng)險(xiǎn)比3.0，p＝0.017)和pTNM分期(風(fēng)險(xiǎn)比3.3，p＝0.010)為用于總體生存的獨(dú)立的預(yù)后性因素。對(duì)3年總體生存預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確度，對(duì)于轉(zhuǎn)錄物AA454543(74.2％，p＝0.001)和pTNM分期(76.4％，p＝0.001)而言，可由在接受器工作特征曲線下測(cè)量得的面積進(jìn)行比較。轉(zhuǎn)錄物AA454543是對(duì)于用于HCC的根治性部分肝切除術(shù)后的總體生存的潛在有用的分子預(yù)后性標(biāo)記。材料與方法患者與樣本于1999年3月至2000年4月在香港瑪麗女王醫(yī)院接受了根治性部分肝切除術(shù)的48例患者被選擇用于起初的研究(組1)。應(yīng)用cDNA微陣列研究了這48例患者的基因表達(dá)譜[10]。為了驗(yàn)證從cDNA微陣列得來(lái)的數(shù)據(jù)，在本研究中，在本組的HCCs中針對(duì)AA454543表達(dá)實(shí)施定量RT-PCR。將在2000年4月至2002年3月期間在相同的研究機(jī)構(gòu)進(jìn)行手術(shù)的另外的53個(gè)HCC患者(組2)，采用相同的入選標(biāo)準(zhǔn)補(bǔ)充進(jìn)來(lái)，用于通過(guò)RT-PCR對(duì)轉(zhuǎn)錄物AA454543的進(jìn)一步驗(yàn)證研究。這個(gè)獨(dú)立的患者群(組2)被用于確認(rèn)預(yù)后性標(biāo)記工作如常進(jìn)行，不僅是在數(shù)據(jù)來(lái)源的患者的組(組1)中[11]。切除的標(biāo)本的病理學(xué)檢查顯示清晰的切除邊緣的患者被包括在本研究中。如果病理學(xué)檢查顯示其它腫瘤細(xì)胞類型(如膽管細(xì)胞癌)的混合物；如果他們?cè)谇谐g(shù)之前或之后接受了化療；如果他們接受了肝移植而不是部分肝切除術(shù)；如果該切除術(shù)是針對(duì)復(fù)發(fā)或減輕的意圖；或如果該切除術(shù)引起醫(yī)院內(nèi)死亡，則患者不被選擇。2組患者的臨床病理學(xué)數(shù)據(jù)列于表4?；颊叩哪挲g范圍從13至79，中位年齡為52歲。有81個(gè)男性和20個(gè)女性。在92例患者(91.1％)中，血清乙型肝炎表面抗原為陽(yáng)性。依據(jù)國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)(theInternationalUnionAgainstCancer)的病理性腫瘤淋巴結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移(pTNM)腫瘤分類1997版[12]將腫瘤分期，因?yàn)?002版沒(méi)有明顯地將我們的晚期的患者的生存分級(jí)[13]。針對(duì)HCC的復(fù)發(fā)，患者被預(yù)期隨訪。復(fù)發(fā)的診斷是基于在對(duì)比增強(qiáng)計(jì)算機(jī)斷層掃描典型的成像結(jié)果和增高的血清AFP水平。在不確定的情況下，進(jìn)行肝動(dòng)脈造影術(shù)和碘油后計(jì)算機(jī)斷層掃描，如果需要，使用細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)方法以確診。截止到分析的日期，總數(shù)101例患者中有31例死于疾病，中位生存期為12.5個(gè)月(范圍為4.5-34.1個(gè)月)。對(duì)于余下的70例患者，中位隨訪期為33.4個(gè)月(范圍為14.9-48.8個(gè)月)。表4.HCCs的臨床病理學(xué)特征。為了對(duì)轉(zhuǎn)錄物AA454543進(jìn)行cDNA微陣列研究和定量RT-PCR分析，收集于2000年4月至2001年12月在相同的研究機(jī)構(gòu)實(shí)施移植手術(shù)中來(lái)自30位器官捐贈(zèng)者(8具尸體捐贈(zèng)者和22個(gè)活體捐贈(zèng)者)的正常肝臟標(biāo)本。這些器官捐贈(zèng)者沒(méi)有罹患肝臟疾病并且乙肝血清學(xué)為陰性。在剖腹手術(shù)中立即獲取肝臟標(biāo)本，為的是將作為生理學(xué)變化或物理處理結(jié)果的DNA/RNA變化的機(jī)會(huì)減至最低。標(biāo)本的收集已取得被告之者的同意。研究方案經(jīng)香港大學(xué)倫理委員會(huì)核準(zhǔn)。微陣列表達(dá)研究cDNA微陣列載玻片印記有包含17,400個(gè)基因的約23,000個(gè)cDNA克隆。樣本、RNA制備和雜交方案已確定并且在此之前已詳細(xì)描述[10，14]。數(shù)據(jù)存放入斯坦福微陣列數(shù)據(jù)庫(kù)(theStanfordMicroarrayDatabase)(http//genome-www5.stanford.edu/MicroArray/SMD/)[15]。通過(guò)對(duì)每個(gè)陣列用平均數(shù)中間值處理基因使熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化，然后對(duì)所有陣列的每個(gè)基因用平均數(shù)中間值處理。只有經(jīng)過(guò)良好檢測(cè)的基因才被納入下一步的分析中，并定義為具有信號(hào)強(qiáng)度對(duì)背景噪音的比率大于1.5倍且比背景大50單位的凈信號(hào)強(qiáng)度的基因，在至少50％的試驗(yàn)樣本中，用于或者Cy5-標(biāo)記的樣本或者Cy3-標(biāo)記的參照物。具有表達(dá)水平差異至少4倍于至少兩個(gè)樣本的平均數(shù)的總數(shù)為1,404個(gè)cDNA克隆，被選擇用于通過(guò)Cox回歸的進(jìn)一步分析。用于轉(zhuǎn)錄物AA454543的定量RT-PCR如參考文獻(xiàn)[16]中所述進(jìn)行定量RT-PCR。簡(jiǎn)言之，使用HighCapacitycDNAArchive試劑盒(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)，依照生產(chǎn)廠商的說(shuō)明書(shū)，從0.5μg的總RNA合成第一條cDNA。每個(gè)25μlPCR反應(yīng)包含1xPCR緩沖液II，5.5mMMgCl2、每份dATP、dCTP和dGTP各0.2mM、0.4mMdUTP、0.625單位AmpliTaqGold和5μl第一條cDNA。使用適于18srRNA的引物和探針試劑(Pre-DevelopedTaqManAssayReagents，AppliedBiosystems)作為內(nèi)標(biāo)對(duì)照物。適于轉(zhuǎn)錄物AA454543的引物和探針為AA454543-F(5′-ACCCACACACAGCGCTCAC-3′)、AA454543-R(5′-CAAGCCGTAAAACTTCTGCATG-3′)和AA454543-P(5′-6FAMAGTCACTCTCAGCGGCCATCGCCCA-3′)。使用ABIPrism7700測(cè)序系統(tǒng)(AppliedBiosystems)進(jìn)行定量。轉(zhuǎn)錄物定量在針對(duì)每個(gè)樣本按至少一式三份進(jìn)行。針對(duì)RNA數(shù)量差異用對(duì)照物18s和針對(duì)于板與板間變異的校準(zhǔn)器進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后的轉(zhuǎn)錄物AA454543的相對(duì)量，被用對(duì)數(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換(以2為底)并表現(xiàn)為與基于微陣列的數(shù)據(jù)相似的相對(duì)倍數(shù)變化。統(tǒng)計(jì)方法用計(jì)算機(jī)計(jì)算連同作為連續(xù)變量的基因表達(dá)數(shù)據(jù)的Cox回歸分析，以檢驗(yàn)與根治性切除術(shù)后總體生存相關(guān)的基因表達(dá)。為了驗(yàn)證，使用定量RT-PCR處理微陣列數(shù)據(jù)重現(xiàn)性的技術(shù)性問(wèn)題。用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)評(píng)估由微陣列的表達(dá)數(shù)據(jù)和定量RT-PCR數(shù)據(jù)的相關(guān)性。在組2的患者中，用定量RT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)與總體生存之間的相關(guān)。使用轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)水平用于預(yù)后預(yù)測(cè)的總準(zhǔn)確率通過(guò)對(duì)接受器工作特征曲線下的面積測(cè)量而得，因?yàn)樵谟?jì)量(gauging)預(yù)后標(biāo)記的性能時(shí)使用風(fēng)險(xiǎn)比可存在局限性[17]。對(duì)于3年的預(yù)測(cè)能力進(jìn)行了分析。存活但少于3年隨訪的患者被排除出該預(yù)測(cè)研究。這樣，59例患者(其中31例死于疾病)被包括在這一部分的分析中。使用Youden指數(shù)(敏感性+特異性-1)[18]以確定用于3年總體生存預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)的最佳截止點(diǎn)。使用Youden指數(shù)使預(yù)測(cè)的敏感性(真陽(yáng)性分?jǐn)?shù))和特異性(1-假陽(yáng)性分?jǐn)?shù))同時(shí)達(dá)至最高。應(yīng)用帶有向前逐步選取法的單變量和多變量Cox比例危險(xiǎn)模型回歸對(duì)基因表達(dá)和pTNM分期與患者預(yù)后的相關(guān)性進(jìn)行檢驗(yàn)。pTNM分期信息為分類數(shù)據(jù)。為易于解釋，為了將風(fēng)險(xiǎn)比理解為比直接與pTNM分期更加能判斷的范圍，將基因表達(dá)數(shù)據(jù)模擬為只在多變量Cox回歸中的分類變量。轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)數(shù)據(jù)也被模擬為在Kaplan-Meier分析中的分類變量。適當(dāng)時(shí)由Spearman相關(guān)分析和Mann-WhitneyU檢驗(yàn)評(píng)估轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)水平與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性。當(dāng)P值小于0.05時(shí)，差異被認(rèn)為是有顯著意義的。應(yīng)用SPSS版本11.0軟件包(SPSS有限公司，芝加哥，伊利諾伊州，美國(guó))輔助統(tǒng)計(jì)分析。額外的微陣列信息按照由微陣列基因表達(dá)數(shù)據(jù)團(tuán)體(MicroarrayGeneExpressionDataGroup)[19]發(fā)行的MIAME指導(dǎo)原則進(jìn)行微陣列研究。可利用在StanfordMicroarrayDatabase(http//genome-www5.stanford.edu)中的原始數(shù)據(jù)。還可利用因向作者索取所獲得的信息。結(jié)果轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)和總體生存在cDNA微陣列數(shù)據(jù)中，轉(zhuǎn)錄物AA454543在預(yù)后預(yù)測(cè)和表達(dá)水平中的高排序與非腫瘤相關(guān)。通過(guò)cDNA微陣列的較高的轉(zhuǎn)錄物AA454543水平與較短的總體生存顯著相關(guān)(風(fēng)險(xiǎn)比[HR]1.8，95％置信區(qū)間[CI]1.1-3.1，p＝0.024)(表5)。定量RT-PCR在組1患者的HCC樣本上進(jìn)行，以驗(yàn)證cDNA微陣列數(shù)據(jù)。此兩種研究方法證明高度一致(Spearman相關(guān)，r＝0.618，p＜0.001)。在組2的患者中，如由定量RT-PCR所測(cè)的轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)水平顯示與總體生存顯著的相關(guān)性(HR1.4，95％CI1.0-2.0，p＝0.027)(表5)。由兩種不同的技術(shù)檢驗(yàn)的兩個(gè)獨(dú)立樣本集都表明，在HCC中轉(zhuǎn)錄物AA454543較高表達(dá)水平表達(dá)與根治性手術(shù)后的差的總體生存相關(guān)。然后將此兩個(gè)樣本集納入使用基于定量RT-PCR數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)水平的Cox回歸分析中。在合并的數(shù)據(jù)中，轉(zhuǎn)錄物AA454543水平與總體生存顯著相關(guān)(HR1.3，95％CI1.1-1.6，p＝0.008)(表5)。表5.用于基于轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)的總體生存的Cox回歸分析。aa轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)數(shù)據(jù)被模擬為連續(xù)變量。表達(dá)數(shù)據(jù)是基于組1患者的微陣列數(shù)據(jù)，以及組2患者和合并組的患者中的定量RT-PCR。由轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)和pTNM分期的預(yù)后將兩組中所有的患者納入總體生存分析中。轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)數(shù)據(jù)是基于定量RT-PCR方法，且將對(duì)總體生存的預(yù)測(cè)能力與pTNM分期相比較。通過(guò)接受器工作特征曲線下面積測(cè)量的、使用轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)預(yù)測(cè)3年總體生存率的準(zhǔn)確率為74.2％(95％CI61.2-87.2％，p＝0.001)(圖6)。為比較，使用pTNM分期對(duì)生存預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確率為76.4％(95％CI64.2-88.5％，p＝0.001)。使用Youden指數(shù)，將患者劃分為低或高轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)組的轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)的最佳截止值為7.05(為以2為底的對(duì)數(shù)的相對(duì)倍數(shù)變化)。用通過(guò)轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)的這個(gè)截止值預(yù)測(cè)患者的預(yù)后，其敏感性和特異性分別為80.6％和67.9％。當(dāng)將患者二分為早期(I期和II期)或晚期(III期和IVa期)組時(shí)，由pTNM分期所作預(yù)后預(yù)測(cè)的敏感性和特異性分別為80.6％和57.1％。在總共101例患者中，使用Kaplan-Meier曲線圖進(jìn)一步檢驗(yàn)由單獨(dú)應(yīng)用轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)水平或與pTNM分期系統(tǒng)一起應(yīng)用時(shí)的預(yù)測(cè)能力。用Youden指數(shù)作為截止點(diǎn)，有43例患者在低轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)組(范圍為0-7.02)，以及58例患者在高轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)組(范圍為7.08-11.50)。通過(guò)單獨(dú)使用轉(zhuǎn)錄物AA454543水平來(lái)劃分患者，對(duì)于具有低或高轉(zhuǎn)錄物AA454543水平的患者的累計(jì)3年的總體生存分別為86.0％(37/43)和56.9％(33/58)(對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)，p＝0.001)(圖7)?；诨颊叩霓D(zhuǎn)錄物AA454543水平和pTNM分期重復(fù)該分析。對(duì)于具有低轉(zhuǎn)錄物AA454543水平的早期(I期和II期)患者，其累計(jì)3年總體生存為96％(24/25)，對(duì)于具有高轉(zhuǎn)錄物AA454543水平的早期患者，其累計(jì)3年總體生存為72.2％(13/18)，對(duì)于具有低轉(zhuǎn)錄物AA454543的晚期(III期和IVa期)患者，其累計(jì)3年總體生存為72.2％(13/18)，以及對(duì)于具有高轉(zhuǎn)錄物AA454543的晚期患者，其累計(jì)3年總體生存為50.0％(20/40)(對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)，p＝0.014)。通過(guò)Cox回歸分析，模擬為連續(xù)變量的轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)數(shù)據(jù)與總體生存顯著相關(guān)(表5)。然而，在其自然范圍表達(dá)的風(fēng)險(xiǎn)比僅說(shuō)明了在與在表達(dá)范圍上的1個(gè)單位變化相關(guān)的疾病相關(guān)死亡率的風(fēng)險(xiǎn)中的變化，此變化太小以致于在早期不被知道。為有助于說(shuō)明，將基因表達(dá)數(shù)據(jù)模擬為分類變量以將風(fēng)險(xiǎn)比納入更加可說(shuō)明的范圍(表6)。與Kaplan-Meier分析相同，將患者劃分為低或高轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)組，用Youden指數(shù)確定最佳截止值。通過(guò)單變量Cox回歸分析，轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)(HR3.9，95％CI1.6-9.6，p＝0.003)和晚期pTNM分期(HR4.2，95％CI1.7-10.3，p＝0.002)與總體生存顯著相關(guān)。通過(guò)多變量Cox回歸分析，轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)(HR3.0，95％CI1.2-7.5，p＝0.017)和晚期pTNM分期(HR3.3，95％CI1.3-8.2，p＝0.010)為用于總體生存的獨(dú)立預(yù)后性因素。表6.總體生存對(duì)轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)和pTNM分期的Cox回歸分析。a轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)數(shù)據(jù)被模擬為分類變量。用7.05的Youden指數(shù)確定將患者劃分為低或高轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)組的最佳截止值。bpTNM分期被模擬為分類變量。在肝組織中的轉(zhuǎn)錄物AA454543水平在基于cDNA微陣列方法的較早的觀察中，HCC組織中的轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)比在HCCs臨近的非腫瘤肝組織中的高。為了驗(yàn)證該觀察，我們用實(shí)時(shí)定量RT-PCR隨機(jī)檢查了93例(從總數(shù)101例中)臨近HCCs的肝組織，以檢測(cè)轉(zhuǎn)錄物水平。結(jié)果表明與臨近HCCs的肝組織比較(中位數(shù)為5.54，范圍1.26-10.13)，HCCs顯示出顯著較高的轉(zhuǎn)錄物AA454543水平(中位數(shù)為7.21，范圍0-11.50)(p＜0.001)。在HCCs中比在臨近HCCs的肝組織中較高的表達(dá)水平可以解釋為或者在HCCs中轉(zhuǎn)錄物AA454543向上調(diào)節(jié)，或者在臨近HCCs肝組織中轉(zhuǎn)錄物AA454543向下調(diào)節(jié)。為了區(qū)別這兩種情形，檢驗(yàn)了30例正常肝組織。在正常肝中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄物AA454543轉(zhuǎn)錄物以低水平表達(dá)(中位數(shù)5.31，范圍0-7.36)，顯著低于HCCs(p＜0.001)，但與臨近HCCs的肝組織沒(méi)有顯著差異(p＝0.382)(圖8)。轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)與臨床病理學(xué)特征為了更好地理解轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)的重要意義，我們分析轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)水平與HCC患者的臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性。在腫瘤中轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)的向上調(diào)節(jié)顯著地與晚期pTNM分期(r＝0.299，p＝0.002)、靜脈浸潤(rùn)(p＜0.001)、微陪靜脈結(jié)節(jié)(p＝0.016)以及高Edmondson-Steiner組織學(xué)分級(jí)(r＝0.276，p＝0.005)相關(guān)聯(lián)。在腫瘤中轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)水平與腫瘤大小、性別、年齡、HBsAg陽(yáng)性或血清AFP水平?jīng)]有顯著的相關(guān)性。討論轉(zhuǎn)錄物AA454543序列(克隆IDIMAGE838048；UniGeneClusterHs.437039；登錄號(hào)(accession)BC043195)是具有部分密碼子的1703bpmRNA并從人腦的視丘下部最初克隆。通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI))BLAST進(jìn)行序列同源物homologue檢索，轉(zhuǎn)錄物AA454543與得自對(duì)染色體1p31.3-32.2的克隆RP4-758N20的人DNA序列的AL035705在1686bp上顯示95％的一致性。與小鼠基因組比較，轉(zhuǎn)錄物AA454543與在小鼠染色體4上的DNA序列的AL929466在327bp上顯示85％的一致性。在人、小鼠和有機(jī)體模型基因組中沒(méi)有已知的基因顯示出與轉(zhuǎn)錄物AA454543序列的高的序列同源性。在為了患者利益的疾病的診治中，對(duì)根治性處理后的具有不同風(fēng)險(xiǎn)的患者鑒定將越來(lái)越重要。常規(guī)的pTNM分期系統(tǒng)已被證明是為確認(rèn)具有不同預(yù)后的患者提供信息的，并且最近的研究證明HCC的分子特征能夠進(jìn)一步增強(qiáng)預(yù)測(cè)的能力。就此而言，我們?cè)u(píng)價(jià)基于我們的早期微陣列數(shù)據(jù)的分析而選擇的轉(zhuǎn)錄物AA454543的預(yù)后重要性。另外，它在腫瘤中的轉(zhuǎn)錄物水平顯著高于臨近腫瘤的肝組織，這將是對(duì)于臨床應(yīng)用的重要考慮因素并且因此被選擇作為分子預(yù)后性標(biāo)記用于后續(xù)的驗(yàn)證。本研究的目的是用定量RT-PCR的分析方法提高預(yù)后性基因的重要意義，這種方法在常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)上易于用到的適于實(shí)際應(yīng)用。在最近的研究中，我們報(bào)告轉(zhuǎn)錄物AA454543的預(yù)后的重要意義，轉(zhuǎn)錄物AA454543的表達(dá)水平可預(yù)測(cè)根治性肝切除術(shù)后的HCC患者的生存。對(duì)于由多變量Cox回歸分析所作的總體生存，轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)和pTNM分期為獨(dú)立的預(yù)后性因素。如在Kaplan-Meier分析中闡明的(圖7)，基因表達(dá)數(shù)據(jù)與pTNM分期一起可幫助提供更加準(zhǔn)確的總體生存預(yù)測(cè)。值得注意的是，轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)(單基因數(shù)據(jù))和pTNM分期在預(yù)后預(yù)測(cè)上有相似的準(zhǔn)確性(分別為74.2％和76.4％)。我們的最終目標(biāo)是征募更多的基因以提高預(yù)后預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。α-胎甲球蛋白(AFP)的表達(dá)、細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、與代謝相關(guān)的基因以及腫瘤反分化情形與HCCs的分子亞型相關(guān)[10，14，20-25]?？墒?，幾乎沒(méi)有關(guān)于基因表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)的HCC報(bào)告。值得注意的是，Iizuka等報(bào)告基因表達(dá)譜與早期肝內(nèi)復(fù)發(fā)相關(guān)[26]。本研究與Iizuka等的報(bào)告之間存在的根本差異是，在Iizuka′s的研究中的大多數(shù)患者是HCV相關(guān)的(22/33，66.7％)，而在本研究中患者大多數(shù)是HBV相關(guān)的(92/101，本群體中的91.1％)。不同的病原因子可涉及不同的癌變路徑，導(dǎo)致不同的分子組成和行為。此外，我們使用3年總體生存作為終點(diǎn)而Iizuka等使用在第1年的肝內(nèi)復(fù)發(fā)作為臨床終點(diǎn)用于預(yù)后預(yù)測(cè)。用于疾病復(fù)發(fā)和總體生存的預(yù)后的預(yù)后性基因可以是不同的。盡管如此，我們已經(jīng)探究了由Iizuka等的原始數(shù)據(jù)集(http//surgery2.med.yamaguchi-u.ac.jp/research/DNAchip/)且轉(zhuǎn)錄物AA454543不在探針集列表中。因此，重要的是評(píng)估轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)水平是否能夠預(yù)測(cè)在HCV相關(guān)的HCCs中的總體生存。轉(zhuǎn)錄物AA454543沒(méi)有被充分地進(jìn)行特征鑒定且其生物學(xué)功能尚不清楚。在臨床樣本中，在HCCs中的轉(zhuǎn)錄物AA454543水平顯著高于臨近HCCs的以及正常肝的平行的肝組織。轉(zhuǎn)錄物AA454543水平提供信息以區(qū)分肝組織是否是腫瘤組織，另外還提供預(yù)后性信息。對(duì)于轉(zhuǎn)錄物AA454543的細(xì)胞起源的初步的原位雜交分析表明，在HCC組織的腫瘤肝細(xì)胞中觀察到細(xì)胞質(zhì)的信號(hào)。值得注意的是，在HCC中較高的轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)與包括晚期pTNM分期、靜脈浸潤(rùn)、微陪靜脈結(jié)節(jié)和高Edmondson-Steiner分級(jí)在內(nèi)的不良預(yù)后特征相關(guān)。轉(zhuǎn)錄物AA454543水平與臨床病理學(xué)特征之間的相關(guān)性研究實(shí)際上在探索，并且需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)以檢驗(yàn)它們的因果關(guān)系，例如，增高的轉(zhuǎn)錄物AA454543水平是否會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞入侵能力的增加，導(dǎo)致靜脈浸潤(rùn)和微陪靜脈結(jié)節(jié)的形成。在分級(jí)聚類分析中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄物AA454543聚類接近于增殖聚類，緊密靠近G蛋白-偶聯(lián)受體和鋅指蛋白，這些蛋白在協(xié)調(diào)細(xì)胞循環(huán)過(guò)程中起重要作用。這些與轉(zhuǎn)錄物AA454543共同表達(dá)的基因?qū)⒂兄谔峁┺D(zhuǎn)錄物AA454543功能的線索。本研究表明轉(zhuǎn)錄物AA454543表達(dá)水平可預(yù)測(cè)根治性部分肝切除術(shù)患者的總體生存。最近的方法證明表達(dá)譜確定預(yù)后性標(biāo)記的能力對(duì)于臨床應(yīng)用切實(shí)可行。此事還展現(xiàn)了顧及未知基因的前景，并且不僅專注于在癌發(fā)生作用上有公認(rèn)的生物學(xué)作用的熟知基因。此分子標(biāo)記提供普遍的預(yù)后性信息(兩群獨(dú)立的患者)并且該預(yù)測(cè)是獨(dú)立于分析方法(微陣列或定量RT-PCR)的。通過(guò)定量RT-PCR，這個(gè)基因可用于常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室分析。與pTNM分期一起，將有助于改善預(yù)后預(yù)測(cè)以及對(duì)患者有利的疾病的診治。實(shí)施例IV概要如在我們的通過(guò)cDNA微陣列方法對(duì)肝細(xì)胞癌癥(HCC)的早期的基因組-廣泛表達(dá)研究中顯示的，發(fā)現(xiàn)動(dòng)力蛋白、軸索、輕中間型多肽1(DNALI1)表達(dá)與疾病復(fù)發(fā)顯著相關(guān)(風(fēng)險(xiǎn)比[HR]1.7，95％置信區(qū)間[CI]1.1-2.6，P＝0.014)。該研究在獨(dú)立樣本集(n＝50)上進(jìn)行并且使用定量RT-PCR以檢測(cè)DNALI1轉(zhuǎn)錄水平。較高DNALI1表達(dá)水平與早期疾病復(fù)發(fā)的相關(guān)性被再次證實(shí)。我們的初步的測(cè)序研究表明DNALI1在核苷194(密碼子65)具有多態(tài)性，其攜帶或者C-等位基因(GCA，丙胺酸)或者T-等位基因(GTA，纈氨酸)。然后，針對(duì)核苷194多態(tài)性我們還檢查了患者的血液樣本(n＝50，HCCs有定量RT-PCR數(shù)據(jù)的平行樣本)。與有C-等位基因的患者比較，在有T-等位基因患者中，腫瘤DNALI1轉(zhuǎn)錄水平明顯較高(中位數(shù)分別為67.2和27.6；P＝0.029)。對(duì)臨床樣本的研究證實(shí)DNALI1表達(dá)水平與疾病早期復(fù)發(fā)相關(guān)，并且具有在核苷194上有T-等位基因的患者的DNALI1水平較高。實(shí)施例I的參考文獻(xiàn)1.Pisani，P.，Parkin，D.M.，Bray，F(xiàn).和Ferlay，J.″EstimatesoftheWorldwideMortalityfrom25Cancersin1990″，Int.J.Cancer83，18-29(1999)。2.El-Serag，H.B.和Mason，A.C.，″RisingIncidenceofHepatocellularCarcinomaintheUnitedStates″，N.Engl.J.Med.340，745-750(1999)。3.Taylor-Robinson，S.D.，F(xiàn)oster，G.R.，Arora，S.，Hargreaves，S.和Thomas，H.C.，″IncreaseinPrimaryLiverCancerintheUK，1979-94″，Lancet3501142-1143(1997)。4.Okuda，K.，F(xiàn)ujimoto，I.，Hanai，A.和Urano，Y.，″ChangingIncidenceofHepatocellularCarcinomainJapan，″CancerRes.47，4967-4972(1987)。5.Tang，Z.Y.，″HepatocellularCarcinoma″，J.Gastroenterol.Hepatol.15卷增刊，G1-7(2000)。6.Ng，I.O.，Lai，E.C.，F(xiàn)an，S.T.，Ng，M.M.和So，M.K.，″PrognosticSignificanceofPathologicFeaturesofHepatocellularCarcinoma.AMultivariateAnalysisof278Patients″，Cancer76，2443-2448(1995)。7.Ng，I.O.，Poon，R.T.，Shek，T.W.和Fan，S.T.，″ClinicopathologicandPrognosticSignificanceoftheHistologicActivityofNoncance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者的預(yù)后的方法，所述方法包括(a)從患者中獲取腫瘤樣本；(b)確定在腫瘤樣本中的AA454543核酸轉(zhuǎn)錄物的水平；(c)將得自步驟(b)的AA454543核酸轉(zhuǎn)錄物的水平與正常組織樣本中的AA454543核酸轉(zhuǎn)錄物的水平比較，而步驟(b)的較高水平的AA454543核酸轉(zhuǎn)錄物表明預(yù)后不良。26.一種確定罹患肝細(xì)胞癌(HCC)患者的預(yù)后的方法，所述方法包括(a)從患者中獲取腫瘤樣本；(b)確定在腫瘤樣本中的DNALI1核酸轉(zhuǎn)錄物的水平；(c)將得自步驟(b)的DNALI1核酸轉(zhuǎn)錄物的水平與正常組織樣本中的DNALI1核酸轉(zhuǎn)錄物的水平比較，而步驟(b)的較高水平的DNALI1核酸轉(zhuǎn)錄物表明預(yù)后不良。27.一種在罹患肝細(xì)胞癌(HCC)的患者中確定HCC復(fù)發(fā)的可能性的方法，所述方法包括(a)從患者中獲取血清樣本；(b)檢測(cè)DNALI1核酸轉(zhuǎn)錄物的存在；和(b)確定在步驟(c)的DNALI1核酸轉(zhuǎn)錄物的密碼子65的核苷酸194存在的多態(tài)性，以確定哪個(gè)等位基因存在，而T-等位基因的存在表明HCC復(fù)發(fā)的概率高。全文摘要本發(fā)明提供包含下列多核苷酸探針的組合物IL7R(AA485865)、NDRG1(AA486403)、EST1(H50345)、TRPC1(AA017132)、GFRA1(AA512935)、EST2(AA454543)、CLDNIO(R54559)、DNALII(R93087)、RBP5(AA453198)、EST3(AA621761)、EST4(N63706)、PCOLCE(AA670200)、TD02(T72398)、EST5(T47454)、HIST1H2BD(N33927)、PXMP2(N70714)、ACAS2(AA455146)、ANAPC7(T68445)、EST6(AA576580)、RBP5(N92148)、ANXA1(H63077)、CKB(AA894557)、ITGBL1(N52533)、KPNA2(AA676460)、EST7(W90740)和MEG3(W85841)。本發(fā)明還提供確定肝細(xì)胞癌(HCC)在罹患HCC的患者中復(fù)發(fā)的可能性、確定罹患HCC的患者死亡的可能性或確定是否給予輔助治療的方法。文檔編號(hào)C12Q1/68GK1867671SQ200480029686公開(kāi)日2006年11月22日申請(qǐng)日期2004年8月13日優(yōu)先權(quán)日2003年8月13日發(fā)明者范上達(dá),張兆恬申請(qǐng)人:香港大學(xué)