專利名稱：抗原遞送系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗原遞送系統(tǒng)。具體地，本發(fā)明涉及可用于對動物進(jìn)行接種來對抗疾病以及區(qū)分接種的和天然感染的動物的系統(tǒng)。
理解和選擇性操作動物中的天然內(nèi)在和獲得性免疫系統(tǒng)對于保護(hù)農(nóng)場和家養(yǎng)動物對抗疾病以及使其對疾病控制用抗生素介入的依賴性減少是有利的，由于后者增加了抗生素抗性的風(fēng)險，這一話題在所有物種中的重要性都增加。
抗生素通常不加選擇地用來保護(hù)農(nóng)場和家養(yǎng)動物種類免受多種病原體侵襲。不適當(dāng)?shù)目股厥褂玫倪@種文化由于病原體抗原就保護(hù)免疫力而言的效果差而出現(xiàn)。
因此，需要發(fā)展并改善我們對于病原體保護(hù)中宿主獲得性免疫力的作用的理解非常迫切，例如基于對動物健康的關(guān)注以及消費者對具有低抗生素殘留的高質(zhì)量肉的要求的增加。
現(xiàn)在對于分子抗原的研究增加，目的在于通過它們在疫苗產(chǎn)物中的用途誘導(dǎo)動物種類中的保護(hù)。然而由于所述產(chǎn)品很少考慮到激發(fā)細(xì)胞免疫系統(tǒng)來保護(hù)動物防治疾病，所述產(chǎn)品在許多情況中的有效性有限。
疫苗作為疾病控制裝置的一個限制是區(qū)分天然感染的動物和接種的動物有困難。例如，與最近的英國的口蹄疫(FMD)暴發(fā)這一主要事件相關(guān)的時，其中沒有采用接種，部分原因是一旦本國牛群被接種，一些國家不會允許進(jìn)口來自該牛群的家畜。目前的接種方法還降低的肉類的市場價值，因為屠宰后的畜體一旦感染就必需被處理，終止較長時間以殺死可能存在的任何病毒。對于FMD，重點在于保持清潔畜群，但幾乎不可能保持清潔的畜群，這是因為傳染的問題(例如自大鼠，獾等)。標(biāo)記物疫苗，其含有對于被免疫動物而言異源的免疫原，已經(jīng)被推薦作為區(qū)分天然感染的和接種的動物。
本發(fā)明推薦靶向樹突細(xì)胞，利用選擇性結(jié)合樹突細(xì)胞的組成部分(moiety)，聯(lián)合抗原諸如與動物疾病相關(guān)的抗原，以及不天然存在動物種類中的所述選擇性靶向的組成部分，不僅提供了抗原遞送(接種)的新概念，而且允許區(qū)分經(jīng)接種的和天然感染的動物。
本發(fā)明的第一個方面提供了用于接種動物的化合物，包括(i)選擇性結(jié)合動物中的樹突細(xì)胞的組成部分，但所述組成部分并非天然存在于動物中，和(ii)抗原。
“選擇性結(jié)合樹突細(xì)胞的組成部分”意指任何適宜的組成部分，其結(jié)合樹突細(xì)胞但基本不結(jié)合其它類型的抗原呈遞細(xì)胞。組成部分是否如所述選擇性結(jié)合可通過測定所述組成部分與樹突細(xì)胞的結(jié)合與其它抗原呈遞細(xì)胞例如利用熒光標(biāo)記的結(jié)合組成部分的結(jié)合并進(jìn)行比較，和測定與樹突細(xì)胞結(jié)合的熒光和其它抗原呈遞細(xì)胞來測定?？蛇x，抗-組成部分抗體可用于確定所述組成部分結(jié)合的細(xì)胞以確定其對樹突細(xì)胞的選擇性。
樹突細(xì)胞是高度有效的抗原呈遞細(xì)胞并顯示作為生理佐劑可有效激發(fā)預(yù)防性和治療性免疫力。它們捕獲進(jìn)入外周粘膜組織的微生物然后遷移到次級淋巴器官，其中它們呈遞這些抗原形式的微生物以使得T細(xì)胞靜息由此啟動獲得性免疫反應(yīng)。
選擇性結(jié)合樹突細(xì)胞的組成部分也可是任何適宜組成部分。具體地，已知樹突細(xì)胞呈遞表面抗原，通常是受體，其被選擇性表達(dá)并用作樹突細(xì)胞的靶。由此，方便地，所述組成部分結(jié)合其本身在樹突細(xì)胞上選擇性表達(dá)的受體。通常，在樹突細(xì)胞上選擇性表達(dá)的受體是這樣的受體，其以超過其它抗原呈遞細(xì)胞10倍的水平，優(yōu)選100倍，或更優(yōu)選1000倍的水平存在。
優(yōu)選所述組成部分結(jié)合樹突細(xì)胞上的模式識別受體。模式識別受體是結(jié)合與分子模式相關(guān)的病原體的受體。通常，模式識別受體是結(jié)合外源凝集素(lectin)的受體。適宜模式識別受體包括DC-SIGN，DEC-205(見，例如，Steinman et al(1997)Immunol.Rev.156，25-37)和TOLL-樣受體(見，例如，Werling & Jungi(2003)Vet.Immunol.Immunopathol.91，1-12)。更優(yōu)選，所述組成部分結(jié)合細(xì)胞特異性細(xì)胞間粘附分子3-抓握型(grabbing)非整聯(lián)蛋白C-型外源凝集素，DC-SIGN，其在樹突細(xì)胞上高表達(dá)。DC-SIGN有時也稱CD209。
DC-SIGN是II型跨膜蛋白，其形成N末端細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，跨膜結(jié)構(gòu)域，頸區(qū)，串聯(lián)重復(fù)區(qū)域，和在其C末端的C型(鈣依賴性)甘露糖結(jié)合型外源凝集素結(jié)構(gòu)域。人和鼠DC-SIGN通過存在真皮、粘膜組織諸如直腸、子宮和宮頸的固有層以及扁桃腺、淋巴結(jié)和脾的T細(xì)胞區(qū)中的樹突細(xì)胞表達(dá)。人DC-SIGN具有404個氨基酸。
DC-SIGN已經(jīng)在人，黑猩猩(chimp)，大猩猩(gorilla)，獼猴中發(fā)現(xiàn)，其中編碼所述多肽的cDNA已經(jīng)被克隆。DC-SIGN的cDNA和氨基酸序列見于以下GenBank登錄號AF391086(獼猴(Macaca mulattoa))，AY078913(大猩猩(Pan troglodytes))，NM_021155(人)和NM_133238(小鼠(Mus))。

圖1顯示牛DC-SIGN的一種變體的cDNA序列。變體1牛DC-SIGN的推定的氨基酸序列，與黑猩猩，獼猴和人的DC-SIGN比對，顯示于圖3。圖6顯示牛DC-SIGN的第二種變體的部分cDNA序列。變體2牛DC-SIGN的推定的氨基酸序列與小鼠，人和變體1牛DC-SIGN的比對顯示于圖7。(見實施例7中關(guān)于cDNA克隆的詳述)。
人，小鼠和牛(變體2)DC-SIGN的SMART蛋白結(jié)構(gòu)域分析顯示，所述蛋白質(zhì)共享結(jié)構(gòu)同源性，每種含有C型外源凝集素受體基序。人DC-SIGN中，推定的C-外源凝集素結(jié)構(gòu)域位于殘基256和378之間；小鼠中，推定的C-外源凝集素結(jié)構(gòu)域位于殘基108和229之間；牛(變體2)DC-SIGN中，推定的C-外源凝集素結(jié)構(gòu)域位于殘基129和248之間。
據(jù)信DC-SIGN在樹突細(xì)胞表面選擇性表達(dá)并且由于其在免疫系統(tǒng)中的作用據(jù)信在物種之間保守。由此，當(dāng)通過圖示中的計算機程序評估時，例如編碼人和小鼠DC-SIGN的氨基酸序列的cDNA共享44％的序列相似性。
由此，DC-SIGN I包括任何這樣的蛋白質(zhì)，其cDNA編碼與圖2所示的人或小鼠核苷酸序列具有至少40％相似性的多肽序列。
此外，DC-SIGN分子通常是能夠結(jié)合ICAM-3或ICAM家族的其它成員的分子，所述結(jié)合可通過例如Geijtenbeek et al(2002)J.Biol.Chem.277，11314-11320所述確定。
以下文獻(xiàn)描述了DC-SIGN與HIV-1或ICAM-3之間的相互作用，并且均包含在本文作為參考Geijtenbeek et al(2002)J.Leukoc.Biol.71，921-931；Geijtenbeek et al(2002)J.Biol.Chem.277，11314-11320；Geijtenbeeket al(2000)Cell 100，575-585；和Kooyk & Geijtenbeek(2002)Immunol.Rev.186，47-56。
此外，本發(fā)明包括任何這樣的蛋白質(zhì)，其多肽由在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與GenBank登錄號AF391086，AY078913，NM 021155或NM 133238的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼。
“嚴(yán)謹(jǐn)條件”指在6xSSC、60℃雜交至少1小時，并隨后在2xSSC中、60℃洗滌30分鐘。1xSSC是0.15M NaCl/0.015M檸檬酸鈉。
本發(fā)明還涉及任何與人或小鼠DC-SIGN免疫交叉反應(yīng)的蛋白。通常這可利用多克隆人或小鼠DC-SIGN抗血清評估。
優(yōu)選所述選擇性結(jié)合樹突細(xì)胞的部分是蛋白質(zhì)。
所述化合物通常用于動物接種。通常，選擇性結(jié)合的組成部分是全部或部分對于動物而言外源或外來的分子。其可來自另一種動物，諸如人，并可以是在所述動物中具有免疫原性，并導(dǎo)致抗體反應(yīng)。因此，可見不僅選擇性結(jié)合的組成部分將抗原靶向樹突細(xì)胞，其自身也將導(dǎo)致免疫(抗體)反應(yīng)，其作為接種標(biāo)記物。此外，選擇性結(jié)合的組成部分也可在免疫系統(tǒng)中起刺激作用，通常通過引發(fā)Th1反應(yīng)，由此起佐劑的作用。
各種部分已知結(jié)合DC-SIGN包括結(jié)核分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)的LAM蛋白(見例如，Tailleux et al(2003)J.Exp.Med.197，1-5)，埃博拉病毒(Ebola virus)的糖蛋白，HIV-1包膜糖蛋白gp120(見例如，Geijtenbeek et al(2002)J.Biol.Chem.277，11314-11320)。優(yōu)選所述結(jié)合組成部分能以高親合力結(jié)合DC-SIGN。應(yīng)理解這些分子僅有一部分需要有效結(jié)合樹突細(xì)胞。所述部分包含在“結(jié)合樹突細(xì)胞的組成部分”這一術(shù)語中。但優(yōu)選，如果所有或基本上所有分子用作結(jié)合組成部分。
優(yōu)選所述選擇性結(jié)合樹突細(xì)胞的組成部分是HIV-1包膜糖蛋白gp120。在天然存在的感染的條件下，DC-SIGN介導(dǎo)樹突細(xì)胞進(jìn)行的HIV自粘膜表面(暴露于HIV的位點)到二級淋巴器官(HIV感染位點)的轉(zhuǎn)移。所述轉(zhuǎn)移可發(fā)生數(shù)天，其間HIV被保護(hù)不被降解并保持其感染力。一種可能的機制是通過結(jié)合DC-SIGN時的HIV胞吞作用(endocytosis)，僅僅為了回到細(xì)胞表面在到達(dá)淋巴結(jié)的樹突細(xì)胞之后并與T細(xì)胞作用。該內(nèi)化假設(shè)通過兩種有效的胞吞基序LL和YXXL在DC-SIGN的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中的存在支持。這些基序介導(dǎo)胞吞并在各種背景中循環(huán)。結(jié)合于DC-SIGN并在293T細(xì)胞中短暫表達(dá)的HIVE保持其感染力數(shù)天，但對胰蛋白酶處理敏感。這是表達(dá)DC-SIGN的293T細(xì)胞不能胞吞HIV-1的原因。但HIV-1內(nèi)化可能是樹突細(xì)胞中HIV-1保護(hù)的重要機制。
LL和YXXL基序在物種間保守，這是由于已經(jīng)在小鼠中發(fā)現(xiàn)人DC-SIGN分子同系物含有這些基序。
由于HIV-1與表達(dá)在樹突細(xì)胞上的DC-SIGN初次結(jié)合由其gp129包膜蛋白介導(dǎo)，并且由于HIV攝取，轉(zhuǎn)運和傳染到T細(xì)胞中DC-SIGN的重要性，連接gp120的抗原可用于直接高效靶向樹突細(xì)胞，由此提供本發(fā)明所述新的接種方法的實例。
因此，利用HIV gp120蛋白的靶向DC-SIGN將(a)刺激宿主內(nèi)在免疫反應(yīng)，通過靶向最有效的抗原呈遞細(xì)胞，由此有效限制疫苗應(yīng)用數(shù)目，每種疫苗需要的量，以及消除抗生素殘余物或抗性細(xì)菌菌株過長的恐懼；和(b)通過利用例如可購得的檢測系統(tǒng)分析對HIV gp120分子(在接種的動物中不天然存在的蛋白)的抗體反應(yīng)，使得區(qū)分接種的和天然感染的動物。
本發(fā)明具體也包括，用于接種動物的化合物，其包含(i)HIV gp120，結(jié)核分支桿菌的LAM蛋白或埃博拉病毒的糖蛋白，或其部分中的任意一種，和(ii)抗原。
優(yōu)選，其部分可結(jié)合樹突細(xì)胞，具體是DC-SIGN。通常其部分長度超過10個氨基酸，更通常長度超過15，20，25，30，40，50，60或70個氨基酸殘基。
盡管分支桿菌LAM蛋白結(jié)合DC-SIGN由此可用于實施本發(fā)明，將理解一些活動范圍自由的動物諸如牛，綿羊，馬，鹿，等與分支桿菌接觸并可被它們感染。因此，當(dāng)動物是活動范圍自由的動物時(或其它可被分支桿菌感染的動物)，優(yōu)選分支桿菌LAM蛋白不用作結(jié)合樹突細(xì)胞的組成部分，。
優(yōu)選，所述化合物是結(jié)合樹突細(xì)胞后被樹突細(xì)胞胞吞的化合物。
“抗原”包括任何這樣的組成部分，起可激發(fā)免疫反應(yīng)(無論是體液或細(xì)胞介導(dǎo)的)，例如通過產(chǎn)生抗體和CD8介導(dǎo)的和NK細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)。所述抗原可指單個分子或抗原分子的同源或異源群體。各種大分子可作為抗原，包括所有蛋白(如果存在正確的背景中)，包括核蛋白，脂蛋白，大多數(shù)多糖(具體是大的多糖)，以及各種小分子(通常稱為半抗原)，條件是它們附著于蛋白質(zhì)或多肽或其它載體。術(shù)語“半抗原”也包括多價抗原分子，其具有多個表位，或單價抗原分子，其具有僅僅一個表位。
在疫苗制備的背景中，抗原是分子或其部分或其變體，與疾病相關(guān)。具體地，在動物疫苗的背景中，所述抗原是分子，或其部分，與待接種的動物的疾病相關(guān)?？乖c涉及病原體的疾病相關(guān)，具體是感染性疾病，并且其具體優(yōu)選所述抗原是病原體的組成部分的抗原或免疫原部分，諸如感染性微生物。
病原體包括與以下疾病相關(guān)的那些口蹄疫(foot and mouth disease)，豬皰疹病(swine vesicular disease)，peste des petits ruminants，皺皮病(lumpy skindisease)，藍(lán)舌病(bluetongue)，非洲馬病(African horse sickness)，經(jīng)典豬霍亂(classical swine fever)，新城疫(Newcastle disease)，皰疹性口炎(vesicularstomatitis)，牛瘟(rinderpest)，傳染性牛胸膜肺炎(contagious bovinepleuropneumonia)，立夫特山谷熱(Rift Valley fever)，綿羊痘(sheep pox)和山羊痘(goat pox)，非洲豬瘟(African swine fever)和高致病性禽流感(highlypathogenic avian influenza)。這些是傳染性疾病，其播散可能非常嚴(yán)重且迅速，而不考慮國界，導(dǎo)致非常嚴(yán)重的社會經(jīng)濟(jì)或公共健康后果，由此在動物和動物產(chǎn)品的國際貿(mào)易中非常重要，是A列OIE疾病(Office Internationaldes Epizooties；www.oie.int)。
病原體還包括與以下疾病相關(guān)的那些多物種疾病包括炭疽病(anthrax)，奧耶斯基氏病(Aujeszky’s disease)，棘球蚴病(echinococcosis)/包蟲病(hydatidosis)，牛羊水心胸病(heartwater)，鉤端螺旋性病(leptospirosis)，新世界螺旋蟲(new world screwworm)(錐形蛆蠅(Cochliomyia hominivorax))，舊世界螺旋蟲(old world screwworm)(Chrysomya bezziana)，類結(jié)核病(paratuberculosis)，Q熱(Q fever)，狂犬病(rabies)，旋毛蟲病(trichinellosis)；牛疾病包括牛邊蟲病(anaplasmosis)，牛巴貝蟲病(bovine babesiosis)，牛布魯氏桿菌病(bovine brucellosis)，牛包囊蟲病(bovine cysticercosis)，牛生殖器彎曲菌病(bovine genital campylobacteriosis)，牛海綿樣腦病(bovine spongiformencephalopathy)，牛結(jié)核(bovine tuberculosis)，潛蚤病(dermatophilosis)，地方性牛造白細(xì)胞組織增生(enzootic bovine leucosis)，出血性敗血病(haemorrhagic septicaemia)，感染性牛鼻氣管炎(infectious bovinerhinotracheitis)/感染性膿性外陰陰道炎(infectious pustular vulvovaginitis)，惡性卡它熱(malignant catarrhal fever)，泰累爾梨漿蟲病(theileriosis)，trichomonosis，錐蟲病(trypanosomosis)(tsetse-borne)；綿羊和山羊疾病包括公羊和母羊布魯氏桿菌病(caprine and ovine brucellosis)(排除(B.ovis))，羊關(guān)節(jié)炎/腦炎(caprine arthritis/encephalitis)，傳染性無乳(contagious agalactia)，傳染性羊胸膜肺炎(contagious caprine pleuropneumonia)，地方性母羊流產(chǎn)(enzootic abortion of ewes)(綿羊衣原體病(ovine chlamydiosis))，maedi-visna，Nairobi綿羊病，羊附睪炎(ovine epididymitis)(羊布(魯)氏菌(Brucella ovis))，綿羊肺腺瘤病(ovine pulmonary adenomatosis)，沙門氏菌病(salmonellosis)(S.abortusovis)，羊瘙癢病(scrapie)；馬疾病包括傳染性馬類性病(contagiousequine metritis)，馬錐蟲馬類性病(dourine)，地方性淋巴血管炎(epizooticlymphangitis)，馬腦脊膜炎(equine encephalomyelitis)(東方和西方)，馬感染性貧血(equine infectious anaemia)，馬流感(equine influenza)，馬巴貝蟲病(equine piroplasmosis)，馬鼻肺炎(equine rhinopneumonitis)，馬病毒性動脈炎(equine viral arteritis)，鼻疽病(glanders)，馬疥瘡(horse mange)，馬痘(horsepox)，日本腦炎(Japanese encephalitis)，惡性貧血癥(surra)(伊氏錐蟲(Trypanosoma evansi))，委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎(Venezuelan equineencephalomyelitis)；豬疾病包括豬萎縮性鼻炎(atrophic rhinitis of swine)，腸道病毒腦脊膜炎(enterovirus encephalomyelitis)，豬布魯氏桿菌病(porcinebrucellosis)，豬包囊蟲病(porcine cysticercosis)，豬生殖和呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome)，傳染性胃腸炎(transmissiblegastroenteritis)；和兔類疾病包括粘液瘤變性(myxomatosis)，兔出血疾病(rabbit haemorrhagic disease)和土拉菌病(tularemia)。
這些是一些OIE的B列疾?。徊⑶沂潜徽J(rèn)為在國家內(nèi)具有社會經(jīng)濟(jì)學(xué)和/或公共健康重要性有一些OIE的B列疾??；并且是傳染性疾病，其被認(rèn)為在國家中具有社會-經(jīng)濟(jì)學(xué)和/或公共健康重要性，并且在國際動物和動物產(chǎn)品貿(mào)易中有意義。
具體的病原體包括口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus)，F(xiàn)eLV(貓白血病病毒(feline leukaemia virus))，F(xiàn)IV(貓免疫缺陷病毒(felineimmunodeficiency virus))，CDV(犬瘟熱病毒(canine distemper virus))，細(xì)小病毒(Parvovirus)，冠狀病毒(coronavirus)，牛呼吸道合胞病毒(bovinerespiratory syncytial virus)和牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhoea virus)。
但是，此外，與疾病相關(guān)但不一定與病原體相關(guān)的疾病包括例如癌癥，其中腫瘤抗原與所述疾病相關(guān)。通常，腫瘤抗原是蛋白質(zhì)，其在癌癥中異常過表達(dá)，或其以異常的例如突變的形式在癌癥中表達(dá)。
朊病毒或其部分是可用于實施本發(fā)明的抗原，并據(jù)信與病原體生物體相關(guān)。軟病毒與海綿狀腦病諸如牛海綿狀腦病(BSE)和羊瘙癢病相關(guān)。
用于本發(fā)明背景中的疫苗抗原包括生物體的抗原或免疫原性成分，諸如病毒，細(xì)菌，真菌和寄生蟲包括蠕蟲(helminth)或所述成分的一部分，意圖防止動物中的疾病或提供針對動物中疾病的保護(hù)。
適宜抗原包括，例如牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)E2蛋白，牛白血病病毒gp51蛋白，和呼吸道合胞病毒(RSV)F或G蛋白。這些蛋白的氨基酸序列在病毒基因組中編碼。病毒基因組的GenBank保藏號是NC_001781(人RSV)，NC_001989(牛RSV)，AF033818(牛白血病病毒)，AF091605(I型BVDV)和AF145967(II型BVDV)。
其它適宜的疾病相關(guān)抗原可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇，且通常對于許多這種抗原而言，它們的氨基酸和cDNA序列可得自GenBank。
所述抗原通常是與疾病相關(guān)的多肽的全部或一部分，諸如病原體或腫瘤抗原的多肽部分。多肽的一部分可以是多肽的任何部分，其能激發(fā)免疫反應(yīng)諸如抗體反應(yīng)。已知具有至少5個氨基酸的肽可激發(fā)抗體反應(yīng)，但是通常使用較大的抗原。因此，當(dāng)抗原是多肽時，其可具有至少5個氨基酸，通常5-1000個氨基酸，諸如5-500，5-200，5-100，5-50，5-40，5-30，5-20，例如5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20個氨基酸。
將理解本發(fā)明的化合物的抗原可以是與疾病相關(guān)的分子的變體，條件是其可激發(fā)針對疾病起保護(hù)作用的免疫反應(yīng)。所述變體包括與所述疾病相關(guān)的天然抗原相比具有一或多個氨基酸取代，多至5％的取代的多肽。通常，所述取代是保守取代，其中例如“變體”指其中一或多個位置具有氨基酸插入，缺失或取代(保守或非保守的)的蛋白，條件是所述改變導(dǎo)致基本性質(zhì)例如酶活性(活性種類和比活性)，熱穩(wěn)定性，具體pH范圍內(nèi)的活性(pH穩(wěn)定性)沒有明顯改變?！懊黠@”在本文意指本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為所述變體的性質(zhì)可不同但對于原始蛋白而言并非不明顯。
“保守取代”意指組合諸如Gly，Ala；Val，Ile，Leu；Asp，Glu；Asn，Gln；Ser，Thr；Lys，Arg；和Phe，Tyr。
所述變體利用蛋白工程和定點誘變的標(biāo)準(zhǔn)方法制備。
優(yōu)選選擇性結(jié)合樹突細(xì)胞部分與抗原共價相連。當(dāng)所述部分和抗原分別為多肽的情況下，所述兩個部分可通過常規(guī)多肽交聯(lián)方法之一連接在一起。例如，本發(fā)明的化合物的兩個部分可通過常規(guī)多肽交聯(lián)方法之一連接在一起，諸如O’Sullivan et al Anal.Biochem.(1979)100，100-108中所述。例如，第一部分可富含硫醇基團(tuán)，第二部分與能與這些硫醇基團(tuán)反應(yīng)的雙功能試劑反應(yīng)，例如碘乙酸的N-羥基琥珀酰亞胺酯(hydroxysuccinimide ester)(NHIA)和N-琥珀酰亞胺基(succinimidyl)-3-(2-吡啶基二硫代(pyridyldithio))丙酸酯(SPDP)，異源雙功能交聯(lián)劑，其在偶聯(lián)的物質(zhì)之間摻入二硫橋。利用m-馬來酰亞氨苯甲?；?maleimidobenzoyl)-N-羥基琥珀酰亞胺酯獲得的酰胺和硫醚鍵，通常在體內(nèi)比二硫鍵更為穩(wěn)定。
其它有用的交聯(lián)劑包括S-乙?；虼掖妓?acetylthioglycolic acid)N-羥基琥珀酰亞胺酯(SATA)，其為伯胺的硫醇化試劑，允許在溫和條件下的巰基去保護(hù)(Julian et al(1983)Anal.Biochem.132，68)，二甲基suberimidate二氫氯化物(dimethylsuberimidate dihydrochloride)和N，N′-o-亞苯基馬來酰亞胺(phenylenedimaleimide)。
可選，所述化合物可作為融合化合物(或融合多肽)通過重組DNA技術(shù)制備，由此一定長度的DNA包含編碼所述結(jié)合樹突細(xì)胞組成部分的多肽部分的各個區(qū)域，以及相互鄰近或通過編碼連接肽的區(qū)域分離的抗原，所述連接肽不破壞該化合物的所需性質(zhì)。
本文所用融合多肽是含有結(jié)合融合于作為本發(fā)明化合物抗原的多肽的N末端或C末端的樹突細(xì)胞的組成部分的多肽部分。獲得所述融合多肽的簡單方法是翻譯多核苷酸序列即雜合基因的框內(nèi)融合物。編碼融合多肽的雜合基因被插入用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的表達(dá)載體。轉(zhuǎn)錄和翻譯控制區(qū)域通常存在于表達(dá)載體中。DNA隨后在適宜宿主中表達(dá)以產(chǎn)生包含本發(fā)明第一方面的化合物。
將理解所述抗原包括兩種或多種與動物的疾病相關(guān)的分子或所述分子的一部分或變體。
由此，本發(fā)明的化合物可用于針對一種以上的疾病進(jìn)行接種。因此，例如所述化合物可包含來自一種疾病藥劑(例如BVDV的E2多肽或其免疫原性部分)以及來自第二種疾病藥劑的抗原(例如RSV的F蛋白或其免疫原性部分)在相同的多肽鏈中，作為結(jié)合樹突細(xì)胞的部分。其它變異對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是明顯的。
本發(fā)明的第二方面包括編碼本發(fā)明第一方面的融合化合物的核酸分子。
適宜的核酸分子可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員利用本領(lǐng)域已知的方法輕易合成或構(gòu)建，諸如克隆手冊例如Sambrook，J.and Russell，D.(2001)“MolecularCloninga laboratory manual”3rded.Vol 1-3，Cold Spring Harbor LaboratoryPress所述。通常所述核酸是DNA，但其也可為RNA。下文中，如果使用DNA，除非上下文表明相反的意思，也包括RNA。
編碼本發(fā)明第一方面化合物的抗原的DNA序列可通過搜索DNA序列數(shù)據(jù)庫鑒定，諸如GenBank等。編碼適宜抗原的DNA的實例在上文給出。一旦知道編碼所選抗原的DNA序列，其可用于設(shè)計引物和/或特異性分離編碼所述抗原的DNA或cDNA的引物，所述抗原例如來自與待抗擊疾病相關(guān)的病原體。如果已知DNA序列，引物和探針可利用可購得的軟件設(shè)計并通過自動化的合成來合成。通常，編碼所述抗原的DNA序列可分離自由適宜來源產(chǎn)生的cDNA或DNA序列的文庫，諸如所選病原體。篩選所述文庫中的目的DNA序列，利用優(yōu)選在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼所選抗原的已知DNA序列互補的探針。與所述探針雜交的DNA序列可被亞克隆，并且該DNA序列編碼的多肽可通過DNA序列分析和/或通過體外翻譯、表達(dá)、和多肽檢測等測定法證實。但通常編碼抗原的適宜DNA序列可利用PCR和針對克隆區(qū)的5’和3’末端的適宜引物合成，如本領(lǐng)域已知的那樣。
一旦編碼所選抗原的DNA序列被分離，其可操作地連接于編碼結(jié)合樹突細(xì)胞的部分的DNA序列，例如選擇性結(jié)合樹突細(xì)胞的DC-SIGN的HIVgp120。編碼所述抗原的DNA序列和結(jié)合樹突細(xì)胞的組成部分的DNA序列均在同一讀框內(nèi)，可操作連接于轉(zhuǎn)錄和翻譯控制區(qū)。轉(zhuǎn)錄和翻譯控制區(qū)包括啟動子，增強子，順式調(diào)節(jié)元件，多聚腺苷酸序列，轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)域和轉(zhuǎn)錄終止序列。
所述DNA隨后在適宜宿主中表達(dá)以產(chǎn)生作為本發(fā)明第一方面的化合物的多肽。因此，編碼組成本發(fā)明的化合物的多肽的DNA可根據(jù)已知技術(shù)使用，根據(jù)本發(fā)明中的教導(dǎo)進(jìn)行適宜的修飾，以構(gòu)建表達(dá)載體，其用于轉(zhuǎn)化適宜宿主細(xì)胞用于表達(dá)和制備本發(fā)明的多肽。
因此，編碼構(gòu)成本發(fā)明化合物的多肽的DNA可連接于多種其它DNA序列用于導(dǎo)入適宜的宿主。伴隨DNA將有賴于宿主的性質(zhì)，將DNA導(dǎo)入宿主的方式，以及是否需要附加體保持或整合。
通常，所述DNA以適當(dāng)?shù)姆较蚝驼_的表達(dá)讀框被插入表達(dá)載體，諸如質(zhì)粒。如果必要，DNA可連接于適宜的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)控制核苷酸序列，其由適宜的宿主識別，盡管所述控制序列通常在表達(dá)載體中可得。所述載體隨后通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)被導(dǎo)入宿主。通常并非所有宿主將被所述載體轉(zhuǎn)化。因此，必需針對轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞進(jìn)行選擇。一種選擇技術(shù)涉及將DNA序列以及任何必需的控制元件摻入表達(dá)載體，其編碼宿主細(xì)胞中可選擇的性質(zhì)?？蛇x，編碼所述可選擇性質(zhì)的基因可在另一載體上，其可用于共轉(zhuǎn)化所需宿主細(xì)胞。
已經(jīng)被本發(fā)明的重組DNA轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞隨后根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適宜條件下培養(yǎng)足夠的時間，以允許所述多肽的表達(dá)，其隨后被回收。
許多表達(dá)系統(tǒng)是已知的，包括細(xì)菌(例如大腸桿菌(E.coli)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis))，酵母(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))，絲狀真菌(filamentous fungi)(例如曲霉(Aspergillus))，植物細(xì)胞，動物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞。
載體包括原核復(fù)制子，諸如ColE1 ori，用于在原核細(xì)胞中增殖，甚至所述載體用于在其它非原核細(xì)胞類型中表達(dá)。所述載體還可包括適宜啟動子，諸如能夠指導(dǎo)基因在用其轉(zhuǎn)化的細(xì)菌宿主細(xì)胞諸如大腸桿菌中的表達(dá)(轉(zhuǎn)錄和翻譯)的原核啟動子。通常所述載體是可穩(wěn)定整合在宿主細(xì)胞中和/或高表達(dá)所述化合物的載體。適宜載體包括可得自Invitrogen的pcDNA 3.1(+/-His標(biāo)記)。
“啟動子”指DNA序列形成的表達(dá)控制元件，其允許與RNA聚合酶的結(jié)合以及轉(zhuǎn)錄的發(fā)生。與示例性宿主相容的啟動子序列通常在質(zhì)粒載體中提供，其含有方便的限制性位點用于插入本發(fā)明的DNA片段。
本發(fā)明的另一方面提供了用編碼本發(fā)明第一方面的化合物的核酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
具體優(yōu)選用于表達(dá)本發(fā)明化合物的宿主細(xì)胞包括COS和CHO細(xì)胞，其可使得蛋白質(zhì)糖基化?？墒褂么竽c桿菌細(xì)胞，在此情況下，存在所述化合物的終產(chǎn)物中的脂多糖組成部分本身可以是免疫刺激物。這在一些情況中可有益，但在其它情況中不是所需的，其可損害對免疫反應(yīng)的測定。
在允許所述DNA聚合物表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞可常規(guī)進(jìn)行。所述產(chǎn)物可通過常規(guī)方法根據(jù)宿主細(xì)胞和表達(dá)產(chǎn)物的定位(細(xì)胞內(nèi)或分泌入培養(yǎng)基或進(jìn)入細(xì)胞周質(zhì))來回收。因此，如果所述宿主細(xì)胞是細(xì)菌，諸如大腸桿菌，其可例如通過物理、化學(xué)或酶促方法裂解，且蛋白產(chǎn)物可分離自產(chǎn)生的裂解物。如果所述宿主細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞，所述產(chǎn)物通?？煞蛛x自培養(yǎng)基或分離自細(xì)胞游離提取物。如果所述宿主細(xì)胞是酵母，諸如釀酒酵母或巴氏畢赤酵母，所述產(chǎn)物通?？煞蛛x自裂解的細(xì)胞或培養(yǎng)基，然后利用常規(guī)方法進(jìn)一步純化。表達(dá)系統(tǒng)的特異性可通過western印跡利用針對目的多肽的抗體來評估。
常規(guī)蛋白分離技術(shù)包括選擇性沉淀吸收層析，和親合層析，包括單克隆抗體親和柱。
將理解本發(fā)明可輕易提供“盒式表達(dá)(cassette expression)”載體，其中產(chǎn)生含有編碼結(jié)合樹突細(xì)胞的部分的序列，諸如HIV-1 gp120，其可輕易融合于所選抗原的編碼區(qū)，所述編碼區(qū)被插入盒式表達(dá)載體的適宜位置。
因此，本發(fā)明的另一方面提供核酸分子，其包含(i)編碼選擇性結(jié)合樹突細(xì)胞的組成部分的部分和(ii)用于插入編碼抗原的多核苷酸的插入點，其中當(dāng)所述多核苷酸被插入所述插入點時，所述核酸分子編碼本發(fā)明第一方面的化合物的核酸分子。
通常，核酸分子采取表達(dá)載體的形式，其含有適宜轉(zhuǎn)錄和翻譯控制信號以允許一旦抗原編碼區(qū)被插入插入點就表達(dá)融合多肽。如本領(lǐng)域眾所周知，“盒式表達(dá)”載體中的插入點允許插入適宜編碼序列(在本發(fā)明中為編碼抗原的序列)使得產(chǎn)生框內(nèi)融合。通常，所述插入位點是核酸內(nèi)的獨特限制位點。
通常，所述載體可穩(wěn)定整合入宿主細(xì)胞和/或產(chǎn)生所述化合物的高水平表達(dá)。其可方便地基于得自Invitrogen的pcDNA3.1(+/-His tag)載體。
由于所述抗原在其N末端或C末端融合于結(jié)合部分，插入位點可以在編碼所述結(jié)合組成部分的5’或3’末端，轉(zhuǎn)錄和翻譯信號的位置適宜，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知那樣。
本發(fā)明第一方面的化合物可用于針對動物中疾病的免疫或治療。由此，所述化合物可用于疫苗中。
本發(fā)明另一方面提供本發(fā)明第一方面的化合物在藥物中的用途。通常所述化合物被包裝并作為藥物用于動物中。
本發(fā)明另一方面提供包含本發(fā)明第一方面的化合物的疫苗，其優(yōu)選在本發(fā)明的疫苗配制劑中包含佐劑。所述佐劑是適宜的可得的諸如明礬和QuilA。
優(yōu)選所述佐劑組合物誘導(dǎo)主要是Th1型的免疫反應(yīng)。高水平Th1型細(xì)胞因子(例如，IFN-γ，TNFα，IL-2和IL-12)傾向于有利于誘導(dǎo)針對給藥的抗原的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。優(yōu)選，所述化合物可激發(fā)Th1和Th2反應(yīng)。
本發(fā)明另一方面提供包含本發(fā)明第一方面的化合物以及可藥用載體的藥物組合物。
所述載體就與本發(fā)明的化合物相容而言必須是“可接受的”，并且隨其受體無害。通常，所述載體可以是水和鹽水，其無菌或無病原體。然而，可以使用其它可接受的載體。
通常，本發(fā)明的藥物組合物或配制劑可用于胃腸外給藥，更具體用于靜脈內(nèi)給藥。所述組合物或配制劑可通過以下途徑給藥經(jīng)肌內(nèi)，皮下，皮內(nèi)，鼻內(nèi)，靜脈內(nèi)，口服和腹腔內(nèi)。經(jīng)肌內(nèi)是最為優(yōu)選的，因為其為獸醫(yī)的最常用途徑。
適于經(jīng)胃腸外給藥的配制劑包括水性和非水性無菌注射液，其可含有抗氧化劑，緩沖液，抑菌劑和使得配制劑與目的受體血液等張的溶質(zhì)；以及水性和非水性無菌懸液，其可包括懸浮劑和增稠劑。
本發(fā)明也提供針對疾病免疫動物的方法，包括給藥動物本發(fā)明第一方面的化合物的步驟。
將理解給藥的化合物基于以下因素選擇(i)待免疫動物(使得適宜結(jié)合組成部分可被選擇，其對于動物而言是異源的)和(ii)待針對其進(jìn)行免疫的疾病(使得適宜抗原可被選擇)。
因此，本發(fā)明具體優(yōu)選的實施方案是針對疾病免疫動物的方法，包括給藥動物包含以下物質(zhì)的化合物(i)選擇性結(jié)合所述動物中的樹突細(xì)胞但不天然存在所述動物中的組成部分，和(ii)與所述疾病相關(guān)的抗原。
所述方法盒組合物可針對免疫和保護(hù)動物，優(yōu)選有經(jīng)濟(jì)學(xué)重要性的動物，包括農(nóng)場動物諸如母牛，綿羊，山羊，豬，馬和兔，和家養(yǎng)動物，諸如貓和狗。根據(jù)使用的抗原的類型，利用這些抗原免疫動物可導(dǎo)致預(yù)防感染，緩解癥狀，死亡率降低和/或中和抗體的誘導(dǎo)。
因此，本發(fā)明也可提供對抗動物中的疾病的方法，包括給藥動物本發(fā)明第一方面的化合物。
具體優(yōu)選的實施方案是對抗動物中的方法，包括給藥動物包含以下物質(zhì)的化合物的步驟(i)選擇性結(jié)合所述動物中的樹突細(xì)胞但不天然存在所述動物中的組成部分和(ii)與所述疾病相關(guān)的抗原。
通常所述化合物作為免疫原性組合物給藥。
可利用本發(fā)明的方法對其進(jìn)行免疫或?qū)沟募膊“˙VDV，RSV和牛白血病病毒，適宜抗原可選自例如BVDV E2蛋白，RSV F和G蛋白和牛白血病病毒gp51。因此，本發(fā)明的化合物可用于預(yù)防或治療。
通常待治療的疾病是病原體引起的疾病。然而，腫瘤也可被治療。
可利用本發(fā)明的方法治療的腫瘤包括黑素瘤(見例如，Nestle，F(xiàn).O.(2002)Clinical & Experimental Dermatology 27(7)，597-601)。通常，可能需要一種以上抗原以起效。這些可在同一化合物中組合用于免疫或在所述化合物中分離存在。通常，所述抗原可為突變的抗原(例如MAGE-1，MAGE-3和NY-ESO-1)，分化抗原(例如酪氨酸酶，gp100和MelanA/MART-1)或細(xì)胞表面神經(jīng)節(jié)苷脂(例如GM2，GD2和GD3)，如上文Nestle(2002)所述。
術(shù)語“腫瘤”理解為指所有腫瘤細(xì)胞生長形式，包括肺、肝、血細(xì)胞、皮膚、胰腺、胃、結(jié)腸、前列腺、子宮、乳腺、淋巴腺和膀胱的腫瘤。實體腫瘤尤其適合。
本發(fā)明的其它方面提供本發(fā)明第一方面的化合物在制備用于對抗動物中的疾病的藥物中的用途；和在制備用于免疫動物的疫苗中的用途。
具體優(yōu)選的實施方案包括化合物在制備用于對抗動物中的疾病的藥物中的用途，所述化合物包括(i)選擇性結(jié)合動物中的樹突細(xì)胞但不天然存在所述動物中的組成部分和(ii)與所述動物中的疾病相關(guān)的抗原；以及所述化合物在制備免疫動物的疫苗中的用途，所述疫苗包括(i)選擇性結(jié)合動物中的樹突細(xì)胞但不天然存在所述動物中的組成部分，和(ii)與所述動物中的疾病相關(guān)的抗原。
本發(fā)明具體包括化合物用于接種動物的用途，其中包括(i)選自HIVgp120，結(jié)核分支桿菌的LAM蛋白或埃博拉病毒的糖蛋白，或其部分之一的組成部分，和(ii)抗原在制備用于對抗與所述抗原相關(guān)疾病和用于制備針對與所述抗原相關(guān)的疾病免疫動物的疫苗中的用途。
利用本發(fā)明方面接種的動物可與由與本發(fā)明的化合物的抗原相關(guān)的疾病因素天然感染的動物區(qū)分，這是由于被接種的動物將具有針對結(jié)合樹突細(xì)胞的組成部分的免疫反應(yīng)，所述組成部分結(jié)合樹突細(xì)胞而天然感染的動物不會。
因此，本發(fā)明的另一方面提供測定動物是否接受本發(fā)明第一方面的化合物的方法，所述方法包括測定所述動物是否對選擇性結(jié)合樹突細(xì)胞的組成部分有免疫反應(yīng)。測定動物中是否存在對所述化合物中的抗原的免疫反應(yīng)也是有用的。
通常，含有抗體的樣品取自動物，并測定是否存在針對所述組成部分的抗體。針對所述抗原的抗體是否存在也可被確定。通常，所述樣品是血液樣品。通常所述血液樣品獲自動物的頸靜脈或尾靜脈。
本發(fā)明還提供包含多個部分的試劑盒，其可用于區(qū)分天然感染的動物以及給予了本發(fā)明第一方面的化合物的動物。
一種包含多個部分的試劑盒，包括(i)本發(fā)明第一方面的化合物和(ii)檢測對存在選擇性結(jié)合樹突細(xì)胞的化合物中的組成部分的免疫反應(yīng)的裝置，和/或(iii)檢測對所述化合物中的抗原的免疫反應(yīng)的裝置。
另一種包含多個部分的試劑盒，包括(i)用于檢測對動物疾病抗原的免疫反應(yīng)的裝置和(ii)用于檢測對選擇性結(jié)合樹突細(xì)胞的組成部分的免疫反應(yīng)的裝置。
優(yōu)選實施方案中，所述結(jié)合組成部分是HIV-1 gp120，或其一部分。
通常免疫反應(yīng)通過測定來自動物的樣品是否含有適宜抗體(即所述抗原和/或結(jié)合部分的抗體)來檢測。
因此，檢測免疫反應(yīng)的適宜裝置包括利用ELISA檢測抗體反應(yīng)。用于檢測gp120的抗體反應(yīng)的ELISA裝置可購得，例如購自AdvancedBioSciences Laboratories Ltd or ImmunoDiagnostics Inc。
本發(fā)明所有引用的文獻(xiàn)的全文內(nèi)容包含在此作為參考。說明書中的討論部分或已經(jīng)公開的文獻(xiàn)的不應(yīng)被認(rèn)為是認(rèn)同本發(fā)明是現(xiàn)有技術(shù)的一部分或是已知技術(shù)。
本發(fā)明還將參考以下圖和實施例更詳細(xì)描述。
圖1顯示編碼牛DC-SIGN變體1的部分cDNA序列(SEQ ID No.1)。字母“n”表示四種天然存在核苷酸A，G，C或T之一。
圖2顯示利用自Scientific and Educational Software購得的SE中心序列分析包(Central sequence analysis package)(Align Plus and Clone Manager)，對編碼黑猩猩、大猩猩(Pan)、人、獼猴和小鼠的DC-SIGN的cDNA序列的比對(分別為SEQ ID No.2-5)。
給出所述比對、參數(shù)和背景。短線表示沒有核苷酸。
圖3顯示牛DC-SIGN變體1(SEQ ID No.6)的推定的部分氨基酸序列與黑猩猩，人和獼猴DC-SIGN的氨基酸序列(SEQ ID Nos.7-9)的比對。短線表示沒有核苷酸。牛DC-SIGN氨基酸序列中的星號是沒有分配的(unallocated)氨基酸。所述比對利用SE中心序列分析包進(jìn)行。比對參數(shù)為相對于參比分子的整體蛋白比對；參數(shù)評分矩陣(scoring matrix)BLOSUM 62；參比分子推定的boDC-SIGN，區(qū)1-577；與比對4的序列數(shù)。推定的boDC-SIGN 192氨基酸；黑猩猩_DC-SIGN 404氨基酸；huDC_SIGN_CDS405氨基酸；獼猴(mulatto)_CDS 405氨基酸。
圖4圖示HIV gp120-FITC與牛DC的結(jié)合。細(xì)胞或者未經(jīng)處理或在4℃或37℃用gp120-FITC保溫60分鐘并通過流式細(xì)胞術(shù)分析。
圖5顯示利用針對人DC-SIGN分子的多克隆抗體，人單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞，人單核細(xì)胞衍生的樹突細(xì)胞和牛單核細(xì)胞衍生的樹突細(xì)胞的染色模式。
圖6顯示編碼牛DC-SIGN，變體2的部分cDNA序列(SEQ ID No.10)。
圖7顯示人DC-SIGN，鼠DC-SIGN，和牛DC-SIGN的兩種變體(分別為SEQ ID No.11-14)的氨基酸序列的CLUSTAL W(1.7)比對。短線指示沒有匹配殘基。
實施例實施例1gp120蛋白結(jié)合牛細(xì)胞DC-SIGN的能力已經(jīng)通過流式細(xì)胞術(shù)顯示HIV gp120-FITC蛋白(Cat No 1021-F和1001-F，Immuno Diagnostic Inc.，Woburn，USA)結(jié)合牛DC。在4℃保溫HIVgp120-FITC 1小時誘導(dǎo)低水平的結(jié)合，但所述結(jié)合在37℃保溫時增加(圖4)。
此外，利用針對人DC-SIGN激發(fā)的兔抗人多克隆抗體(Dr.T.Geiitenbeck(Department of Molecular Cell Biology，Medical Faculty，Vrije UniversiteitAmsterdam饋贈)，通過激光掃描共聚焦顯微術(shù)顯示，對牛DC的染色(圖5)程度低于人DC(圖5)。
為評估HIV-1gp120蛋白結(jié)合牛細(xì)胞上的DC-SIGN能力，將編碼所述蛋白的cDNA克隆入含有His-tag(即寡聚組氨酸標(biāo)記)的表達(dá)載體。作為對照，使用已知不結(jié)合DC-SIGN的無關(guān)的His-標(biāo)記的蛋白諸如FITC-標(biāo)記的卵清蛋白(OVA)。DC攝取gp120-His后，制備DC培養(yǎng)物并將其分成4組細(xì)胞。第一(試驗性)和第二(對照)組用gp120-His或無關(guān)的His-標(biāo)記的蛋白脈沖2小時并洗滌。第三(陰性對照)組僅僅用生長培養(yǎng)基處理，第四組(攝取對照)用于證實DC吸收FITC-標(biāo)記的抗原(本發(fā)明為OVA)的能力，作為DC攝取所述抗原的能力的功能對照。隨后，所有細(xì)胞的組均用于通過共聚焦熒光顯微術(shù)，利用FITC標(biāo)記的抗His抗體，觀察蛋白的細(xì)胞定位模式。最后，針對牛DC-SIGN分子激發(fā)的多克隆抗體顯示g120-His攝取特異性，其經(jīng)由DC-SIGN通過將DC與這些抗體預(yù)保溫以阻斷DC-SIGN實現(xiàn)。阻斷DC-SIGN應(yīng)減少gp120-His的攝取，但是任何其他分子或?qū)φ站荒堋?br> 此外或可選，為評估gp120蛋白結(jié)合牛細(xì)胞上的DC-SIGN的能力，編碼所述蛋白的cDNA被克隆入含有His標(biāo)記的表達(dá)載體利用RT-PCR以及直接克隆方法利用獲自NIH AIDS試劑程序(reagent program)的構(gòu)建體。產(chǎn)生的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，表達(dá)的蛋白利用分子量截留旋轉(zhuǎn)柱或His標(biāo)記純化柱從細(xì)胞上清和/或細(xì)胞裂解物濃縮。gp120-His的存在通過Western印跡利用抗His抗體評估。為評估牛DC對gp120-His的吸收，制備DC培養(yǎng)物并分成3組細(xì)胞。第一(試驗)和第二(對照)組用gp120-His或源自用空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染2小時并洗滌的COS-7細(xì)胞的上清脈沖。第三組(攝取對照，本發(fā)明為FITC-OVA)將用作功能對照以證實DC攝取抗原的能力(Werling，D et al(1999)J Leukoc Biol 6650-58)。隨后，所述細(xì)胞組用于通過流式細(xì)胞術(shù)和共聚焦熒光顯微術(shù)觀察攝取的蛋白的量或鑒定蛋白的細(xì)胞定位。FITC-標(biāo)記的抗-His抗體用于檢測gp120-His。此外，用人DC-SIGN分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞用作陽性對照。
結(jié)果基于目前對于公開的DC-SIGN序列的相似性，預(yù)期gp120-His將結(jié)合并隨后被牛DC-SIGN分子內(nèi)化，這種結(jié)合/攝取將被多克隆抗體阻斷，而對于所用對照沒有影響。
討論為區(qū)分結(jié)合的和內(nèi)化的gp120-His，可測定細(xì)胞的gp120-His攝取量，細(xì)胞用EDTA-胰蛋白酶溶液處理以降解表面gp120-His，但不被內(nèi)化。由此，細(xì)胞和細(xì)胞質(zhì)提取物可用于通過western印跡分析gp120-His的存在，所述分析利用單克隆抗His-標(biāo)記抗體或直接結(jié)合gp120蛋白。一旦成功攝取gp120-His，gp120與模型抗原(model-antigen)一起表達(dá)(即牛呼吸道合胞病毒包膜蛋白或牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白)，其可用于進(jìn)一步的研究(為了簡便，所述產(chǎn)物稱為gp120-Ag)。
實施例2抗原脈沖的DC對Th1型免疫反應(yīng)的增加的激發(fā)最近的數(shù)據(jù)強調(diào)通過模式識別受體諸如Toll樣受體(TLR)或DC-SIGN的抗原攝取，極強地增強了Th1-型免疫反應(yīng)，IFNα和IL-12通過抗原脈沖的DC釋放。這些細(xì)胞因子的釋放有利于發(fā)展細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力。
一種已知結(jié)合TLR的抗原是呼吸道合胞病毒F蛋白(RSV)，其導(dǎo)致誘導(dǎo)IL-12(Haeberle，HA et al(2002)J Infect Dis 1861199-1206；Haynes，LM et al(2001)J Virol 7510730-10737；和Kurt-Jones，EA et al(2000)Nat Immunol 1398-401)。由于RSV是多種物種包括牛和人的新生兒下呼吸道感染的主要原因，RSV F蛋白將用于這些實驗中作為模型抗原。
含有HIV gp120(在實施例1中產(chǎn)生)，RSV F蛋白(Dr Geraldine Taylor，Institute for Animal Health，Compton饋贈)，gp120/F蛋白的融合蛋白(實施例1中生成)的His標(biāo)記的表達(dá)載體用于感染COS-7細(xì)胞。72小時后，His-標(biāo)記的蛋白利用鎳-瓊脂糖收獲自細(xì)胞上清以及裂解的細(xì)胞，它們的存在通過western印跡利用抗His抗體分析。
為證實gp120-His，F(xiàn)-蛋白-His或gp120-Ag對牛DC的影響細(xì)胞與不同劑量的純化的蛋白保溫2小時。此后，利用ELISA-系統(tǒng)，收集上清并分析IFNα，IL-10和IL-12的存在(Werling，D et al(2004)Immunology 11141-52)。
結(jié)果預(yù)期暴露于gp120-His或gp120-Ag的DC釋放的IFNα和IL-12的量應(yīng)超過暴露相同時間和相同量的gp120-His的外周血淋巴細(xì)胞或巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的量。此外預(yù)期單獨的gp120-His將導(dǎo)致產(chǎn)生IL-10，F(xiàn)-蛋白-His將導(dǎo)致主要產(chǎn)生IL-12，gp120-Ag將導(dǎo)致IL-12的非常強的釋放。
實施例3通過DC刺激初始T細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞諸如巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞相反(APC)，DC具有獨特的刺激初始T細(xì)胞和刺激強得多的記憶T細(xì)胞反應(yīng)的能力(Werling et al(1999)；Werling，D et al(2002)J Leukoc Biol 72297-304)。為評估Tgp120-Ag脈沖的DC的刺激能力，以及它們是否能刺激初始以及記憶T細(xì)胞，產(chǎn)生不同的APC亞組(Werling et al(2002)并與gp120-Ag保溫不同時間(0-6h)。該時間以后，DC通過暴露于絲裂霉素D滅活，并以各種量比加入來自相同供體的經(jīng)分選的CD4+T細(xì)胞。培養(yǎng)5天后，通過液閃技術(shù)，利用beta計數(shù)儀，gp120-Ag脈沖的DC，巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞的刺激能力通過測定[3H]-標(biāo)記的胸腺嘧啶在增殖T細(xì)胞的DNA中的摻入來測定。
類似的試驗利用APC和T細(xì)胞進(jìn)行，產(chǎn)生自BRSV免疫的牛，由此評估APC亞組刺激記憶T細(xì)胞反應(yīng)的性質(zhì)(經(jīng)免疫的動物由Dr Geraldine Taylor，Institute for Animal Health，Compton提供)。
結(jié)果預(yù)期強T細(xì)胞增殖僅僅在存在DC是觀察到，而不見于巨噬細(xì)胞或B細(xì)胞(其顯示低10倍的反應(yīng))。
也預(yù)期當(dāng)與來自BRSV免疫的動物的T細(xì)胞共培養(yǎng)時，僅僅用gp120-Ag脈沖的DC將刺激初始T細(xì)胞的增殖并且其誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)強于其它APC誘導(dǎo)的10倍。
實施例4DC-SIGN胞吞作為HIV-1結(jié)合的結(jié)果在人系統(tǒng)中，DC-SIGN的胞吞作為HIV-1結(jié)合的結(jié)果降低DC表面上的DC-SIGN分子數(shù)。特異性單克隆抗DC-SIGN抗體在小鼠中通過標(biāo)準(zhǔn)方法激發(fā)或克隆抗DC-SIGN抗體在兔中通過標(biāo)準(zhǔn)方法激發(fā)，并檢測它們是否影響gp120-Ag或gp120-His與DC-SIGN的結(jié)合。非干擾型抗體和熒光標(biāo)記的第二抗小鼠抗體用于定量DC表面的DC-SIGN表達(dá)(用gp120-Ag培養(yǎng)基或空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞上清脈沖，作為陰性對照)，其利用熒光活化的細(xì)胞分選(FACS)進(jìn)行。所述測定在類似的DC組上在用gp120-Ag或gp120-His脈沖2小時以后重復(fù)(實驗組)。足量的gp120-Ag應(yīng)用于增加DC-SIGN結(jié)合以及內(nèi)化的可能性。
結(jié)果如果試驗組中表面DC-SIGN的量類似于對照組的，預(yù)期很可能不出現(xiàn)明顯的DC-SIGN胞吞，由此支持DC-SIGN結(jié)合抗原被保護(hù)而不被降解并且不被加工的理論。如果表面DC-SIGN表達(dá)在gp120-Ag結(jié)合時降低，DC-SIGN很可能被DC胞吞，由此將被隨后遞送到細(xì)胞內(nèi)的胞吞隔室，其允許加工蛋白用于隨后經(jīng)由MHC II類(和MHC I類)分子呈遞給T細(xì)胞。這將導(dǎo)致T細(xì)胞的隨后的增殖反應(yīng)。
需要胞吞出現(xiàn)以使得免疫反應(yīng)出現(xiàn)。
阻斷DC-SIGN應(yīng)減少gp120-His而非其它分子的攝取。
可能有用的對照組包括無表面DC-SIGN的DC，例如作為簡單胰蛋白酶處理的結(jié)果，以及可導(dǎo)致DC-SIGN胞吞的試劑(陽性對照)。
實施例5gp120-Ag免疫在動物中的影響為證實gp120-Ag免疫在動物中的影響，用不同劑量的gp120-Ag免疫牛，并且對抗原諸如F蛋白或gp120的免疫反應(yīng)的出現(xiàn)利用可用于具體Ag的ELISA系統(tǒng)分析。適宜用于gp120和RSV-F蛋白的ELISA系統(tǒng)可購得。四個組的動物用單獨的載體溶液，純化的gp120-His，純化的F-蛋白-His，或gp120-Ag。免疫前后每周取血樣，測定血清樣品中的抗體滴度。
結(jié)果預(yù)期用gp120-Ag免疫的動物將出現(xiàn)對gp120以及目的Ag諸如F蛋白的抗體。為了估計Ag特異性抗體和gp120特異性抗體之間的關(guān)系，用gp120-His免疫的動物的抗體滴度將作為對照，由此確定數(shù)據(jù)以證實gp120-Ag被攝取和呈遞的效率。
通常，gp120-Ag免疫的動物中抗gp120抗體的滴度可用作成功免疫單個動物的直接指示物，并也將允許區(qū)分免疫的相對于天然感染的動物。
實施例6用抗原攻擊成功免疫的動物對動物成功進(jìn)行免疫之后，相同的動物組利用抗原攻擊，諸如RSV F蛋白(或完整RSV)，并監(jiān)測臨床癥狀的進(jìn)展。
結(jié)果由于F蛋白是RSV的一種主要抗原，預(yù)期經(jīng)免疫的動物應(yīng)具有對抗隨后攻擊的保護(hù)并且不應(yīng)出現(xiàn)任何臨床癥狀，而給予gp120-His或載體溶液的動物應(yīng)如此。
實施例7獲得牛DC-SIGN cDNA序列牛樹突細(xì)胞根據(jù)Werling et al(2002)J.Leukoc.Biol.72，297-304所述方法分離，并分離mRNA。來自Becton Dickinson(Cat.No.K1811-1)的SMARTTMRACE cDNA擴(kuò)增試劑盒用于擴(kuò)增，所用引物為TAGCTGACTCCTTGTCCDC-SIGNGTG。對擴(kuò)增的cDNA(稱為變體1)進(jìn)行測定，核苷酸序列顯示于圖1。
利用簡并引物，基于鼠和人DC-SIGN分子(GenBank登錄號分別為AF373408和NM_021155)之間的同源性獲得另一部分牛DC-SIGN cDNA序列，稱為變體2。牛DC-SIGN變體2的部分cDNA序列顯示于圖6。
變體牛DC-SIGN cDNA序列均編碼C型外源凝集素受體，并且與相應(yīng)的鼠和人序列在堿基配對和/或氨基酸序列方面共享達(dá)89％的同源性(圖7)。
圖7顯示人DC-SIGN(NM_021155_DC-SIGN)，鼠DC-SIGN(muDC-SIGN_DC-SIGN)，和牛DC-SIGN(boDC-SIGN變體1/2_DC-SIGN)的兩種變體的氨基酸序列的Clustal W比對。短線表示沒有配對殘基。
權(quán)利要求
1.動物接種用化合物，包含(i)選擇性結(jié)合動物中的樹突細(xì)胞但不天然存在于該動物中的組成部分，和(ii)抗原。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中所述組成部分選擇性結(jié)合樹突細(xì)胞上的模式識別受體。
3.權(quán)利要求的化合物2，其中所述模式識別受體是DC-SIGN。
4.權(quán)利要求1或2的化合物，其中所述選擇性結(jié)合的組成部分是蛋白質(zhì)。
5.權(quán)利要求4的化合物，其中所述選擇性結(jié)合的組成部分是以下物質(zhì)之一HIV gp120，結(jié)核分支桿菌的LAM蛋白或埃博拉病毒的糖蛋白，或其部分。
6.動物接種用化合物，包含(i)選自HIV gp120，結(jié)核分支桿菌的LAM蛋白或埃博拉病毒的糖蛋白，或其一部分的組成部分，和(ii)抗原。
7.前述權(quán)利要求之一的化合物，其中所述抗原是多肽。
8.前述權(quán)利要求之一的化合物，其中所述抗原是與動物疾病相關(guān)的分子或所述分子的一部分或變體。
9.前述權(quán)利要求之一的化合物，其中所述抗原包括與動物疾病相關(guān)的兩種或多種分子或所述分子的一部分或變體。
10.權(quán)利要求8或9的化合物，其中所述抗原是病原體或腫瘤的抗原成分或所述成分的抗原部分或變體。
11.權(quán)利要求10的化合物，其中所述病原體是細(xì)菌、病毒、真菌、原生動物或寄生蟲之一。
12.權(quán)利要求的化合物11，其中所述抗原是選自與OIE列表A疾病相關(guān)的病原體的病原的抗原成分，或所述成分的一部分或變體。
13.前述權(quán)利要求之一的化合物，其中所述組成部分和抗原共價連接。
14.前述權(quán)利要求之一的化合物，其中所述選擇性結(jié)合的組成部分以及抗原各自包含多肽并且均存在于相同的多肽鏈中。
15.核酸分子，其編碼權(quán)利要求14的化合物。
16.表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求15的核酸分子。
17.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求15的核酸分子或權(quán)利要求16的表達(dá)載體。
18.疫苗，其包含權(quán)利要求1-14之一的化合物或權(quán)利要求15的核酸分子。
19.權(quán)利要求18的疫苗，還包含佐劑。
20.權(quán)利要求1-14之一的化合物或權(quán)利要求15的核酸分子作為藥物的用途。
21.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-14之一的化合物或權(quán)利要求15的核酸分子以及可藥用的載體。
22.針對疾病免疫動物的方法，包括給藥動物權(quán)利要求1-14之一的化合物或權(quán)利要求15的核酸分子的步驟。
23.對抗動物中的疾病的方法，包括給藥動物權(quán)利要求1-14之一的化合物或權(quán)利要求15的核酸分子的步驟。
24.權(quán)利要求22或23的方法，其中所述疾病是病原體引起的疾病。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述病原體是細(xì)菌、病毒、真菌、原生動物或蠕蟲之一。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述病原體是與OIE列表A疾病相關(guān)的病原體。
27.權(quán)利要求22或23的方法，其中所述動物是哺乳動物。
28.權(quán)利要求22-27之一的方法，其中所述動物是家養(yǎng)動物或農(nóng)場動物。
29.權(quán)利要求27或28的方法，其中所述動物是母牛，綿羊，馬，豬，山羊，狗，貓或兔。
30.權(quán)利要求1-14之一的化合物或權(quán)利要求15的核酸在制備用于對抗動物中的疾病的藥物中的用途。
31.權(quán)利要求1-14之一的化合物或權(quán)利要求15的核酸在制備用于免疫動物中的疫苗中的用途。
32.權(quán)利要求30或31的用途，其中所述疾病是病原體引起的疾病。
33.權(quán)利要求32的用途，其中所述病原體是細(xì)菌、病毒、真菌、原生動物或蠕蟲之一。
34.權(quán)利要求33的用途，其中所述病原體是與OIE列表A疾病相關(guān)的病原體。
35.權(quán)利要求30或31的用途，其中所述動物是哺乳動物。
36.權(quán)利要求30或31的用途，其中所述動物是家養(yǎng)動物或農(nóng)場動物。
37.權(quán)利要求35或36的用途，其中所述動物是母牛，綿羊，馬，豬，山羊，狗，貓或兔。
38.制備權(quán)利要求1或6的化合物的方法，包括連接所述組成部分和所述抗原。
39.制備權(quán)利要求14的化合物的方法，所述化合物中包含多肽，所述方法包括(i)培養(yǎng)表達(dá)所述多肽的權(quán)利要求17的宿主細(xì)胞，和(ii)分離所述多肽。
40.制備權(quán)利要求15的核酸分子的方法，包括將編碼選擇性結(jié)合樹突細(xì)胞的組成部分的核酸分子與編碼抗原的核酸分子相連。
41.核酸分子，包括(i)編碼選擇性結(jié)合樹突細(xì)胞的組成部分的部分和(ii)用于插入編碼抗原的多核苷酸的插入點，其中所述多核苷酸被插入所述插入點，所述核酸分子編碼權(quán)利要求14的化合物。
42.權(quán)利要求41的核酸分子，其中所述核酸編碼選擇性結(jié)合樹突細(xì)胞上的模式識別受體的組成部分。
43.權(quán)利要求42的核酸分子，其中所述識別受體是DC-SIGN。
44.權(quán)利要求41或42的核酸分子，其中所述選擇性結(jié)合的組成部分是HIV gp120，結(jié)核分支桿菌的LAM蛋白或埃博拉病毒的糖蛋白之一。
45.檢測是否已經(jīng)給藥動物權(quán)利要求1的化合物的方法，所述方法包括測定動物對于所述選擇性結(jié)合樹突細(xì)胞的組成部分是否有免疫反應(yīng)。
46.權(quán)利要求45的方法，包括測定所述動物是否具有對存在于所述化合物中的抗原的免疫反應(yīng)的其它步驟。
47.包含多個部分的試劑盒，包括(i)權(quán)利要求1-14之一的化合物或權(quán)利要求15的核酸分子，和(ii)檢測對存在于所述選擇性結(jié)合樹突細(xì)胞的化合物中的組成部分的免疫反應(yīng)的裝置，和/或(iii)檢測對所述化合物中存在的抗原的免疫反應(yīng)的裝置。
48.權(quán)利要求47的試劑盒，其中如果存在，部分(ii)包括所有或部分結(jié)合針對該組成部分激發(fā)的抗體的所述組成部分，且部分(iii)包括所有或部分結(jié)合針對該抗原激發(fā)的抗體的所述抗原。
49.包含多個部分的試劑盒，包括(i)用于檢測對動物疾病抗原的免疫反應(yīng)的裝置和(ii)用于檢測對選擇性結(jié)合樹突細(xì)胞的組成部分的免疫反應(yīng)的裝置。
50.權(quán)利要求47-49之一的試劑盒，其中用于檢測免疫反應(yīng)的裝置是ELISA裝置。
51.免疫動物的新方法，其中利用該方法免疫的動物可與本文所述天然感染的動物區(qū)分。
全文摘要
動物接種用化合物，包含(i)選擇性結(jié)合動物中的樹突細(xì)胞但不天然存在該動物中的組成部分和(ii)抗原。通常，所述選擇性結(jié)合的組成部分與DC－SIGN結(jié)合。該組成部分可為HIV－1 gp120。本發(fā)明的化合物可用于接種動物，接種后，它們可與天然感染的動物區(qū)分開。
文檔編號C12N15/62GK1867356SQ200480029135
公開日2006年11月22日 申請日期2004年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月5日
發(fā)明者德克·韋林 申請人:皇家獸醫(yī)學(xué)院