專利名稱：：用于遞送和表達抗原的促凋亡細菌和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及疫苗接種領(lǐng)域，包括強免疫應(yīng)答的誘導以及感染性疾病和癌癥的預(yù)防和治療。具體而言，本發(fā)明涉及通過表達超氧化物歧化酶、谷氨酰胺合酶和其他抗凋亡酶的顯性失活突變體用于增強細菌的免疫原性的方法。它進一步涉及用于產(chǎn)生安全有效的疫苗的方法，以及用于增強隨后暴露于細菌性病原體如結(jié)核分枝桿菌(拳o6a"eW咖"6ercy2o"s)感染的宿主動物中的有效免疫應(yīng)答的方法。通過使用這些方法構(gòu)建的免疫原性疫苗還可以是用于表達外源性抗原和用于誘導針對無關(guān)感染因子和癌癥的免疫應(yīng)答的栽體。背景涉及B和T淋巴細胞的適應(yīng)性免疫應(yīng)答是免疫系統(tǒng)如何保護宿主不受感染和癌癥的重要組分。在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中存在特化，不同細胞和因子賦予針對不同攻擊的保護。例如，體液免疫應(yīng)答由成熟為漿細胞的B細胞介導。這些細胞可以產(chǎn)生使微生物毒素(例如，白喉毒素、百日咳毒素)失活的中和抗體?？贵w是可溶的并且可以經(jīng)過長距離發(fā)揮其效應(yīng)。相比之下，T細胞介導一般需要直接或緊密的細胞間接觸的細胞免疫應(yīng)答。存在介導適應(yīng)性免疫應(yīng)答的效應(yīng)子功能的2大類T細胞。這2類T細胞通過表面抗原和功能加以區(qū)分[Seder,R.A.等人，2000]。顯示CD4表面抗原的T細胞包括"輔助細胞，，。某些輔助細胞產(chǎn)生IFN-Y，所述IFN-Y激活巨噬細胞以產(chǎn)生更多的活性氧種類并因此增強其殺微生物功能。其他CD4+T細胞產(chǎn)生IL-2和其他白介素，其促進記憶T細胞群體在隨后用感染因子攻擊期間增殖為效應(yīng)T細胞。CD8+細胞以幾種方式發(fā)揮其保護效應(yīng)，包括導致受感染細胞裂解的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)活性，通過釋放抗微生物肽粒溶素來殺死胞內(nèi)桿菌，和通過IFN-Y生產(chǎn)[Cho，S.等人,2000;Serbina，N.V.等人,1999;Serbina，N.V.等人,2000;Silva，C.L.等人，1999]。傳統(tǒng)免疫學教導CD4+淋巴細胞和CD8+淋巴細胞使用不同的抗原呈遞途徑致敏以進行免疫應(yīng)答[Seder，R.A.等人，2000]。在涉及CD4+T細胞的應(yīng)答誘導中，外源性外來抗原從抗原呈遞細胞的吞噬體內(nèi)攝入的微生物中被吸收或回收。在那里抗原被組織蛋白酶降解成片段，并且在這些細胞的表面上與MHCII類分子結(jié)合以呈遞給CD4+T細胞。這個過程稱為抗原呈遞的"外源性"途徑，因為它處理最初在細胞外且由細胞攝入的抗原。MHCII類分子主要限于稱為"抗原呈遞細胞"的某些少數(shù)類型的白細胞，其包括巨噬細胞和樹突細胞。CD8+T細胞激活經(jīng)由涉及匪CI類分子的不同機制來達到，所迷MHCI類分子在基本上所有有核細胞上發(fā)現(xiàn)。通過細胞產(chǎn)生或引入有核細胞的細胞質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)被降解成肽并且于細胞表面上在MHCI類分子的背景中呈遞給CD8+T細胞。MHCI類抗原呈遞一般稱為"內(nèi)源性"途徑，其處理來自細胞質(zhì)的抗原，一般是來自感染細胞的病毒的抗原。本申請公開了用于降低抗凋亡微生物酶的活性的方法。還公開了依照公開方法制備的具有增強的免疫原性的經(jīng)修飾的細菌。發(fā)明概述本發(fā)明涉及以改善疫苗功效的方式修飾細菌以增強抗原呈遞的方法。提供了修飾胞內(nèi)生物以表達促凋亡表型的方法。另外，因為強CD8+T細胞應(yīng)答的誘導一般難以由目前的疫苗接種策略來達到，所以本發(fā)明經(jīng)修飾的微生物提供了接入免疫系統(tǒng)的這個分支的非常有效的途徑。微生物可以通過添加編碼來自其他致病微生物(包括病毒、細菌、原生動物和真菌)的免疫顯性抗原的外源DM，或用編碼癌抗原的DNA進一步進行改變，并隨后用于接種宿主動物。因此，本發(fā)明的減毒細菌可以用作疫苗遞送媒介物，以呈遞抗原用于經(jīng)由MHCI類和MHCII類途徑加工。還因為由疫苗載體中與宿主細胞上的T細胞樣受體相互作用的微生物組分誘導的強共刺激信號，所以這指導宿主免疫系統(tǒng)反應(yīng)對抗外源性抗原而不是發(fā)展免疫耐受性。此外，經(jīng)由樹突細胞通過MHCI類和MHCII類途徑的抗原同時呈遞促進CD4"輔助"的發(fā)展用于CD8細胞毒性T淋巴細胞(CTL)應(yīng)答，從而克服經(jīng)由目前載體的抗原呈遞的局限性，所述目前載體設(shè)計為接入抗原呈遞的外源性(例如，許多細菌載體，吞噬體關(guān)聯(lián)的)或內(nèi)源性(例如，許多病毒栽體，細胞質(zhì)和蛋白酶體關(guān)聯(lián)的)途徑。附圖簡述圖1顯示結(jié)核分枝桿菌/BCG(SodA)鐵輔因子化(co-factored)的超氧化物歧化酶的圖。(A)SodA單體顯示本發(fā)明的SodA突變體中的缺失氨基酸的位置。其他缺失、添加和/或置換可以用于產(chǎn)生另外的顯性失活的SodA突變體。(B)顯示SodA四聚體，其中每個長方形指出2個活性部位鐵離子的位置。箭頭鑒定相同單體的活性部位鐵和E54位置。該圖從美國國立生物信息中心(NCBI)網(wǎng)頁服務(wù)器(http://www,ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query,fcgidb=Structure&itool-toolbar)下載，并且進行修飾以舉例說明特征。圖2提供分枝桿菌染色體整合載體pMP399的圖(A)和特征(B)，以及在BCG中表達突變體SodAAH28AIH6的質(zhì)粒栽體pMP349的圖(C)和特征(D)。編碼結(jié)核分枝桿菌/BCG中的鐵輔因子化的超氧化物歧化酶的基因的名稱為soW。它在誘導型(i'c/)啟動子后表達。大腸桿菌復制起點(oriE)允許質(zhì)粒在大腸桿菌中復制。阿泊拉霉素抗性基因(aac"門以及載體pMP399和pMP349由Consaul和Pavelka[Consaul，S.A.等人，2004]開發(fā)。阿泊拉霉素抗性基因可以被不同的抗生素抗性基因替換，或該栽體可以包含補足菌林中的氨基酸營養(yǎng)缺陷的生物合成基因，從而允許在缺乏必需因子(例如，氨基酸)的培養(yǎng)基上生長，以用作選擇標記用于鑒定成功的重組體。圖3顯示與親代BCG菌林的SOD活性比較，在表達突變體SodA(△HMAH76)的BCG的上清液和裂解物中的SOD活性。(A)和(B)顯示來自2次分開實驗的結(jié)果。該測定法使用上清液和裂解物的系列2倍稀釋液來進行，并且監(jiān)測固定時間點時還原的細胞色素C的量。一個單位的SOD活性抑制細胞色素C還原(測量的最大抑制的)50°/。。對于每種制劑抑制細胞色素C還原50%的稀釋度(IC50值)由箭頭指出。SodA由BCG分泌，并因此BCG上清液的SOD活性大于BCG裂解物的S0D活性。圖4顯示與親代BCG菌林的SOD活性比較，在表達突變體SodA(△E54)的BCG的上清液和裂解物中的S0D活性。圖5顯示BCG與SD-BCG-AS-SOD相比的疫苗功效。使用反義技術(shù)構(gòu)建在這些實驗中使用的SD-BCG(SodA-減少的BCG)菌林(參見名稱為"Pro-apoptoticbacterialvaccinestoenhancecellularimmuneresponses"的W002/062298，就其關(guān)于SOD活性的反義減少的教導通過引用合并入本文)，并且其顯示出約1%親代BCG菌林的SOD活性。C57B1/6小鼠用BCG或SD-BCG-AS-SOD進行IV疫苗接種，休息7個月，并隨后通過氣溶膠用30cfu結(jié)核分枝桿菌的有毒Erdman菌株的吖啶黃-R突變體進行攻擊。在攻擊后14周時，未接種疫苗和接種BCG的小鼠顯示密集蜂窩狀的實質(zhì)肺部炎癥的局灶區(qū)域(代表性切片在A中顯示，x2和xl0)。相比之下，接種SD-BCG的小鼠具有不那么密集的蜂窩狀的肺累及區(qū)域(B，x2和xlO)。B的更高倍視圖(C)顯示具有核片段的泡沫狀細胞，暗示肺泡(左側(cè)小圖)和多核巨細胞(右側(cè)小圖)中攝入的凋亡碎片。在攻擊后6個月最后收獲時，與BCG的接受者(D)相比較，Erdmancfu計數(shù)在SD-BCG的接受者中較低。方框圖內(nèi)的線表示中值，方框的邊緣指示第25和75百分位數(shù)，和細線表示第10和第90百分位數(shù)。組間差異是統(tǒng)計學顯著的(P-.(M，雙樣本t檢驗)。與此同時，每個組中小鼠的最終平均重量分別為28.3和31.0gms，BCG[來自最初12只小鼠的8個存活者，4個由于皮膚問題而實施安樂死]和SD-BCG[IO個存活者]，P=.04，雙樣本t檢驗。因此，減少BCG的SodA生產(chǎn)增強了其作為疫苗的功效。圖6顯示用SD-BCG-AS-SOD接種改變用有毒結(jié)核分枝桿菌氣溶膠攻擊后小鼠肺中的回憶T細胞應(yīng)答。小鼠用2x106cfuBCG、SD-BCG-AS-SOD、或磷酸鹽緩沖鹽水(未接種)進行皮下接種，休息100天，并隨后通過氣溶膠用300cfuErdman進行攻擊。值表示在攻擊后第4、10和18天時從小鼠的右肺中回收的表達所指示的表面抗原(左欄)的細胞數(shù)目。從對照小鼠中收獲雙側(cè)肺。每個值表示4只小鼠的平均值，除外將3只小鼠用于對照值。BCG疫苗接種組包括接受BCG或C-BCG的小鼠。到注射后第4天時，SD-BCG的接受者顯示出更多數(shù)目的CD44+/CD45RBhigh細胞。這些細胞通過前向散射大于其他T細胞群體，并可能表示經(jīng)歷克隆擴充的T細胞。到第l8天時，在SD-BCG的接受者中觀察到比BCG接受者中更大量的終末分化的CD4+效應(yīng)T細胞(CD44+/CD45RBne"。*P=.02;，P<.05，BCG對SD-BCG，雙樣本t檢驗。圖7顯示在用SD-BCG-AS-SOD接種的小鼠中，用300cfu結(jié)核分枝桿菌的有毒Erd歸n菌株的吖啶黃-R突變體氣溶膠攻擊后，高恩(Ghon)損害的加速形成。顯示了在攻擊后笫18天時左肺的低(x2)和中(x20)倍顯微照片。在攻擊后第10天和第18天之間，SD-BCG接種的發(fā)展出在肺實質(zhì)中的細胞的眾多小局灶聚集物(右側(cè)小圖)。第IO天和第18天之間的此類改變在BCG接種的小鼠中較不明顯，并且在未接種的小鼠中未觀察到。SD-BCG小鼠中的小局灶細胞聚集在外觀方面不同于BCG接種的小鼠中的肉芽腫性炎癥的擴大區(qū)域，顯示具有蒼白色細胞質(zhì)和早期泡沫狀改變的更多的大單核細胞，通常包含暗示凋亡細胞碎片的核片段。圖8顯示用于使BCG染色體上的s/g^失活的載體以及構(gòu)建體SIG-BCG(BCGAsigH)的圖(A)和特征(B)。圖9顯示在氣溶膠攻擊后6個月時的肺cfu計數(shù)。小鼠在用BCG或BCG」W^y進行SubQ接種后休息100天，并且隨后用300cfu結(jié)核分枝桿菌的有毒Erdman菌林的吖啶黃-R突變體進行攻擊。方框圖內(nèi)的線表示中值，方框的邊緣指示第25和第75百分位數(shù)，并且細線表示第10和第90百分位數(shù)。組間差異是統(tǒng)計學顯著的(P=.019,雙樣本t檢驗)。圖IO顯示在用300cfu結(jié)核分枝桿菌的有毒Erdman菌林的吖啶黃-R突變體攻擊后6個月時，用安慰劑(鹽水)、BCG或BCG^s/^y接種的小鼠的肺切片的顯微照片。將來自每個組中的2只小鼠的肺用10%緩沖的福爾馬林進行膨脹并且進行石蠟包埋。展示了在顯微鏡載玻片上所顯示的覆蓋約80%的肺組織切片的3個低倍顯微照片，并且顯示在用BCG^^/^y疫苗接種的小鼠中患病較少的肺。方框指出在圖11中較高倍的放大率下顯示的區(qū)域。圖ll顯示在用300cfu結(jié)核分枝桿菌的有毒Erdoian菌林的吖啶黃-R突變體氣溶膠攻擊小鼠后22天、2個月和6個月時，高恩損害(箭頭)的形成和演化。小鼠用安慰劑(鹽水)、BCG或BCG」s/^7皮下接種，并且在氣溶膠攻擊前休息IOO天。高恩損害在BCGzU/^y接種的小鼠中較早發(fā)展，并且演化出較少的肉芽腫性炎癥，從而產(chǎn)生最低限度的肺損害。相比之下，在未接種疫苗和BCG疫苗接種的小鼠的肺中發(fā)展出經(jīng)由淋巴細胞和巨噬細胞的密集實質(zhì)浸潤區(qū)。6個月的顯微照片對應(yīng)圖10中的方框區(qū)域。圖12舉例說明免疫激活中的順次步驟，并且顯示微生物抗氧化劑如何能夠干擾在其早期階段中免疫應(yīng)答的激活。減少微生物抗氧化劑的活性在接種期間促進調(diào)亡和其他免疫功能。這導致強回憶T細胞應(yīng)答和增強的保護。圖13顯示在多基因中組合基因缺失和顯性失活突變，以產(chǎn)生漸進地更有效的促凋亡BCG菌林，以用作針對肺結(jié)核的疫苗和用于表達外源性抗原的栽體的策略。促凋亡疫苗抹使用"世代(generation)，，法進行構(gòu)建，其中第1代涉及BCG的修飾，以包括單基因失活或顯性失活突變體酶表達，第2代組合2種修飾，第3代組合3種修飾，和第4代組合4種修飾。圖14顯示SIG-BCG和SAD-SIG-BCG的上清液和裂解物中的SOD活性。SIG-BCG(也稱為"s/^y缺失型BCG"，或"BCG」si^y，)在該圖中稱為BCGdSigH。SAD-SIG-BCG(也稱為"BCG4s/g"[muts副")稱為BCGdSigHH28H76(小圖A和B)或BCGdSigHE54(小圖C)，取決于測試何種顯性失活突變體。"supe"是上清液的縮寫。該測定法使用上清液和裂解物的系列2倍稀釋液來進行，并且監(jiān)測固定時間點時還原的細胞色素C的量。一個單位的SOD活性使細胞色素C還原抑制50%(測量的最大抑制)。對于每種制劑使細胞色素C還原抑制50%(IC50值)的稀釋度由箭頭指出。圖15顯示驗證稱為"BCGJs/g^4"cJ,的DD-BCG("雙重缺失BCG")的構(gòu)建的Southern雜交結(jié)果。來自4種分離物的染色體DNA用Z7ra/i7進行消化，施加于泳道l-4，并隨后與基因探針雜交?；蛱结樶槍/^y和力yg^(編碼在s/^7的插入失活中使用的潮霉素抗性盒的基因)。潮霉素抗性基因(hygR)具有內(nèi)部限制位點，預(yù)測當在載體和染色體之間的雙交換事件已消除s/g"時產(chǎn)生2.92和1.67kb片段，并因此提供另外的成功保證(除了w^y條帶的缺失)時。DD-BCG構(gòu)建中的事件順序包括下述步驟從BCGTice菌林(泳道l)開始，BCGTice中的sec^基因通過使用先前用于使有毒結(jié)核分枝桿菌菌林中的sec^失活的方法[Braunstein，M.等人，2002;Braunstein，M.等人，2003，就其使"c^失活的方法的教導通過引用合并入本文]進行失活，從而產(chǎn)生BCGzlsecA(泳道2)。圖8中所示的等位失活載體用于使BCG中的s/^7失活以產(chǎn)生BCGA"^7(泳道3)，并且還缺失BCG」sed2中的W^y，從而產(chǎn)生BCGJs/^7zlsed2(泳道4，DD-BCG)。圖16顯示在W^l"c^缺失型BCG(BCG/4s/>yzUec^，也稱為雙重缺失BCG["DD-BCG"])和表達突變體SodA(△E54)或突變體SodA(△H28△H76)(也稱為3D-BCG-mutSodA(△E54)和3D-BCG-mutSodA(AH28AH76))的DD-BCG菌林的裂解物中的SOD活性。3D-BCG菌林的這些例子涉及pMP399衍生的載體并且具有插入(DD-BCG的)染色體內(nèi)的mutsoW。小圖(A)顯示關(guān)于上清液和裂解物的結(jié)果。因為secA2的失活，上清液顯示出比裂解物更少的SOD活性，所述secA2編碼關(guān)于SodA和過氧化氬酶的分泌通道。小圖B-D顯示由3次分開實驗產(chǎn)生的SOD活性，所述實驗涉及使用每種分離物的獨立培養(yǎng)物在不同日期時制備的裂解物。該測定法使用上清液和裂解物的系列2倍稀釋液來進行，并且監(jiān)測固定時間點時還原的細胞色素C的量。一個單位的S0D活性使細胞色素C還原抑制50%(測量的最大抑制)。對于每種制劑使細胞色素C還原抑制50%(IC50值)的稀釋度由箭頭指出。圖17顯示DD-BCG(泳道3)、3D-BCG-mutSodA(AE54)(泳道4)和3D-BCG-mutSodA(AH28AH76)(泳道5)的裂解物的SDS-PAGE和western雜交。3D-BCG菌抹的這些例子具有插入DD-BCG染色體內(nèi)的mutmW。蛋白質(zhì)雜交凝膠顯示在DD-BCG和2種3D-BCG構(gòu)建體的裂解物中可比較的SodA量。如用于實施例(下文)的方法中描述的制備用于PAGE和蛋白質(zhì)的未稀釋的裂解物。BSA-牛血清白蛋白，是在2種培養(yǎng)基中占優(yōu)勢的組分。大腸桿菌S0D(泳道2)與針對結(jié)核分枝桿菌SodA的抗體不反應(yīng)。施加于這些凝膠的未稀釋的裂解物是與圖16D中所示的S0D活性測定法中使用的裂解物相同。因此，盡管通過表達突變體"W基因而顯著減少S0D活性，但SDS-PAGE和蛋白質(zhì)上顯示的SodA蛋白質(zhì)的量是可比較的。這些數(shù)據(jù)與由突變體SodA的表達給予的"顯性失活"效應(yīng)一致。圖18顯示由6個單體組成的glnAl六聚環(huán)的圖。該圖從NCBI網(wǎng)頁月艮務(wù)器(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgidb=Structure&itool=toolbar)下載，并且進行修飾以舉例說明特征。GlnAl單體形成包含2個六聚環(huán)的十二聚體。正方形指出活性部位的位置，其位于鄰近單體之間并且由錳離子和來自鄰近單體的催化環(huán)組成。突變體glnAl中缺失的氨基酸包括在氨基酸54位上的天冬氨酸和在氨基酸335位上的谷氨酸(GlnAlAD54AE335)，其處于活性部位中并對應(yīng)沙門氏菌屬(Sfl/邊加e/7a)谷氨酰胺合酶的D50和G327。圖19提供在BCG中表達顯性失活突變體glnAl的質(zhì)粒載體pHV203—mutglnAlAD54AE335的圖(A)和特征(B)。圖20提供質(zhì)粒載體pMP349的圖(A)和特征(B)，以及在BCG中表達突變體SodAAH28AH76和突變體glnAlAD54厶E335的分枝桿菌染色體整合載體pMP399的圖(C)和特征(D)。圖21顯示經(jīng)由促凋亡BCG的外源性抗原表達的例子。使用抗BLS抗體的SDS-PAGE(上圖)和western雜交(下圖)驗證經(jīng)由DD-BCG表達重組布魯桿菌屬("r"ce/7a)2，"二氧四氫蝶啶合酶(rBLS)，其在誘導條件下顯示為泳道5中的18-kDa的條帶。rBLS在ace4/c/)啟動子下進行克隆。BSA-牛血清白蛋白，其存在于2種培養(yǎng)基中，泳道4-6中的其他條帶表示DD-BCG或rBLS的蛋白質(zhì)。泳道5和6表示在誘導(+，添加乙酸鹽)和抑制(-，添加琥珀酸鹽)/c/)啟動子的條件下生長的DD-BCGrBLS，以及由此rBLS的產(chǎn)生。圖22顯示用于使BCG的染色體上的硫氧還蛋白("義O和硫氧還蛋白還原酶(m^)失活的載體的圖(A)和特征(B)。圖23顯示用突變體等位基因替換BCG的染色體上的硫氧還蛋白(和硫氧還蛋白還原酶("x^)的野生型等位基因的栽體的圖(A)和特征(B)，其中所述突變體等位基因中對應(yīng)活性部位的每種酶的6個氨基酸已被消除。圖24顯示用于使BCG的染色體上的s/gf失活的栽體的圖(A)和特征(B)。圖25顯示在經(jīng)修飾的BCG菌林中減少的谷氨酰胺合成酶活性，所述經(jīng)修飾的BCG菌林表達實施例8中描述的glnAl的AD"AE335顯性失活突變體。小圖U)顯示BCG、3D-BCG和4D-BCG的裂解物(L),以及部分純化的裂解物在硫酸銨(AS)沉淀后的SDS-PAGE(上)和western雜交印跡(下)。通過使質(zhì)粒pHV203-mutGlnAl△D54△E335(表1)電穿孔到3D-BCG內(nèi)構(gòu)建4D-BCG。GlnAl單體遷移到在50和37-kDa標記之間，并顯示經(jīng)由BCG、3D-BCG和4D-BCG產(chǎn)生的可比較的GlnAl量。小圖(B)顯示在AS處理的3D-BCG和4D-BCG的裂解物中的谷氨酰胺合酶活性，表示與(A)中所示相同的AS制劑。反應(yīng)通過監(jiān)測隨著時間過去的吸光度進行分光光度計測量跟蹤。3D-BCGAS裂解物O，未稀釋的；□，2倍稀釋；△，4倍稀釋；，8倍稀釋。化-BCGAS裂解物*，未稀釋的；■，2倍稀釋。盡管如(A)中所示可比較的GlnAl蛋白質(zhì)的量，但用未稀釋的4D-BCG制劑的4D-BCG中幾乎不能檢測到酶活性，所述稀釋的4D-BCG制劑顯示與3D-BCG制劑的8倍稀釋可比較的活性。這證實AD54厶E335單體的表達對酶活性發(fā)揮顯性失活效應(yīng)。小圖(C)顯示涉及4D-BCG的pHV203-mutGlnAl△D54AE335形式的2種培養(yǎng)制劑的重復的酶活性測定法。此外，4D-BCG的pMP399形式通過使染色體整合栽體pMP399-mutSodAAH28△H76、mutGlnAlAD54AE335(表l)電穿孔到DD-BCG內(nèi)進行構(gòu)建。4D-BCG的pMP399形式無法象pHV203形式一樣完全達到有效減少谷氨酰胺合成酶活性，可能涉及分別來自染色體(即，單拷貝)對多拷貝質(zhì)粒的D54AE335GlnAl突變體表達的拷貝數(shù)效應(yīng)。圖26顯示用BCG和paBCG疫苗進行接種后由CD4+T細胞產(chǎn)生IFN-Y和IL-2。(A)來自產(chǎn)生IFN-Y和IL-2的C57B1/6小鼠脾的CD4+T細胞百分比針對用BCG、DD-BCG、3D-BCG和4D-BCG進行IV接種后的日期進行繪圖。每個小圖中的每個數(shù)據(jù)點表示單只小鼠，并顯示在受BCG感染的巨噬細胞上過夜再刺激后產(chǎn)生IFN-y或IL-2的CD4+脾細胞％，減去在未感染的巨噬細胞上再刺激后產(chǎn)生IFN-y或IL-2的細胞％。陰影面積顯示來自以類似方式分析的PBS接種小鼠的脾細胞的平均值士標準差，指出用IFN-Y測定法非常低的背景和用IL-2相對較高的背景。(B)來自BCG對paBCG接種小鼠的IFN-Y和IL-2+CD4+T細胞Q/。的概括，僅使用具有^0.5%的IFN-Y值的小鼠亞群。這消除了來自在初次T細胞應(yīng)答開始前收集的小鼠的結(jié)果，以及來自更先進的3D-和4D-BCG疫苗的接受者的結(jié)果，其中細胞因子生產(chǎn)在初步增殖后很快下降至幾乎基線值(小圖A)，但隨后在再感染期間被快速召回(參見圖27)。點陣圖顯示中值、25-75百分位數(shù)(方框)和10-90百分位數(shù)(細線)值。盡管BCG—般誘導更多的IFN-Y生產(chǎn)，但IL-2值在用paBCG疫苗進行疫苗接種的小鼠中明顯更高。P-.0024。圖27顯示在接種后第25天和第31天時針對用BCG、DD-BCG和3D-BCG接種的T細胞應(yīng)答。來自接種25天和31天的小鼠脾細胞的BCG特異性細胞因子生產(chǎn)更早。疫苗劑量為靜脈內(nèi)施用的5x105cfu。脾細胞在IFN-Y處理的未感染的骨髓衍生的巨噬細胞(BMDMs)或在IFN-Y處理的受BCG感染的BMDMs上進行過夜溫育。T細胞隨后通過流式細胞計量術(shù)就IFN-Y和IL-2生產(chǎn)進行評估，通過細胞內(nèi)細胞因子染色技術(shù)。IFN-v生產(chǎn)和IL-2生產(chǎn)CD4+和CD8+T細胞的百分比顯示在方框區(qū)內(nèi)。背景細胞因子生產(chǎn)由未刺激的值(未感染的巨噬細胞)進行測定。注與圖26A中所示的數(shù)據(jù)形成對比，此處顯示的％值表示總CD4群體％，而不從再刺激后的受BCG感染的BMDM值中扣除基線值(未感染的BMDM)。將來自這個圖的原始數(shù)據(jù)進行轉(zhuǎn)換用于并入圖26A內(nèi)。例如，對于在第25天和31天時的IFN-y生產(chǎn)分別在.73%(.86-.13)和1.47%(1.52-.05)處，以及對于IL-2分別-.03%(.15-.18)和.18%(.28-.10)的數(shù)據(jù)點來自這個實驗。圖28顯示在用4x107cfuBCG氣管內(nèi)攻擊后5天時，在BCG接種的小鼠和3DBCG接種的小鼠中的第二次(回憶)T細胞應(yīng)答。3個月前用5x105cfu疫苗林進行subQ接種小鼠，并且在接種后4-8周用INH和利福平進行處理以消除疫苗株。IFN-Y的抗原特異性生產(chǎn)在2種BCG接種的小鼠中為1.35%(1.58-0.23)和0.85%(2.09-1.24%)，相對于2種3DBCG接種的小鼠中的7.88%(8.09-0.21)和3.85%(4.09-.024)。IFN-Y和IL-2的抗原特異性共生產(chǎn)在BCG小鼠中為0.29%(0.29-0.0)和0.10%(0,15-0.03),與3DBCG小鼠中的2.01%(2.02-0.01)和1.09%(1.15-0.06)相對。發(fā)明詳述應(yīng)當指出如在說明書和所附權(quán)利要求中所使用的單數(shù)形式"a"、"an"和"the"包括復數(shù)參照，除非上下文另有明確iJC明。因此，例如提及"酶"包括酶的多拷貝并且還可以包括酶的超過一個特定種類。提供了修飾微生物以增強微生物的免疫原性的方法，其包括通過過量表達顯性失活突變體酶和/或失活控制抗凋亡酶產(chǎn)生的調(diào)節(jié)基因來減少由微生物產(chǎn)生的抗凋亡酶的活性，由此細菌在受試者中具有增強的免疫原性。SodA或谷氨酰胺合酶的顯性失活突變體是當由細菌表達時減少細菌的總SOD或谷氨酰胺合酶活性的突變體酶。該經(jīng)修飾的細菌還可以包含在減少其活性或使其失活的調(diào)節(jié)基因中的突變。如本文所使用的，引起減少的活性的突變(活性降低突變)包含失活突變。因此，還提供了經(jīng)修飾以減少微生物的抗凋亡酶的活性的胞內(nèi)微生物。本發(fā)明還提供了修飾減毒微生物以增強該減毒微生物的免疫原性的方法，其包括通過過量表達顯性失活突變體酶和/或失活控制抗凋亡酶產(chǎn)生的調(diào)節(jié)基因來減少由該減毒微生物產(chǎn)生的抗凋亡酶的活性，由此該減毒細菌在受試者中具有增強的免疫原性。因此，還提供了進一步進行修飾以減少微生物的抗凋亡酶的活性的減毒胞內(nèi)微生物。如上所述，微生物可以是本文描述的任何微生物。微生物可以是胞內(nèi)病原體或?qū)Ｐ园麅?nèi)病原體。通過本文方法減毒的微生物可以是細菌、原生動物、病毒或真菌。當微生物是細菌時，細菌可以是但不限于，例如分枝桿菌屬(i^co6ac"r/咖)物種。分枝桿菌屬物種的例子包括但不限于，結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌(#.Mr")、牛分枝桿菌菌林BCG包括BCG亞株、鳥分枝桿菌(#flW咖)、胞內(nèi)分枝桿菌//3"ace//i//are)、非洲分枝桿菌a/Y/ca/3wzz)、堪薩斯分枝桿菌(尨i^/^as//)、海分枝桿菌鵬r/z咖)、潰瘍分枝桿菌(￥.w/cer雄)和副結(jié)核分枝桿菌(M/7ar"u^rcWos/s)。它還可以是諾卡氏菌屬(iVo""/a)物種，包括星狀諾卡氏菌(肋caiY/iaa^ero/Vw)或皮疽諾卡氏菌(iVocs/Yf/a尸a7^/z7/cs)。這些物種的S0D減少性突變體的構(gòu)建可以實現(xiàn)減毒并給予促凋亡性質(zhì)，其以類似于本文SOD減少性BCG疫苗的方式增加強細胞免疫應(yīng)答的發(fā)展，因為鐵-錳SOD的分泌是分枝桿菌屬(Raynaud等人，1998)和諾卡氏菌屬的許多致病物種的常見和特征性屬性。因此，預(yù)期這些其他分枝桿菌屬物種和諾卡氏菌屬的SOD減少性疫苗也是高度有效的疫苗林。本發(fā)明內(nèi)考慮的其他專性和兼性胞內(nèi)細菌物種的例子包括但不限于，嗜肺軍團菌(Ze#/c/7e"s//7ewz70////a)、其他軍團菌屬(Zeg/ane//s)物種、傷寒沙門氏菌(A/;z^/7e//a07^/')、其他沙門氏菌屬物種、志賀菌屬(W/ge77a)物種、單核細胞增生李斯特氏菌(Z/"er/azz70oc/^e/7es)、金黃色葡萄球菌(5Yfl;7///ococci/saurews)、表皮葡萄球菌(^a;7力/iococcwsep/Ver/z2V/s)、脆弱擬桿菌(^a"ero/^/>a^77/《)、其他擬桿菌屬(勘"ero義？es)物種、肺炎衣原、體(C力/s/zz/if/s/7/7ei7/Bon/se)、沙百艮衣原體(C力/a/Z7yd/a^r在c力o邁sf/s)、鶴鴻衣/^、體(f力/a邊/d/apj/ffac/)、4白氏柯克斯體(Cojr/e"ato7e〃/)、其他立克次氏體屬"/cire"Wa/)物種和埃里希氏體屬(^r/Zc力/a)物種。此外，在家畜、動物和寵物中引起疾病的細菌可以是本發(fā)明的方法的靼。獸醫(yī)細菌性病原體的例子包括但不限于，流產(chǎn)布魯桿菌a6o"ws)和其他布魯桿菌屬()物種、鼠疫耶爾森氏菌(ye"/.//s戸〃s)、溶血巴斯德菌(戶a"e"re"a力ae節(jié)/Wcfl)、多殺巴斯德菌(Pa"ei/re/7a節(jié)/^"a)和其他巴斯德菌屬(戶a^ez/re/7a)物種、胸膜肺炎放線桿菌(Jc〃/3o^ci//i^;7/e"ro;7/7e"/ffo/7/fl)、反芻類考德里氏體(CoFw/"'flrwz/;7a/7〃wzO、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種(脫肝/咖subspecies/7flr""6ercu/0"s)和依氏李斯特菌(""er/a^/zor//)。對其宿主細胞發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)的其他胞內(nèi)微生物(如原生動物和真菌)可能變得減毒和促凋亡，并因此當主要介導抗凋亡效應(yīng)的微生物酶的活性減少時，其用作疫苗株。因此，本發(fā)明提供了修飾原生動物以增強原生動物的免疫原性的方法，其包括減少由原生動物產(chǎn)生的抗凋亡酶的活性，由此原生動物在受試者中具有增強的免疫原性，和修飾真菌以增強真菌的免疫原性的方法，其包括減少由真菌產(chǎn)生的抗凋亡酶的活性，由此真菌在受試者中具有增強的免疫原性。本發(fā)明設(shè)想的原生動物和真菌物種的例子包括但不限于，惡性瘧原蟲(jp/as/i70cr/uiZ7/*(g/c//7flrwzO、其他癡yf、蟲屬(戶/as邊ocf/wz)物種、剛地弓形蟲(7V，/a纖go/2cf//)、卡氏肺囊蟲(尸ie咖ocy"/s^2/7/7/7)、克氏錐蟲(7^y/a"oso邊scrz/z/)、其他錐蟲屬(7y/;a刀(^o邁a)物種、杜氏利什曼原蟲(Ze/s/鵬/2/ado/20M/3/)、其他利什曼原蟲屬(^e/sA邊a/j/a)種類、環(huán)形泰勒蟲(7%e//er/aa/7/2u7ata)、其他泰勒蟲屬(r/e/7eWs)物種、柔嫩艾美爾球蟲(i7邊eWa^"e/h)、其他艾美蟲屬(&'/z/er/a)物種、莢膜組織胞漿菌(capsi/7"咖)、新型隱球菌(Otp^occi/s/2eo尸or鵬/2s)、皮炎芽生菌(A/a"咖/ces(/er/z/"/"/)、粗球孢子菌(Co"Wo2es/卿/〃s)、巴西縣'J球孢子菌(尸aracocc/d/'o/es6ra"'/2'e/7"'51)、馬爾尼菲青霉(戶e/n'c/"/咖邁ar/2e/Te/)和念珠菌屬(CsJ3&a)物種。用于產(chǎn)生原生動物和酵母物種的重組和減毒突變體的方法已得到描述，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，在剛地弓形蟲中用于插入誘變的轉(zhuǎn)染技術(shù)和載體以及異種抗原表達已得到描迷(Chiang等人，1999;Charest等人，2000)。因為剛地弓形蟲的45l輔因子化的S0D已得到描述(0dberg-Ferragut等人，2000)，所以此類載體和方法可以用于減少其生產(chǎn)，或另一種抗凋亡酶的產(chǎn)生，其通過使用等位失活、反義技術(shù)、靶向增加的減毒作用或顯性/陰性方法。類似地，錐蟲屬和利什曼原蟲屬物種易于DNA轉(zhuǎn)化和染色體整合(Brooks等人，2000;Dumas等人，1997),從而使得類似操作成為可能。用于在真菌病原體中執(zhí)行遺傳操作的方法近期也已變得可用(Retallack等人，1999;Woods、Heinecke和Goldman,1998;Varma和Kwon-Chung，2000;Enoloe、Diamond和Mitchell,2000;Wilson等人,2000)。提供了依照本發(fā)明的方法制備的原生動物，與依照本發(fā)明的方法制備的真菌一樣。因此，本發(fā)明的一個具體實施方案提供了針對肺結(jié)核的活疫苗，其通過經(jīng)由過量表達顯性失活突變體SOD酶來減少結(jié)核分枝桿菌菌林中的鐵-錳超氧化物歧化酶(SOD)的活性而衍生。本發(fā)明提供了制備微生物疫苗的方法，其包括減少由微生物產(chǎn)生的抗凋亡酶的活性，其中抗凋亡酶的活性的降低使微生物減毒，由此產(chǎn)生微生物疫苗。本發(fā)明提供了制備微生物疫苗的方法，其包括減少減毒微生物中由微生物產(chǎn)生的抗凋亡酶的活性，由此產(chǎn)生微生物疫苗。本發(fā)明提供了包含微生物的組合物，所述微生物包含通過本發(fā)明的方法修飾的酶。該組合物可以進一步包含藥學上可接受的載體或合適的佐劑。此類組合物可以用作疫苗。經(jīng)修飾的細菌可以包括選自下述的顯性失活突變體a)其中天然存在的核酸中的核苷酸缺失、插入和/或置換編碼減少生物的SOD活性的分子的SodA;和b)其中天然存在的核酸中的核苷酸缺失、插入和/或置換編碼減少生物的谷氨酰胺合酶活性的分子的谷氨酰胺合酶。在一個實施方案中，經(jīng)修飾的細菌可以是BCG。因此，提供了經(jīng)修飾以表達降低的SOD活性的BCG。經(jīng)修飾的細菌可以包含進一步的促凋亡修飾。進一步的促凋亡修飾可以包含選自SigH的失活、sigE的失活、SecA2的失活、硫氧還蛋白的失活、硫氧還蛋白還原酶的失活和谷氧還蛋白的失活的一種或多種修飾。因此，提供了經(jīng)修飾以表達降低的SOD活性和減少或無活性的SigH的BCG。提供了經(jīng)修飾以表達降低的S0D活性、降低活性或無活性的SigH和降低活性或無活性的sigE的BCG。還提供了經(jīng)修飾以表達降低的SOD活性、降低活性或無活性的SigH、降低活性或無活性的sigE和降低活性或無活性的SecA2的BCG。經(jīng)修飾的細菌的具體例子在實施例和表1中得到描述。例如，經(jīng)修飾的細菌可以包含具有在第28位上的組氨酸和第76位上的組氨酸缺失的突變體SodA，具有在第28位上的組氨酸或第76位上的組氨酸缺失的突變體SodA，具有在第54位上的谷氨酸缺失的突變體SodA，具有在第54位上的谷氨酸缺失和第"位上用精氨酸置換組氨酸的突變體SodA。在進一步的例子中，經(jīng)^^飾的細菌可以包含選自下述的修飾SodA的突變體和s/^^的活性降低突變；SodA的突變體和的活性降低突變；SodA的突變體、W^7的活性降低突變和se"2的活性降低突變；以及SodA的突變體、glnAl的顯性失活突變體、s/g^的活性降低突變和se^2的活性降低突變。作為經(jīng)修飾的細菌的進一步例子，細菌可以包含選自下述的glnAl突變在氨基酸54位上的天冬氨酸和在氨基酸335位上的谷氨酸缺失；和在氨基酸54位上的天冬氨酸或在氨基酸335位上的谷氨酸缺失。具有減少的glnAl活性的細菌可以進一步包含sed2的活性降低突變。具有減少的glnAl活性的細菌可以進一步包含SodA的顯性失活突變體。在具有減少的glnAl活性和SodA的顯性失活突變體的細菌中，突變體SodA可以包含在第28位上的組氨酸和第76位上的組氨酸缺失。具有減少的glnAl活性的細菌可以進一步包含s/^y的活性降低突變和se"2的活性降低突變。具有減少的glnAl活性的細菌可以進一步包含SodA的顯性失活突變體和^>#的活性降低突變。在具有減少的glnAl活性和SodA的顯性失活突變體的細菌中，顯性失活突變體是具有在第54位上的谷氨酸缺失的突變體SodA。在具有減少的glnAl活性和SodA的顯性失活突變體的細菌中，顯性失活突變體是具有在第28位上的組氨酸和第76位上的組氨酸缺失的突變體SodA。在具有減少的glnAl活性和SodA的顯性失活突變體的細菌中，細菌可以進一步包含SodA的顯性失活突變體和sec^的活性降低突變。提供了制備說明書、表l、實施例和附圖中描述的細菌的方法。本發(fā)明的經(jīng)修飾的細菌可以包含s的活性降低突變。該經(jīng)修飾的細菌可以包含s/^y的活性降低突變和"d》的活性降低突變。本發(fā)明另外提供了通過給受試者施用本發(fā)明的任何組合物在受試者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，所述任何組合物包括包含藥學上可接受的載體和微生物的組合物，所述微生物包含已根據(jù)本文教導的方法進行修飾的體內(nèi)存活力所需的酶。該組合物可以進一步包含如本文所描述的合適的佐劑。受試者可以是哺乳動物并且優(yōu)選是人，本發(fā)明提供了在受試者中預(yù)防感染性疾病的方法，其包括給受試者施用有效量的本發(fā)明的組合物。除了預(yù)防細菌病如肺結(jié)核外，預(yù)期本發(fā)明可以預(yù)防真菌、病毒和原生動物病因?qū)W的感染性疾病。受試者可以是哺乳動物并且優(yōu)選是人。預(yù)期本發(fā)明的上述組合物可以施用于受試者或受試者的細胞，以給予治療益處或免疫性以預(yù)防感染。因此，本發(fā)明進一步提供了在受試者的免疫細胞中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，其包括使細胞與本發(fā)明的組合物接觸，所述組合物包含其中體內(nèi)存活力所需的酶已通過本文教導的任何方法進行修飾的微生物。細胞可以是體內(nèi)的或離體的，并且可以是但不限于，表達MHCI類的抗原呈遞細胞，如樹突細胞、巨噬細胞或單核細胞。如自始至終所使用的，"受試者"意指個體。因此，"受試者，，可以包括馴養(yǎng)動物，例如貓、狗等，家畜(例如牛、馬、豬、綿羊、山羊等)，實驗動物(例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)和鳥類。優(yōu)選地，受試者是哺乳動物如靈長類動物，和更優(yōu)選地是人。因此，本發(fā)明提供了增強減毒細菌的免疫原性的方法，其包括減少由細菌產(chǎn)生的抗凋亡酶的活性，由此該細菌在受試者中具有增強的免疫原性。通過減少抗凋亡酶的活性進行修飾的細菌可以選自結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、非洲分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、副結(jié)核分枝桿菌、嗜肺軍團菌、其他軍團菌屬物種、傷寒沙門氏菌、其他沙門氏菌屬物種、志賀菌屬物種、單核細胞增生李斯特氏菌、星狀諾卡氏菌、依氏李斯特菌、流產(chǎn)布魯桿菌、其他布魯桿菌屬物種和反芻類考德里氏體。例如，沙門氏菌屬的活減毒菌抹可以使用本發(fā)明進一步進行修飾，以增強其免疫原性和增加其作為針對沙門氏菌感染的疫苗的有效性，并且增強其誘導針對異種抗原的保護性細胞免疫應(yīng)答的能力，所述異種抗原包括來自其他感染性生物的抗原和癌抗原。提供了經(jīng)由構(gòu)建通過減少微生物的抗凋亡酶的生產(chǎn)而構(gòu)建的促凋亡疫苗用于促進抗原呈遞的方法，所述抗凋亡酶包括S0D、硫氧還蛋白、石克氧還蛋白還原酶、谷氨酰胺合成酶和其他氧化還原相關(guān)的酶如谷胱甘肽還原酶(谷氧還蛋白)、其他硫氧還蛋白樣蛋白質(zhì)、其他硫氧還蛋白還原酶樣蛋白質(zhì)、其他谷氧還蛋白樣蛋白質(zhì)、其他硫醇還原酶、及其他蛋白質(zhì)二疏化物氧化還原酶。這些酶中的許多在所有細胞生命形式中是高度保守的，并且許多重疊或等同于使活性氧中間物解毒的酶，這是由于活性氧種類(ROS)作為凋亡觸發(fā)器的核心作用。制備促凋亡疫苗的前提涉及，當病原體在宿主細胞內(nèi)時，來自胞內(nèi)病原體的酶阻斷凋亡的能力，這與結(jié)核分枝桿菌的有毒菌林的情況一樣[Balcewicz-Sablinska,M.K.等人，1998;Keane，J.等人,2000]。例如，由結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生的SodA使超氧化物(02—)解毒，超氧化物是具有由免疫細胞的呑噬細胞氧化酶(NADPH氧化酶)產(chǎn)生的促凋亡生物效應(yīng)的氧化劑。因此，通過減少使由宿主免疫細胞產(chǎn)生的氧化劑失活的SodA和其他微生物酶的活性，可以同時使微生物減毒并增強其抗原的呈遞，因為樹突和其他免疫細胞加工包含微生物抗原的凋亡吞噬細胞(例如，嗜中性粒細胞、單核細胞和/或巨噬細胞)?？梢韵承┛沟蛲鑫⑸锩付粫焕赜绊懪囵B(yǎng)微生物作為疫苗株的能力，并且對于此類酶，傳統(tǒng)分子遺傳學技術(shù)包括等位失活可以用于構(gòu)建經(jīng)修飾的細菌。然而，某些酶對于微生物的存活力是絕對需要的，從而使得它們不能被完全消除。對于這些酶，通過遺傳操縱技術(shù)構(gòu)建具有抗凋亡酶的活性中的部分而不是完全減少的突變體。反義RM過量表達[Coleman，J.等人，1984]在W002/062298中得到描述，其作為用于構(gòu)建具有部分表型的突變株的一種此類策略，并且還強調(diào)了其作為篩選和鑒定哪種必需酶可以減少以給予促凋亡表型的工具的有用性。本發(fā)明概括了用于實現(xiàn)抗凋亡微生物酶的活性中的部分減少的2種另外的策略。第一種策略涉及酶的顯性失活突變體的過量表達。第二種策略涉及控制抗凋亡酶表達的調(diào)節(jié)基因的等位失活。2種策略代表用于穩(wěn)定修飾微生物以給予部分表型的另外方法，由此微生物保留或增加免疫原性但喪失或減少在受試者中的致病性，包含減少但不消除由微生物產(chǎn)生的酶的活性，由此減少酶的活性使微生物減毒或進一步使微生物減毒。顯性失活的酶突變體可以包含產(chǎn)生具有部分酶活性的經(jīng)修飾的酶的突變，或產(chǎn)生完全缺乏酶活性的無效酶的突變。因為在也表達野生型酶的細胞中共表達突變體酶的效應(yīng)一般是全細胞酶活性的降低而不是完全消除，所以這種策略可以針對微生物存活力所需的基因。通過使用顯性失活技術(shù)減少抗凋亡酶的活性的策略可以在野生型菌抹中用作制備部分或完全減毒的菌林同時增加其免疫原性的方法。它還可以應(yīng)用于已減毒的菌林和/或目前的疫苗林，例如以增強用于肺結(jié)核的目前疫苗卡介苗(BCG)的免疫原性。本文提供的構(gòu)建體的例子和用于制備本文構(gòu)建體的構(gòu)建體的例子在表l中提供。本發(fā)明的組合物可以通過用于施用組合物的常用方法以這樣的方式在體內(nèi)施用于有此需要的受試者，以使該組合物與細胞群體接觸。本發(fā)明的組合物可以口服、腸胃外、肌內(nèi)、經(jīng)皮、經(jīng)由皮膚、皮下、體外、局部等施用，盡管口服或腸胃外施用是一般優(yōu)選的。它還可以通過引入循環(huán)或體腔內(nèi)、通過攝取或通過吸入進行遞送。疫苗林被注射或以其他方式與藥學上可接受的液體載體一起遞送給動物，所述液體載體是水或部分水性的，包含無熱原水、鹽水或緩沖溶液。例如，結(jié)核分枝桿菌疫苗將最可能類似于USBCGTice菌株使用的方法，使用無菌多穿刺盤(multipuncturedisk)經(jīng)由皮膚施用。本發(fā)明的組合物的腸胃外施用在使用時一般特征在于注射。注射劑可以以常規(guī)形式制備成液體溶液或懸浮液，適合于在注射前溶解或懸浮于液體中的固體形式，或乳狀液。如本文所使用的，"腸胃外施用"包括皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)和氣管內(nèi)途徑。組合物的劑量依重量、年齡、性別和施用方法而變。在一個實施方案中，化合物的劑量為存活的活減毒微生物菌林的.5x102菌落形成單位-5x108菌落形成單位。更優(yōu)選地，該化合物以存活的活減毒微生物菌林的約1x106菌落形成單位-5x107菌落形成單位的量體內(nèi)施用。該劑量還可以由如要求的個別醫(yī)師基于具體情況進行調(diào)整。組合物可以與所需藥學上可接受的載體或稀釋劑(即，栽體或媒介物)結(jié)合作為包含活性組合物的疫苗，以計算以產(chǎn)生所需治療或免疫效應(yīng)的活性材料的預(yù)定量常規(guī)施用。"藥學上可接受的"意指并非生物學或其他方面不合需要的材料，即該材料可以與所選擇的組合物一起施用于個體，而不引起任何不希望有的生物效應(yīng)，或以有害方式與它所包含于其中的藥物組合物的任何其他組分相互作用。盡管下文提供的例子涉及針對肺結(jié)核的目前疫苗BCG的修飾，但本發(fā)明教導了如何能夠通過表達抗凋亡細菌酶的顯性失活突變體開發(fā)其他胞內(nèi)病原體的疫苗。微生物抗凋亡酶的顯性失活突變體的表達用于減少抗凋亡微生物酶的活性，顯性失活方法超過等位失活的主要效用是，當基因看起來是微生物體外存活所需的時，而不管如何努力富集微生物在其中進行培養(yǎng)的培養(yǎng)基。在這些環(huán)境中，等位失活將干擾突變型細菌的培養(yǎng)，并且使得它不適合于作為疫苗株，并且用于給予具有必需酶的降低活性的部分表型的方法是有利的，所述部分表型使得微生物仍能夠生長。反義技術(shù)和靶向遞增的減毒作用先前已在WO02/062298中得到描述，并且可以用于減少必需的微生物酶的活性。顯性失活的酶突變體的表達表示對于實踐靶向遞增的減毒作用描述的許多方法共有，但在某些重要方面不同的備選策略。歩驟l.抗凋亡微生物酶的鑒定用于鑒定必需和抗凋亡微生物酶的詳細方法已在W002/062298中得到描述。為了驗證減少微生物酶的活性給予促凋亡效應(yīng)，可以使用體外細胞培養(yǎng)技術(shù)(例如，受感染的巨噬細胞)或受感染的動物的細胞或組織的體內(nèi)回收來監(jiān)測宿主細胞凋亡。存在用于監(jiān)測凋亡的大量技術(shù)，包括本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的流式細胞計量術(shù)、TUNEL染色和DNA斷裂測定法。與靶向遞增的減毒作用比較，存在涉及用于實踐顯性失活策略的抗凋亡酶選擇的2個重要差異。首先，對于顯性失活方法，最好選擇具有已知多聚結(jié)構(gòu)的酶，而這對于實踐靶向遞增的減毒作用并不重要。這是因為在前者中減少酶活性的機制被認為由下述介導經(jīng)由突變體酶單體通過干擾酶促活性多聚體的形成，或不利地影響酶活性的三級構(gòu)型中的改變。大量公開的文獻證實，使宿主衍生的氧化劑失活并因此可能具有抗凋亡效應(yīng)的幾種細菌酶在其生物活性形式中是多聚體結(jié)核/牛分枝桿菌/BCG的鐵輔因子化的超氧化物歧化酶是四聚體的[Cooper，J.B.等人，1995]一般而言，硫氧還蛋白作為單體看起來是有生物學活性的，然而，在某些細菌物種中描述的可能存在例外和二聚體形成[Rehse，P.H.等人，2005〗-硫氧還蛋白還原酶在哺乳動物物種[Zhong，L.等人，2000]和某些微生物包括癡原蟲屬物種[Wang，P.F.等人，1999]中形成同二聚體.谷氨酰胺合酶是十二聚體的[Eisenberg，D.等人，2000;Gill，H.S.等人，1999].細菌谷氧還蛋白(谷胱甘肽還原酶)在還原形式中是單體的，但在氧化形式中是二聚體的[Kelley，J.J.，III等人，1997]因此，對于這些酶中的每一種，通過使用如本發(fā)明中教導的顯性失活方法可以減少酶活性。通過使用如WO02/062298中描迷的反義技術(shù)減少SodA活性導致更強的宿主免疫應(yīng)答和針對感染的更大的疫苗誘導的保護[Kernodle，D.等人，2005;Kernodle，D.S.等人，2001]。通過顯性失活策略減少SodA活性具有類似效應(yīng)。其次，盡管顯性失活策略和靶向遞增的減毒作用的實踐并不限于必需的微生物基因，但當該基因是必需的時，這是優(yōu)選靶向遞增的減毒作用超過簡單的等位失活的主要原因。相比之下，在某些微生物中甚至對于非必需基因，使用顯性失活策略存在超過等位失活的某些潛在優(yōu)點。首先，存在遺傳修飾的時間和簡易的考慮，這對于其中難以實現(xiàn)等位失活所需的同源重組的物種尤其是正確的，但對于其基因的過量表達可以在質(zhì)粒或其他栽體上完成。選擇顯性失活的酶突變體的過量表達而不是等位失活的另一個原因是酶是或可能是重要的免疫原。在這種情況下，允許疫苗林繼續(xù)產(chǎn)生酶可能是重要的，因為它可能是免疫應(yīng)答可以針對的靶。因此，當宿主隨后被引起疫苗預(yù)期預(yù)防的疾病的病原體感染時，宿主具有針對病原體的更完全的免疫應(yīng)答庫。這種"抗原庫"考慮在下述情況下并不重要，當促凋亡的活減毒疫苗林單獨用作載體用于表達外源性抗原，并且所需免疫應(yīng)答針對外源性抗原時。這將在下述背景中更詳細地討論用于針對肺結(jié)核接種的促凋亡BCG疫苗對用作載體以針對外源性抗原接種的促凋亡BCG疫苗的性質(zhì)中的差異。在具有已知或懷疑的上文列舉的抗凋亡效應(yīng)的分枝桿菌酶中，SodA和GlnAl(谷氨酰胺合酶)看起來是細菌生長絕對需要的[Dussurget,0.等人，2001;Tullius，M.V.等人，2003]。因此，對制備疫苗而言它們不是等位失活的良好候選物，但可以經(jīng)處理以通過反義技術(shù)、靼向增加的減毒作用或顯性失活方法達到的酶活性中的部分減少。因為SodA和GlnAl已牽涉經(jīng)由結(jié)核分枝桿菌的免疫逃避[Edwards,K.M.等人，2001;Miller,B.H.等人，2000]，并且也由BCG生產(chǎn)，所以它們是用于增強BCG免疫原性的有利靶。下文的例子顯示BCG中的SodA減少的表型也與增強的疫苗功效相關(guān)。歩驟2.產(chǎn)生抗凋亡酶的突變體用于產(chǎn)生用于實踐顯性失活策略的抗凋亡酶的突變體的方法包括在WO02/062298中描述的那些方法，但同樣包含重要的差異。在靶向增加的減毒作用策略中，突變體酶是酶活性的唯一來源。這些突變體可以顯示僅為親代的、天然酶活性的95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、2%等的酶活性。可以產(chǎn)生具有包含在這個活性減少范圍內(nèi)的活性的一系列突變體酶。因此，對于其中靶向增加的減毒作用的實踐具有其最大效用的必需酶，預(yù)期突變體酶具有某些活性。相比之下，在顯性失活策略中，突變體酶可以是完全無效的，顯示出0%的活性。這是因為顯性失活策略基于表達的突變體酶單體和由親代基因編碼的野生型酶單體之間的千擾。這種干擾導致總體酶活性中的減少。這種差異暗示設(shè)計酶突變體以實踐顯性失活策略相對靶向遞增的減毒作用。最值得注意的是，顯性失活策略中使用的突變體酶可能更易于設(shè)計為簡單地使酶的活性部位無效的一種策略。如在wo02/062298中指出的，X射線晶體學數(shù)據(jù)可用于使宿主氧化劑失活的許多細菌酶，包括對活性部位殘基的鑒定。因此，信息可用于幫助指導其中活性部位殘基被消除或替換的酶突變體的構(gòu)建。這種策略在SodA的AH28AH76突變體的構(gòu)建中使用，其中螯合SodA的活性部位鐵的2個組氨酸已被去除(圖2,實施例1)。同樣，在多聚酶中，例如具有十二聚體結(jié)構(gòu)的谷氨酰胺合酶，活性部位通常位于單體之間，并且由超過一種單體的組分形成。這使得能夠設(shè)計突變體酶，其中單體具有影響超過一個活性部位的氨基酸缺失、插入或置換。這種策略在glnAl的AD54AE335突變體的構(gòu)建中使用，glnAl編碼結(jié)核分枝桿菌和BCG的主要谷氨酰胺合酶(圖14)。然而，為了實踐靶向遞增的減毒作用而構(gòu)建的某些突變體酶還可以用于實踐顯性失活策略。例如，當重組BCG菌林注明具有降低的SOD活性時(實施例1),使用W002/062298中描述的用于靶向增加的減毒的技術(shù)，將pLoul-mut-SodA(表l)上的so^突變體等位基因置于BCG內(nèi)，以構(gòu)建BCG(pLoul-mutSodA)(表1)。與野生型基因比較，編碼具有減少酶活性的突變體酶的基因可以具有單個或多個核苷酸差異，導致單個或多個氨基酸缺失、插入和/或置換。核苷酸差異可以通過下述引入使用野生型基因作為底物，并使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種技術(shù)包括基于PCR的方法[Ho，S.N.等人，1989]以達到定點誘變。備選地，包含所需突變的基因可以從新合成。歩驟3:通過微生物表達突變體酶接下來，將編碼突變體酶的基因并入載體內(nèi)，所述栽體整合到細菌的染色體內(nèi)或可以作為質(zhì)粒在細菌內(nèi)穩(wěn)定地維持。用于在BCG和其他分枝桿菌中表達DNA的方法自1987年[Jacobs,W.R.，Jr.等人，1987]后可獲得，是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并且包括由Bloom等人(美國專利5，504，005，重組分枝桿菌疫苗；美國專利5，854，055和美國專利號6，372，478,重組分枝桿菌)教導的技術(shù)，所述專利就其用于表達DNA的方法的教導通過引用在此整體合并)。已有使得基因能夠并入細菌內(nèi)的染色體或質(zhì)粒上的各種基于噬菌體和質(zhì)粒載體和遺傳工具，并且將在其具體使用的文中更詳細地描述。步驟4:鑒定突變型細菌以用作疫苗或用作宿主菌抹以表達異種抗原用于鑒定突變型細菌以用作疫苗的方法在WO02/062298中詳細描述，并且主要涉及觀察動物模型中的應(yīng)答，所述應(yīng)答與增強的疫苗誘導的保護相關(guān)，例如增強的免疫應(yīng)答。就其作為疫苗林或作為載體用于遞送外源性抗原的功能用于評估突變體菌林的另一種方法涉及測定體外酶活性的降低程度的測定法。當那種細菌用于給宿主動物接種時，通常對宿主給予抗凋亡效應(yīng)的酶活性中的減少應(yīng)導致增加的宿主細胞凋亡，并且將預(yù)測是比親代細菌更有免疫原性的疫苗。因此，測量親代細菌和突變型細菌的裂解物和/或上清液中的酶活性可以用于指出特異性突變體酶的顯性失活表達是否已產(chǎn)生總體酶活性中的所需減少。如果總體酶活性通過顯性失活策略減少，并且先前的觀察使增強的疫苗功效與由另一種技術(shù)如反義技術(shù)達到的減少的酶活性關(guān)聯(lián)，隨后預(yù)期具有顯性失活的酶減少的細菌將類似地是更有效的疫苗林?？刂莆⑸锟沟蛲雒干a(chǎn)的S因子和其他調(diào)節(jié)基因的消除歩驟l.抗凋亡微生物酶的調(diào)節(jié)基因的鑒定某些微生物抗凋亡酶的生產(chǎn)在調(diào)節(jié)基因的控制下，所述調(diào)節(jié)基因包括經(jīng)由對啟動子區(qū)的影響控制多基因轉(zhuǎn)錄的S因子。因此，此類基因的等位失活代表減少抗凋亡微生物酶的生產(chǎn)的另外方法，所述酶具有關(guān)于其中幾種抗凋亡酶的活性通過單一基因操作減少的多效性效應(yīng)的潛能?？梢酝ㄟ^其對其他微生物因子包括抗凋亡酶的表達的影響鑒定調(diào)節(jié)基因。關(guān)于導致受感染細胞增強的凋亡的突變體的轉(zhuǎn)位子和其他隨機誘變文庫的篩選不僅產(chǎn)生在抗凋亡酶中具有直接缺陷的突變體，還可以鑒定影響關(guān)鍵的抗凋亡微生物酶的生產(chǎn)的調(diào)節(jié)基因中的突變。在來自不同物種的調(diào)節(jié)因子中存在強同源性，并且某些研究者通過DNA或氨基酸序列基于已知s因子的同源性已鑒定新型2:因子。編碼結(jié)核分枝桿菌的i:因子h(w^o的基因的等位失活已得到描述[Kaushal，D.等人，2002;Manganelli，R.等人，2002;Raman,S.等人，2001，就其使W^7失活的方法的教導通過引用合并入本文]。sigH的失活伴隨對幾種分枝桿菌酶的影響，包括硫氧還蛋白、硫氧還蛋白還原酶和谷氧還蛋白同系物。如下所述將sigH缺失引入BCG的染色體內(nèi)。下文描述了BCGAsigH作為疫苗的增強功效。預(yù)期增強BCG疫苗功效的另一種修飾是s/^的失活。這可以單獨或附加s/^^失活來完成。s/gi"失活還在結(jié)核分枝桿菌對氧化性應(yīng)激的抗性中起作用，并且用于使結(jié)核分枝桿菌中的失活的方法已得到描述[Manganelli,R.等人，2001;Manganelli,R.等人，2004b;Manganelli,R.等人，2004a，就其使s/gf失活的方法的教導通過引用合并入本文]。歩驟2.調(diào)節(jié)基因或抗凋亡微生物酶的失活可以使用等位失活技術(shù)來進行調(diào)節(jié)和S因子基因的失活，其中包括自殺質(zhì)粒載體[Berthet，F(xiàn).X,等人，1998;Hinds,J.等人，1999;Jackson,M.等人，1999;Kaushal，D.等人，2002;Parish,T.等人，2000;Pavelka，M.S.,Jr.等人，1999;Pelicic，V.等人，1997]或分枝桿菌噬菌體衍生的遺傳工具其能夠作為質(zhì)粒在大腸桿菌中復制并使分枝桿菌宿主溶原化[Bardarov，S.等人，1997;Braunstein，M.等人，2002][以及Bardarov等人，美國專利號6，271，034]。這些方法和工具是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。如上所述用于使結(jié)核分枝桿菌中的sigH和sigE失活的具體方法已由幾個研究者團體描述。本文在BCG中的sigH的等位失活中使用的方法在下文顯示。這些例子顯示通過使調(diào)節(jié)基因失活增強細菌的免疫原性，這導致抗凋亡微生物酶減少的活性。使用促凋亡BCG菌株以表達外源性抗原使用顯性失活突變體酶策略構(gòu)建的促凋亡BCG和其他促凋亡細菌疫苗，單獨或與通過E因子基因的失活、反義技術(shù)、或靶向遞增的減毒作用給予的細菌的促凋亡修飾組合，可以用于表達外源性抗原。外源DNA可以是來自其他感染因子的DNA，例如編碼布魯桿菌屬2，4-二氧四氫蝶啶合酶(BLS)的DNA，所述BLS是來自流產(chǎn)布魯桿菌的免疫顯性T細胞抗原[Velikovsky，C.A.等人，2002]。DD-BCGrBLS的構(gòu)建在下文得到描述。外源DNA可以是編碼人免疫缺陷病毒(HIV)、麻滲病毒、其他病毒、細菌、真菌或原生動物物種的抗原的DNA。外源DNA可以是癌抗原。為了在促凋亡BCG中表達外源DM，將目的基因并入載體內(nèi)，所述載體整合到細菌的染色體內(nèi)或可以作為質(zhì)粒在細菌內(nèi)穩(wěn)定地維持。用于在BCG和其他分枝桿菌中表達外源DNA的方法自1987年[Jacobs，W.R.，Jr.等人，1987]后就可獲得，是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并且包括由Bloom等人(美國專利5，504，005，重組分枝桿菌疫苗；美國專利5,854,055和美國專利號6,372,478，重組分枝桿菌)教導的技術(shù)，所述專利通過引用在此整體合并)。使得基因能夠并入細菌內(nèi)的染色體或質(zhì)粒上的各種基于噬菌體和質(zhì)粒載體和遺傳工具是可獲得的，并且將在其具體使用的文中更詳細地描述。通過在促進進入抗原呈遞的凋亡相關(guān)交叉啟動途徑的促凋亡的細菌疫苗中表達外來抗原，將外來抗原引入這種抗原呈遞途徑內(nèi)。此外，它在來自細菌宿主的非常強的共刺激信號的背景中呈遞，所述細菌宿主通過樹突細胞以促進保護性應(yīng)答而不是誘導耐受的方式影響抗原呈遞。因此，這種實踐使得能夠發(fā)展非常強的適應(yīng)性T細胞應(yīng)答，包括CD4和CD8T細胞以及用于CD8T細胞應(yīng)答的CD4輔助，這使用經(jīng)設(shè)計為進入抗原呈遞的外源性或內(nèi)源性途徑的栽體難以實現(xiàn)。通過突變體SOD的過量表達制備的微生物的例子包括但不限于下述其中超氧化物歧化酶的第54位上的谷氨酸被缺失的突變型結(jié)核分枝桿菌或BCG;其中超氧化物歧化酶的第54位上的谷氨酸被缺失和第28位上的組氨酸被精氨酸替換的突變型結(jié)核分枝桿菌或BCG;其中超氧化物歧化酶的第28位上的組氨酸被缺失的突變型結(jié)核分枝桿菌或BCG;其中超氧化物歧化酶的第76位上的組氨酸被缺失的突變型結(jié)核分枝桿菌或BCG;其中超氧化物歧化酶的第28位和第76位上的組氨酸被缺失的突變型結(jié)核分枝桿菌或BCG，其中超氧化物歧化酶的第28位和第76位上的組氨酸被缺失并且在羧基末端處存在甘氨酸至絲氨酸的置換的突變型結(jié)核分枝桿菌或BCG。通過谷氨酰胺合成酶(glnAl)的過量表達制備的微生物的例子包括但不限于下述其中谷氨酰胺合酶的第54位上的天冬氨酸被缺失的突變型結(jié)核分枝桿菌或BCG;其中谷氨酰胺合酶的第335位上的谷氨酸被缺失的突變型結(jié)核分枝桿菌或BCG;其中谷氨酰胺合酶的第54位上的天冬氨酸和第335位上的谷氨酸被缺失的突變型結(jié)核分枝桿菌或BCG。本發(fā)明進一步提供了進一步表達異種抗原的本發(fā)明的減毒微生物。本發(fā)明的促凋亡、減毒的細菌任選能夠表達一種或多種異種抗原。作為一個具體例子，異種抗原在本發(fā)明的SOD減少性BCG細菌中表達。活減毒疫苗具有充當載體用于表達來自其他致病性物種的異種抗原的潛力(Dougan等人，美國專利號5，"0，907;Bloom等人，美國專利號5,504,005)。因此，在抗凋亡或必需酶的表達或活性中有減少的本發(fā)明的微生物可以進一步進行修飾以表達來自不同微生物的抗原。此類抗原可以來自病毒、細菌、原生動物或真菌微生物。重組促凋亡微生物隨后構(gòu)成雙或多價疫苗的基礎(chǔ)。以這種方式，可以經(jīng)由單一疫苗林耙向多種病原體。本發(fā)明提供了制備多價疫苗的方法，其包括用編碼異種抗原的核酸轉(zhuǎn)化本發(fā)明的促凋亡微生物。例如，包含免疫顯性CD4+和CD8+表位的麻滲病毒的抗原可以在S0D減少性BCG中表達，其中通過使用由Bloom等人(美國專利號5，504，005，其通過引用在此整體合并)教導的技術(shù)將編碼目的麻瘆抗原的DM穩(wěn)定整合到本發(fā)明的促凋亡BCG的基因組DNA內(nèi)以實現(xiàn)表達。備選地，編碼抗原的基因可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的用于表達重組抗原的標準技術(shù)在質(zhì)粒載體上表達，例如在pHV203的65kDa熱休克蛋白的啟動子下或在(2'c/)啟動子下在任何染色體整合或質(zhì)粒載體上?？乖瓱o須由完整抗原組成，但可以代表蛋白質(zhì)或糖蛋白的肽。表達麻疹抗原的重組促凋亡BCG疫苗可以替換常規(guī)BCG,作為疫苗用于在具有由于麻滲的嬰兒死亡率高發(fā)生率的發(fā)展中國家中在出生時施用。重組疫苗刺激針對麻滲抗原的細胞免疫應(yīng)答，所述細胞免疫應(yīng)答當由于麻滲的死亡率最高時的生命的前幾年中保護嬰兒。表達麻瘆抗原的重組促凋亡BCG具有超過目前的活減毒麻滲疫苗的優(yōu)點，因為母體抗體的存在干擾6個月前的疫苗接種，使得嬰兒在它們處于死于麻滲的高危險中時的生命期間易受麻疹影響。相反，表達麻疹抗原的重組促凋亡BCG將不被母體抗體滅活，并且可以在生命中的較早點時誘導保護性細胞免疫應(yīng)答。由本發(fā)明預(yù)期的異種麻疹病毒抗原包括但不限于，H糖蛋白(血凝素)、F糖蛋白和M蛋白。由本發(fā)明預(yù)期的感染性病原體的其他異種抗原包括但不限于，瘧疾子孢子的抗原、瘧疾裂殖子的抗原、人免疫缺陷病毒抗原和利什曼原蟲抗原。由本發(fā)明預(yù)期的異種瘧疾抗原包括但不限于，環(huán)子孢子抗原、TRAP抗原、肝臟階段抗原(LSA1、LSA3)、血液階段分子(MSP1、MSP2、MSP3)、PfEMPl抗原、SP166、EBA175、AMA1、Pfs25和Pfs45-48。由本發(fā)明預(yù)期的異種人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)抗原包括但不限于，由e/3hgsg和；o/編碼的蛋白質(zhì)和糖蛋白，包括gpl20、gp41、p24、p17、p7、蛋白酶、整合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶，以及附屬基因產(chǎn)物如tat、rev、vif、vpr、spu和nef。異種HIV抗原包括來自不同HIV進化枝的抗原。異種HIV抗原還包括細胞毒性T淋巴細胞(CTL)逃避表位，其在天然的野生型病毒中未發(fā)現(xiàn)但已顯示在免疫系統(tǒng)的選擇壓力下出現(xiàn)。以這種方式，它的疫苗接種可以優(yōu)先防止使得病毒能夠逃避免疫遏制和代表HIV序列多樣性的主要驅(qū)動力的突變。異種利什曼原蟲屬抗原包括來自任何利什曼原蟲屬物種的抗原，包括但不限于，杜氏利什曼原蟲、嬰兒利什曼原蟲(厶//2尸fl/2^/z7)、恰加斯利什曼原蟲c力a^s/)、亞馬遜利什曼原蟲(厶a邁azcwe/^/s)、熱帶利什曼原蟲(厶"o/7/ca)和碩大利什曼原蟲(Z.鵬》r)。由本發(fā)明預(yù)期的異種利什曼原蟲屬抗原包括但不限于，gp63、p36(LACK)、36-kDa核苷水解酶和巖藻糖-甘露糖-配體(FML)抗原的其他組分、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78、酸性核糖體PO蛋白質(zhì)、動基體樣膜蛋白11、半胱氨酸蛋白酶I和II型、Trp-Asp(WD)蛋白質(zhì)、P4核酸酶、papLe22、TSA、LmSTIl和LeIF。由本發(fā)明預(yù)期的感染性原生動物病原體的其他異種抗原包括但不限于，錐蟲屬物種、血吸蟲屬(Sc//Wo^邊a)物種和剛地弓形蟲的抗原。異種錐蟲屬抗原包括來自任何錐蟲屬物種的抗原，包括克氏錐蟲和布氏錐蟲(rrj77a"o^Ma6rwce/)。由本發(fā)明預(yù)期的異種錐蟲屬抗原包括但不限于，副鞭毛桿蛋白(PFR)，微管相關(guān)蛋白(MAPpl5)，反式唾液酸酶家族(ts)基因ASP-1、ASP-2和TSA-l,75-77-kDa寄生蟲抗原和可變的表面糖蛋白。異種血吸蟲屬抗原包括來自任何血吸蟲屬物種的抗原，包括但不限于，曼氏血吸蟲鵬flio/7/)、日本血吸蟲(S.yapo/z/c"邊)、埃及血吸蟲(S.Afle/nafo6/wzz)、湄公血吸蟲邊eiran^7)和間插血吸蟲(&//zrerca/a^/ff)。由本發(fā)明預(yù)期的異種血吸蟲屬抗原包括但不限于，細胞溶質(zhì)超氧化物歧化酶、嵌膜蛋白質(zhì)Sm23、卡配因的大亞基(Sm-p80)、丙糖磷酸異構(gòu)酶、細絲蛋白、副肌球蛋白、ECL、SM14、IRV5和Sm37-GAPDH。由本發(fā)明預(yù)期的異種弓形蟲屬抗原包括但不限于，GRA1、GRA3、GRA4、SAG1、SAG2、SRS1、R0P2、MIC3、HSP70、HSP30、P30和分泌的23千道爾頓主要抗原。由本發(fā)明預(yù)期的感染性病毒病原體的其他異種抗原包括但不限于，流感病毒，丙型肝炎病毒(HCV)和黃病毒(包括黃熱病毒、登革病毒和日本腦炎病毒)的抗原。由本發(fā)明預(yù)期的異種流感病毒抗原包括但不限于，血凝素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)和M蛋白，其中包括HA和NA的不同抗原亞型。由本發(fā)明預(yù)期的異種HCV抗原包括但不限于，21-kDa核心(C)蛋白，包膜糖蛋白El和E2，以及非結(jié)構(gòu)蛋白NS2、NS3、NS4和NS5。異種HCV抗原包括來自HCV的不同基因型的抗原。由本發(fā)明預(yù)期的異種黃病毒抗原包括衣殼(C)蛋白、包膜(E)蛋白、膜(M)蛋白和非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白。由本發(fā)明預(yù)期的感染性病毒病原體的其他異種抗原包括但不限于，皰滲病毒家族的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白以及糖蛋白，包括單純皰滲病毒(HSV)I和2、巨細胞病毒(CMV)、水痘帶狀皰滲病毒(VZV)和EB病毒(EBV)。由本發(fā)明預(yù)期的異種皰滲抗原包括但不限于，刺突、包膜、內(nèi)膜、核殼體和核心中的結(jié)構(gòu)蛋白和糖蛋白。還預(yù)期了非結(jié)構(gòu)蛋白包括胸苷激酶、DNA聚合酶、核糖核苷酸還原酶和核酸外切酶。由本發(fā)明預(yù)期的感染性病毒病原體的其他異種抗原包括但不限于下述的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白以及糖蛋白輪狀病毒、副流感病毒、人變性肺病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒、狂犬病病毒、oc病毒、乙型肝炎病毒、細小病毒、乳頭狀瘤病毒、天花、出血熱病毒包括馬爾堡和埃博拉、漢坦病毒、脊髄灰質(zhì)炎病毒、甲型肝炎病毒和冠狀病毒包括SARS(嚴重急性呼吸器官綜合征)因子。由本發(fā)明預(yù)期的感染性病原體的其他異種抗原包括但不限于，衣原體屬(C力/a/z/7^'a)物種和支原體屬(#/co/7/fls/z7a)物種的抗原，包括肺炎衣原體、鸚鵡衣原體、沙眼衣原體、肺炎支原體(乂；wewBO/2/s)和豬肺炎支原體(尨力y^w7e"邊o/7/ae)。由本發(fā)明考慮的異種衣原體屬抗原包括但不限于，主要外膜蛋白(M0MP)、外膜蛋白A(0叩A(chǔ))、外膜蛋白2(0mp2)和pgp3。由本發(fā)明預(yù)期的異種支原體屬抗原包括但不限于，熱休克蛋白P42。由本發(fā)明預(yù)期的感染性病原體的其他異種抗原包括但不限于，立克次氏體屬物種的抗原，包括伯氏柯克斯體、普氏立克次氏體(//ci:e""fl;r麵zeir/i)、恙蟲病立克次氏體(及/ci:e"s/fl^i/"i^a/n^力/)和斑療熱群。由本發(fā)明預(yù)期的異種立克次氏體抗原包括但不限于，ompA、ompB、virB基因家族、cap、tlyA、tlyC、恙蟲病立克次氏體的56-kD外膜蛋白和47kDa重組蛋白質(zhì)。由本發(fā)明預(yù)期的感染性病原體的其他異種抗原包括但不限于，細菌性病原體的蛋白質(zhì)和糖蛋白，包括鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、非洲分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種、星狀諾卡氏菌、其他諾卡氏菌屬物種、嗜肺軍團菌、其他軍團菌屬物種、傷寒沙門氏菌、其他沙門氏菌屬物種、志賀菌屬物種、鼠疫耶爾森氏菌、溶血巴斯德菌、多殺巴斯德菌、其他巴斯德菌屬物種、胸膜炎肺炎放線桿菌(Jc"'/7o6ac///^/;7e"ro;w3ewz70/2/ae)、單核細胞增生李斯特氏菌、依氏李斯特菌、流產(chǎn)布魯桿菌、其他布魯桿菌屬物種、反芻類考德里氏體、埃里希氏體屬物種、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、釀膿鏈球菌(5Yre/7"cocci/s/7/oge/7es)、無乳鏈球菌(i^re/7^cocci/sflgs/a"/fle)、炭疽桿菌(Aac27/i/sa/z^rac/s)、大腸軒菌、霍^L弧菌(c力o/erae)、彎曲桿菌屬(Ca/z^y/o6acfer)物種、腦膜炎奈瑟氏球菌(A^"ser/a邊e/7/7^/〃if/)、淋病奈瑟氏球菌d'wer/fl^/7orr/efl)、銅綠假單胞菌(/^ewt/o銜/7SSaeri^/z70Sfl)、其他假單胞菌屬(戶seMo邁o"fls)物種、流感嗜血桿菌(〃(3e/zop力27"s//7/7ue""ae)、杜氏嗜血桿菌(^e，A//i/"i/cre//')、其他嗜血桿菌屬(化，力//^)物種、梅毒密螺旋體(7yepo/7eiZ7fl;7a///ify/z7)、其他密螺旋體屬(7>e/70i3e/zfl)物種、鉤端螺旋體屬(Ze;^os//ra)物種、疏螺旋體屬(Aorre7/a)物種、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(rem'力/fle/^ero//"")及其他耶爾森氏菌屬(fe"http://7/fl)物種0同樣，本發(fā)明的微生物可以進一步進行修飾以表達癌抗原用于作為針對惡性贅生物的免疫療法使用。由本發(fā)明預(yù)期的異種癌抗原包括但不限于，酪氨酸酶，睪丸癌抗原(MAGE-1、-2、-3、-12)，G-250，p53，Her-2/neu，HSP105,前列腺酸性磷酸酶(PAP)，HPV16的E6和E7癌蛋白，707丙氨酸脯氨酸(707-AP)(TakahashiT等人，ClinCancerRes.1997Aug;3(8):1363-70);甲(oc)-胎蛋白(AFP)(登記號CAA79592(氨基酸)，登記號Z19532(核酸))；由T細胞4識別的腺癌抗原(ART-4)(登記號BAA86961(氨基酸)，登記號AB026125(核酸))；B抗原(BAGE)(登記號NP-001178(氨基酸)，登記號NNL001187(核酸))；b-連環(huán)蛋白/突變型(RobbinsPF等人，Amutatedbeta-cateningeneencodesamelanoma-specificantigenrecognizedbytumorinfiltratinglymphocytes.JExpMed.1996Marl;183(3):1185-92.);斷點蔟區(qū)域-Abelson(Bcr-abl)(登記號CAA10377(氨基酸)，登記號AJ131467(核酸))；黑素瘤上的CTL-識別抗原(CAMEL)(登記號CAA10197(氨基酸)，登記號AJ012835(核酸));癌胚抗原肽-1(CAP-1)(TsangKY,PhenotypicstabilityofacytotoxicT-celllinedirectedagainstanimmunodominantepitopeofhumancarcinoembryonicantigen.ClinCancerRes.1997Dec;3(12Pt1):2439-49);半胱天冬酶-8(CASP-8)(登記號NP—001219(氨基酸)，登記號NM-001228(核酸))；突變型細胞分裂周期27(CD27m);突變型細胞周期蛋白依賴激酶4(CDK4/m);癌胚抗原(CEA)(登記號AAB59513(氨基酸)，登記號M17303(核酸)；癌/睪丸(抗原)(CT);親環(huán)蛋白B(Cyp-B)(登記號P23284(氨基酸))；黑素瘤分化抗原(DAM)(DAM-6和DAM-10的表位相同，但基因序列不同)(DAM-6/MAGE-B2-登記號NP一002355(氨基酸)，登記號NM-002364(核酸))(DAM-10/MAGE-B1-登記號NP—002354(氨基酸)，登記號麗_002363(核酸))；突變型延伸因子2(ELF2m);E-26轉(zhuǎn)化特異性(Ets)變體基因6/急性髓樣白血病l基因ETS(ETV6-AML1);糖蛋白250(G250);G抗原(GAGE)(登記號AAA82744(氨基酸))；N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶V(GnT-V);糖蛋白lOOkD(GplOO);解旋酶抗原(HAGE);人表皮受體-2/神經(jīng)學(HER2/neu)(登記號AAA58637(氨基酸)和M11730(核酸)；HLA-A2基因中a2結(jié)構(gòu)域的a螺旋的殘基170處的精氨酸(R)交換至異亮氨酸(I)(HLA-A*0201-R170I);人乳頭狀瘤病毒E7(HPV-E7);突變型熱休克蛋白70-2(HSP70-2M);人印章戒腫瘤-2(HST-2);人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT或hTRT);腸羧基酯酶(iCE);KIAA0205;L抗原(LAGE);低密度脂受體/GDP-L-巖藻糖39(LDLR/FUT):b-D-半乳糖苷酶2-a-L-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶；黑素瘤抗原(MAGE)，由T細胞識別的黑素瘤抗原-1/黑素瘤抗原A(MART-1/Melan-A)(登記號Q16655(氨基酸)和BC014423(核酸)；黑素皮質(zhì)素1受體；肌球蛋白/m;粘蛋白1(MUC1)(登記號CAA56734(氨基酸)X80761(核酸))；黑素瘤擴散變異l，2，3(MUM-1，-2，-3);患者M88的NAcDNA克隆(NA88-A);NewYork食管1(NY-ES0-1);蛋白質(zhì)15(P15);190KDbcr-abl蛋白質(zhì)；早幼粒細胞白血病/視黃酸受體a(Pml/RARa)，黑素瘤優(yōu)先表達的抗原(PRAME)(登記號AAC51160(氨基酸)和U65011(核酸))；前列腺特異性抗原(PSA)(登記號AAA58802(氨基酸)和X07730(核酸));前列腺特異性膜抗原((PSM)(登記號AAA60209(氨基酸)和AFO07544(核酸))；腎抗原(RAGE)(登記號AAH53536(氨基酸)和NM-014226(核酸))；腎遍在蛋白1或2(RU1或RU2)(RU1登記號AAF19794(氨基酸)和AF168132(核酸)或RU2登記號AAF23610(氨基酸)AF181721(核酸))；肉瘤抗原(SAGE)(登記號NP一005424(氨基酸)和NM-018666(核酸))；由T細胞識別的鱗狀抗原l或3(SART-1或SART-3)(SART-1登記號BAA24056(氨基酸)和醒-005146(核酸)或SART-3登記號BAA78384(氨基酸)AB020880(核酸))；易位Ets-家族白血病/急性髓樣白血病1(TEL/AML1);突變型丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI/m);酪氨酸酶相關(guān)蛋白l(TRP-1)(登記號NP—000541(氨基酸)和NM一00055Q(核酸))；酪氨酸酶相關(guān)蛋白2(TRP-2)(登記號CAA04137(氨基酸)和AJ000503(核酸))；TRP-2/內(nèi)含子2;和威爾姆氏腫瘤基因(WT1)(登記號CAC39220(氨基酸)和BC032861(核酸))，其通過引用合并入本文。公開方法和組合物的微生物可以使用針對細菌修飾的公開的世代方法進行構(gòu)建。下文列表顯示了用于將與增強的免疫原性相關(guān)的促凋亡表型引入BCG內(nèi)的優(yōu)選修飾的另外組合。第一代a.SAD-BCG(也稱為"SD-BCG[mut，，)b.SIG-BCG(也稱為"BCG」s/^")c.SEC-BCG(也稱為"BCG」se"7，)d.GLAD-BCG(也稱為"GSD-BCG[mut")第二代a.SAD-SIG-BCG(也稱為"BCGJ[mutsoW]")b.SAD-SEC-BCG(也稱為"BCG」sec〃[mutsoW]")c.DD-BCG(也稱為"BCGJsed7，，"雙重缺失BCG")d.GLAD-SIG-BCG(也稱為"BCGJ[mut")e.GLAD-SEC-BCG(也稱為"BCGJsec"[mut^訓")f.GLAD-SAD-BCG(也稱為"BCG[mutsoW，mutg/訓")第三代a.3D-BCG(也稱為"BCGWg〃ZUec〃[mutso"]"，"第三代BCG，，)。基于進行表達以減少總體SOD活性的顯性失活突變體SodA的性質(zhì)，存在多重預(yù)期的3D-BCG菌林。顯性失活突變體sodA基因可以;故插入DD-BCG的染色體上或在質(zhì)粒上表達。b.GLAD-DD-BCG(也稱為"BCG」s/^y」sed2[mut")c.GLAD-SAD-SIG-BCG(也稱為"BCG」W^[muts我mut)d.GLAD-SAD-SEC-BCG(也稱為"BCG2isec"[mutso",mut一7]")第四代4D-BCG(也稱為"BCGJsec"[muts<W，mut"，"第四代BCG")。存在4個主要類型的4D-BCG。全部涉及給DD-BCG添加顯性失活的sodA和glnAl突變體，但在其中插入基因的位置上不同。形式1-突變體sodA和glnAl等位基因插入染色體內(nèi).形式2-突變體sodA和glnAl等位基因在質(zhì)粒上表達形式3-突變體sodA等位基因插入染色體內(nèi)并且突變體glnAl等位基因在質(zhì)粒上表達41形式4-突變體sodA等位基因在質(zhì)粒上表達并且突變體glnAl等位基因插入染色體內(nèi)因為w'^y的失活影響多重細菌因子的表達，其中某些是免疫應(yīng)答的重要靶，所以用表達受s^"控制的一種或多種抗氧化劑的失活(或顯性失活突變體酶表達)取代s/^y的失活具有優(yōu)點。這些包括硫氧還蛋白、硫氧還蛋白還原酶、谷氧還蛋白同系物和涉及mycothiol生產(chǎn)的生物合成酶[Kaushal，D.等人，2002;Manganelli，R.等人，2002;Raman，S.等人，2001]，其是類似于哺乳動物谷胱甘肽的小分子量還原劑。當促凋亡BCG菌林用于針對肺結(jié)核給宿主接種時，這種處理可以具有超過使s/^"失活的優(yōu)點，因為使宿主對作為免疫靶的受控制的因子應(yīng)答的益處可以超過具有較不可能抑制凋亡的疫苗林的益處。相反的，本文描述的^>#失活的疫苗是用于表達外源性抗原的理想栽體，因為當經(jīng)修飾的BCG菌林主要用于誘導針對外源性抗原的免疫應(yīng)答，例如用于針對其他感染因子或癌抗原免疫接種時，BCG的完整或接近完整的抗原庫的存在并不重要。為了進一步教導如何實踐使s/^y調(diào)節(jié)的抗凋亡基因失活而不是使s/^7失活的取代，設(shè)計以使硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶失活的突變體等位基因顯示于圖22和圖23中。這種方法可應(yīng)用于除BCG外的牛分枝桿菌菌株。本文公開的pbBCG疫苗比親代BCG疫苗株更有免疫原性。此外，每個疫苗代顯示出免疫原性的遞增。與BCG比較，它們顯示出下述性狀1.它們在初次接種期間誘導性質(zhì)上和數(shù)量上不同的CD4+T細胞應(yīng)答模式，具有更高的IL-2生產(chǎn)峰和更少的延長IFN-Y釋放(實施例13，圖26和27)。這2種差異在產(chǎn)生記憶T細胞方面可以是重要的。首先，IL-2增強抗原特異性T細胞的存活，并且是產(chǎn)生強二次應(yīng)答所需的。其次，盡管IFN-Y是激活M①s的效應(yīng)T細胞的通常測量的效應(yīng)子作用，但它在初級增殖的收縮期間促進T細胞凋亡。2.它們誘導針對二次暴露的更快速的回憶T細胞應(yīng)答。在先前用3DBCG進行SubQ接種的小鼠中在攻擊后5天內(nèi)檢測到強T細胞應(yīng)敘實施例l4，圖28)。這有利地比較在第11-14天時達到最高點的BCG接種的小鼠中的回憶應(yīng)答。總之，結(jié)果顯示經(jīng)修飾的BCG誘導對疫苗接種更佳的免疫應(yīng)答。本發(fā)明在下述實施例中更具體地進行描述，所述實施例意在僅作為舉例說明性的，因為其中眾多的修飾和改變對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。用于執(zhí)行WO02/062298中描述的基因操作的方法、細菌分離物、質(zhì)粒和其他工具就這些組合物和方法的教導通過引用在此整體并入。實施例一般方法。細菌分離物、質(zhì)粒、化學藥品和培養(yǎng)基使用的細菌分離物和質(zhì)粒顯示于表l中。除非另有說明，大腸桿菌菌林TOP10用作用于克隆PCR產(chǎn)物的宿主，和大腸桿菌菌林DH5ct用作用于其他分子遺傳操作的宿主。大腸桿菌菌林在LB培養(yǎng)基(Gibco/BRL，Gaithersburg，Maryland)中生長。BCGTice在補充有0.2%甘油、10%Middlebrook0ADC強4匕劑(BectonDickinson&Co.,Cockeysvi1le,Maryland)和.05%Tween80的Middlebrook7H9液體培養(yǎng)基(DifcoLaboratories,Detroit,Michigan)中生長。備選地，它在補充有甘油和OADC的Middlebrook7H10瓊脂(Difco)上生長。在大腸桿菌dh5oc或bcg中使用濃度為50mg/ml或25mg/ml的卡那霹素、濃度為50jug/ml的阿泊拉霉素、或濃度為100Mg/邁1或50jug/ml的潮霉素，以選擇包含質(zhì)?；蛉旧w整合載體的轉(zhuǎn)化株?；蛘T變。關(guān)于鐵輔因子化的超氧化物歧化酶(sodA)和谷氨酰胺合酶(glnAl)的基因從結(jié)核分枝桿菌菌林H37RV的染色體DNA中進行PCR擴增，并且在大腸桿菌中復制的質(zhì)粒中進行克隆。存儲在TubercuList網(wǎng)頁月艮務(wù)器(http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/site)中，也存儲在Genbank中的DNA序列數(shù)據(jù)用于指導DM引物的構(gòu)建。使用基于PCR的引物重疊延伸法[Ho，S.N.等人，1989]的定點誘變或其他方法用于消除、置換、或添加核苷酸。這產(chǎn)生編碼具有氨基酸缺失、置換或添加的突變體酶的突變基因?；蛐蛄型ㄟ^DNA測序加以證實。備選地，基因合成技術(shù)可以用于生產(chǎn)具有所需序列的基因。突變體酶基因在BCG中的表達。將編碼突變體酶的基因連接到一種或多種下述載體內(nèi)pMH94、pHV202、pMP349和pMP399。其他載體也可以用于實踐本發(fā)明。突變體SodA在染色體整合熟練(proficient)載體pLoul中的表達使用克隆的野生型sodA啟動子，作為用于實踐如WO02/062298中所述靼向遞增的減毒作用的備選策略的部分來實現(xiàn)。等位基因插入分枝桿菌染色體上的W"噬菌體整合位點內(nèi)。PMH94-mutsodA的轉(zhuǎn)化林長得比親代BCG菌林更慢。這些菌林的這些緩慢生長類似于在這樣的結(jié)核分枝桿菌和BCG菌林中觀察到的緩慢生長表型，在結(jié)核分枝桿菌和BCG菌林中反義過量表達技術(shù)已用于減少SOD活性。認識到這表示突變體SodA表達的顯性失活效應(yīng)，突變體SodA隨后在pMP349和pMP399中進行表達。在這些構(gòu)建體中，sodA啟動子被消除，并且突變體SodA開放讀碼框置于包括用于flcd(也稱為/c/)的啟動子的350+堿基對區(qū)域后[Graham,J.E.等人，1999;McKinney，J.D.等人,2000;McKinney，J.D.等人，2000〗。kpnl限制位點用于連接，并且啟動子-Kpnl位點突變體SodA讀碼框的全序列顯示于實施例1中。aceA啟動子是巨噬細胞誘導型的，并且表達還可以在體外進行調(diào)節(jié)，在待表達的基因干擾細菌生長時這個特征提供了潛在優(yōu)點。涉及在pMP399中表達的突變體SodA的結(jié)果顯示于實施例和附圖中。突變體glnAl在pMP349和pMP399中的表達使用克隆的glnAl啟動子來進行。載體使用標準方法[Hondalus，M.K.等人，2000]電穿孔到BCGTice內(nèi)，除了當分枝桿菌培養(yǎng)物的&。。達到0.6時，它們在37t:和5%C02中與1.5%甘氨酸和50ug/ml間-氟-DL-苯丙氨酸(MFP)—起溫育48小時，以增強電穿孔效率。將分枝桿菌洗滌2次并且重懸浮于水冷的10%甘油中。對于在25F和2.5kV下的所有電穿孔4吏用GenePulser設(shè)備和PulseController輔助設(shè)備(Bio-RadLaboratories,Hercules,California),而脈沖控制器設(shè)定為1000歐姆。電穿孔后，向樣品中加入1mlMiddlebrook7H9培養(yǎng)基，并且允許轉(zhuǎn)化林在37。C和5%0)2中溫育24小時。將轉(zhuǎn)化抹^L據(jù)需要在包含卡那霉素、阿泊拉霉素或潮霉素的Middlebrook7H10瓊脂上鋪板。成功的轉(zhuǎn)化通過對載體構(gòu)建體獨特的DM的PCR加以證實。酶量和活性的測定法。顯性失活突變體酶策略涉及在細菌中表達突變體酶單體，其以減少由細菌產(chǎn)生的酶的總體活性的方式與細菌的自身染色體編碼的野生型酶單體相互作用。因此，為了獲得證實顯性失活策略中的成功的信息，進行非酶促測定法以測量酶量(例如，Western雜交法)以及酶活性測定法。結(jié)果是與親代BCG菌林比較，突變型BCG菌林顯示可比較的或升高的酶量(圖17)但減少的酶活性(圖16)。為了制備用于酶活性測定法的上清液和裂解物，通過使洗滌的細胞團塊重懸浮于25m1包含0ADC的7H9肉湯中以達到0.5的A600值來制備每種BCG菌林的新鮮培養(yǎng)物。肉湯無需振蕩生長72小時。將該肉湯培養(yǎng)物離心并使上清液與細胞團塊分開。使用基于離心機的分離裝置與10，000kDA膜通過使25ml上清液濃縮至1.0ml來制備用于酶活性測定的濃縮上清液。通過使細胞團塊重懸浮于1ml磷酸鹽緩沖鹽水中并用微珠攪拌器設(shè)備進行裂解來制備用于測試酶活性的裂解物。來自不同菌株的裂解物調(diào)整至標準A280值用于比較。Western雜交用于定量SOD的量。將由如上所述制備的未稀釋的細胞裂解物組成的樣品調(diào)整至標準A280值，應(yīng)用于12%PAGE凝膠，并在12%PAGE凝膠上進行電泳，并且轉(zhuǎn)移至HybondECL硝酸纖維素膜(Amersham，ArlingtonHeights,IL)。使膜與4f對PAGE純化的重組SodA產(chǎn)生的兔多克隆抗血清雜交，所述重組SodA如前所述在大腸桿菌中表達[Lakey，D.L.等人，2000]。用于產(chǎn)生抗體的重組SodA通過鎳親和柱層析法進行純化。硝酸纖維素膜首先與以上文所述的稀45釋度的抗血清一起溫育，隨后與1:IOOO稀釋的辣根過氧化物酶-綴合的羊抗兔抗體(BoehringerMannheim,Indianapolis,Indiana)—起溫育。免疫印跡用ECLWestern印跡檢測試劑(AmershamPharmacia,ArlingtonHeights,Illinois)進行顯色。SOD活性通過其干擾經(jīng)由過氧化物還原細胞色素C的能力進行分光光度計測量，其中使用利用黃噤呤氧化酶產(chǎn)生的過氧化物以及基于McCord和Fridovich的方法[McCord，J.M.等人，1969;Beyer,W.F.Jr等人，1987]的商品化試劑盒。l個SOD單位被定義為使細胞色素C還原減少50%的SodA量(IC50值)。谷氨酰胺合酶活性通過使用Woolfoik等人的方法[Woolfolk，C.A.等人，1966]進行分光光度計測量。體內(nèi)攻擊-保護研究。為了制備用于注入C57BL/6小鼠內(nèi)的疫苗株接種物，使BCGTice7H10肉湯(含孔雀綠并去除瓊脂的7H10瓊脂制劑)中生長。將懸浮液進行稀釋以達到在Klett-S薩ersonColorimeter(KlettManufacturing,Brooklyn,NY)上100Klett單位讀數(shù)(約5x107cfu/ml)。將接種物的等分試樣進行系列稀釋，并且直接在包含10%0ADC的7H10瓊脂上鋪板用于逆向計數(shù)(backcounts)，以測定精確的接種量。5-6周齡的雌性C57BL/6小鼠購自JacksonLaboratories,BarHarbor,Maine。受感染的和未感染的對照小鼠養(yǎng)殖于SyracuseVAMedicalCenter的無病原體BiosafetyLevel-3實驗室中。動物實驗得到SyracuseVAMCSubcommitteeonAnimalStudies的批準并且在AALAC批準的實驗室中進行。除非另有說明，關(guān)于接種攻擊實驗的實驗設(shè)計包括5x106cfu疫苗林的皮下接種，休息100天，并隨后用300cfuErdman或acrR-Erdman菌林的氣溶膠接種物進行攻擊，通過0)2吸入來達到安樂死。脾和右肺進4亍無菌摘除，將組織置于與Glas-ColHomogenizer(TerreHaute，IN)附著的密封的研磨部件(IdeaWorks！LaboratoryProducts,Syracuse,NY)中，并進行均漿?；罴毎嫈?shù)通過在包含10。/。0ADC的7H10瓊脂平板上滴定來測定。組織病理學評估從小鼠中獲取左肺并在10%福爾馬林(Accustain，Sigma)中進行固定。將肺進行石蠟包埋、切成4-jam切片并用蘇木精和伊紅進行染色。流式細胞計量術(shù)和組織染色。細胞群體在Becton-DickinsonFACScalibur流式細胞儀與MacWorkstation上進行分析。數(shù)據(jù)以表格方式進行收集，并且脫機分析使用PC平臺Winlist軟件(VeritySoftwareHouse,TopshamMaine)來進行。用于流式細胞計量術(shù)的抗體購自BDPharmingen(SanDiego,California),樣品與大鼠抗小鼠抗CD16/CD32克隆2.4G2(FcBlock,BDPharmingen)—起溫育15分鐘以降低背景。每個樣品中收集總共10，000個門控事件，并且分析門包括基于細胞大小和粒度淋巴的細胞門和非淋巴細胞門，而門尺寸在實驗之間保持不變。實施例1.SAD-BCGAH28AH76[也稱為"BCG(mutsodAAH28AH76)"，或"表達顯性失活的AH28AH76突變體SodA的SodA-減少性BCG"]的構(gòu)建和體外降低的SOD活性的證明。為了構(gòu)建SAD-BCGAH28AH76，通過在野生型sodA等位基因上進行基于PCR的定點誘變來制備pCR2.1-T0P0中的AH28AH76突變體，所述野生型sodA等位基因已從來自結(jié)核分枝桿菌H37Rv的染色體DM進行PCR擴增。AH28AH76突變體so^等位基因的開放讀碼框顯示在下文中。起始和終止密碼子是粗體的，和-一顯示對應(yīng)酶的氨基酸28和氨基酸76的2個缺失CAC(編碼組氛酸)的位置。SEQIDNO:11一gtggccgaatacaccttgccagacctggac31-tgggactacggagcactggaaccgcacate61-tegggtcagateaacgagcttcac---age91一aagcaccacgccacctacgtaaagggcgcc121—aatgacgccgtcgccaaaetcgaagaggcg151—cgcgccaaggaagatcacteagcgatettg181—ctgaacgaaaagaatctagetttcaacetc211—gccggccacgtcaat—accatetggtgg241—aagaacctgtegcctaacggtggtgacaag271一cccaccggcgaaetcgccgcagccategcc301—gacgcgttcggttegttcgacaagttccgt331—gcgcagttccacgcggccgetaccaccgtg361—caggggtegggctgggcggcactgggctgg391—gacacaetcggcaagctgctgatattc421—caggtttacgaccaccagacgaacttcccg451—ctaggcattgttccgctgctgctgetcgac481—atgtgggaacacgccttctacctgcagtac511—aagaacgtcaaagtcgactttgccaaggcg541—ttttggaacgtcgtgaactgggccgatgtg571—cagteaeggtatgcggccgcgacctegcag601—accaaggggttgatattcggctgaSodA單體的主要a螺旋、P鏈和活性部位Fe(III)中的這些氨基酸缺失的位置顯示于圖1中。這種DNA序列針對全部結(jié)核分枝桿菌H37Rv序列的核普酸序列的BLASTN查詢使用TubercuList萬維網(wǎng)站(http:〃genolist.pasteur.fr/TubercuList/)的BUST月艮務(wù)器來進行，證明2個CAC(組氨酸)密碼子的缺失。^結(jié)核分枝桿菌H37Rvl無毒結(jié)核分枝桿菌H37RV(4411532bp)長度=4411532分數(shù)=1181bits(596),預(yù)期=0.0同一性=618/624(99%)，缺口=6/624(0%)鏈=+/+題4320704gtggccgaaUcaccttgccagacctggactgggactacggagcactggaaccgcacatc4320763查詢61主題4320823查詢118主題4320883tcgggtcagatcaacgagcttcac—agcaagcaccacgccacctacgtaaagggcgcc1174320764tcgggtcagatcaacgagcttcaccacagcaagcaccacgccacctacgtaaagggcgccaatgacgccgtcgccaaactcgaagaggcgcgcgccaaggaagatcactcagcgatcttg1774320824aatgacgccgtcgccaaactcgaagaggcgcgcgccaaggaagatcactcagcgatcttg查詢178ctgaacgaaaagaatctagctttcaacctcgccggccacgtcaat---accatctggtgg234主題4320884ctga8LCgaa8L8Lgaatctagctttcaacctcgccggccacgtcaatcacaccatctggtgg4320943查詢235aagaacctgtcgccUacggtggtgacaagcccaccggcgaactcgccgcagccatcgcc294主題43209444321003查詢295gacgcgttcggttcgttcgacaagttccgtgcgcagttccacgcggccgcUccaccgtg354主題4321004gacgcgttcggttcgttcgacaagttccgtgcgcagttccacgcggccgctaccaccgtg4321063查詢355caggggtcgggctgggcggcactgggctgggacacBctcggcaacaagctgctgaUttc414主題"210"caggggtcgggctgggcggcactgggctgggacacactcggcaacaagctgctgatattc4321123查詢415caggtttacgaccaccagacgaacttcccgctaggcattgttccgctgctgctgctcgac474主題4321124caggtttacgaccaccagacgaacttcccgctaggcattgttccgctgctgctgctcgac4321183查詢475主題4321243atgtgggaacacgccttctacctgcagtacaagaacgtcaaagtcgactttgccaaggcg5344321184atgtgggaacacgccttctacctgcagtacaagaacgtcaaagtcgactttgccaaggcg查詢535主題4321244UUggaacgtcgtgaactgggccgatgtgcagtcacggtatgcggccgcgacctcgcag4321303查詢595accaaggggttgatattcggctga618(SEQIDNO:2)主題4321304accaaggggttgatattcggctga4321327(SEQIDNO:3)還在TubercuListBUST網(wǎng)站(http〃genolist.pasteur.fr/TubercuList/)上針對翻譯的核苷酸序列數(shù)據(jù)進行TBLASTN查詢，顯示缺失的組氨酸的位置。結(jié)核分枝桿菌H37Rvl無毒結(jié)核分枝桿菌H37RV("11532bp)長度=441153250分數(shù)=418bits(1075)，預(yù)期-e-118同一性=205/207(99%)，陽性=205/207(99%)，缺口=2/207(0%)框=+2查詢1VAEYTLPDLDWDYGALEPHISGQINELH-SKHHATYVKGANDAVAKLEEARAKEDHSAIL59主題4320704VAEYTLPDLDWDYGALEPHISGQINELHHSKHHATYVKGANDAVAKLEEARAKEDHSAIL4320883查詢60LNEKNLAFNLAGHVN-TIWWKNLSPNGGDKPTGELAAAIADAFGSFDKFRAQFHAAATTV118主題4320884L匿NLAFNLAG證HT雨KNLSPNGGDKPTGELAAAIADAFGSFDKFRAQFHAAATTV4321063查詢119QGSGWAALGWDTLGNKLLIFQVYDHQTNFPLGIVPLLLLDMWEHAFYLQYKNVKVDFAKA178主題4321064QGSGWAALGWDTLGNKLLIFQVYDHQTNFPLGIVPLLLL隨EHAFYLQYKNVK，AKA4321243查詢179FWNVVNWADVQSRYAAATSQTKGLIFG205(SEQIDNO:4)主題4321244FWNVVNWADVQSRYAAATSQTKGLIFG4321324(SEQIDNO:5)還在SangerCentre(http://www,Sanger,ac.uk/cgi-bin/blast/submitblast/m一bovis)的牛分枝桿菌BLAST服務(wù)器中針對核苷酸序列數(shù)據(jù)進行BLASTN和TBLASTN查詢。SangerCentre測序牛分枝桿菌BCGPasteur,并且使用初級牛分枝桿菌BCG裝配。結(jié)果(下文)顯示除了2個CAC密碼子缺失外，在BCG中存在在第203位上產(chǎn)生I今T氨基酸置換的另外T-C核苷酸差異。BLASTN結(jié)果>BCG79c08.slk19151bp,160reads,36.25AT長度=19，151+鏈HSPs:分數(shù)=3021(459.3bits)，預(yù)期-6.4e-132'P=6.4e-132同一性=617/624(98%)，陽性-617/624(98%)，鏈-+/+[HSP序列]查詢1GTGGCCGAATACACCTTGCCAGACCTGGACTGGGACTACGGAGCACTGGAACCGCACATC60主題11156GTGGCCGAATACACCTTGCCAGACCTGGACTGGGACTACGGAGCACTGGAACCGCACATC11215查詢61TCGGGTCAGATCAACGAGCTTCAC--—AGCAAGCACCACGCCACCTACGTAAAGGGCGCC117主題11216TCGGGTCAGATCAACGAGCTTCACCACAGCAAGCACCACGCCACCTACGTAAAGGGCGCC11275查詢118AATGACGCCGTCGCCAAACTCGAAGAGGCGCGCGCCAAGGAAGATCACTCAGCGATCTTG177主題11276AATGACGCCGTCGCCAAACTCGAAGAGGCGCGCGCCAAGGAAGATCACTCAGCGATCTTG11335查詢178CTGAACGAAAAGAATCTAGCTTTCAACCTCGCCGGCCACGTCAAT—-ACCATCTGGTGG234主題11336CTGAACGAAAAGAATCTAGCTTTCAACCTCGCCGGCCACGTCAATCACACCATCTGGTGG11395查詢235AAGAACCTGTCGCCTAACGGTGGTGACAAGCCCACCGGCGAACTCGCCGCAGCCATCGCC294主題11396AAGAACCTGTCGCCTAACGGTGGTGACAAGCCCACCGGCGAACTCGCCGCAGCCATCGCC11455查詢295GACGCGTTCGGTTCGTTCGACAAGTTCCGTGCGCAGTTCCACGCGGCCGCTACCACCGTG354主題11456GACGCGTTCGGTTCGTTCGACAAGTTCCGTGCGCAGTTCCACGCGGCCGCTACCACCGTG11515查詢355CAGGGGTCGGGCTGGGCGGCACTGGGCTGGGACACACTCGGCAACAAGCTGCTGATATTC414主題11516CAGGGGTCGGGCTGGGCGGCACTGGGCTGGGACACACTCGGCAACAAGCTGCTGATATTC11575查詢"5CAGGTTTACGACCACCAGACGAACTTCCCGCTAGGCATTGTTCCGCTGCTGCTGCTCGAC47452主題11576CAGGTTTACGACCACCAGACGAACTTCCCGCTAGGCATTGTTCCGCTGCTGCTGCTCGAC11635查詢475ATGTGGGAACACGCCTTCTACCTGCAGTACAAGAACGTCAAAGTCGACTTTGCCAAGGCG534主題11636ATGTGGGAACACGCCTTCTACCTGCAGTACAAGAACGTCAAAGTCGACTTTGCCAAGGCG11695查詢535TTTTGGAACGTCGTGAACTGGGCCGATGTGCAGTCACGGTATGCGGCCGCGACCTCGCAG594主題11696TTTTGGAACGTCGTGAACTGGGCCGATGTGCAGTCACGGTATGCGGCCGCGACCTCGCAG11755查詢595ACCAAGGGGTTGATATTCGGCTGA618(SEQIDNO:6)主題11756ACCAAGGGGTTGACATTCGGCTGA11779(SEQIDNO:7)TBLASTN結(jié)果>BCG79c08.slk19151bp,160reads,36.25AT[全長序列]長度=19,151+鏈HSPs:分數(shù)=1076(383.8bits),預(yù)期=3.6e-109,P=3.6e-109同一性=204/207(98%),陽性=204/207(98%),框=+2[HSP序列]查詢1VAEYTLPDLDWDYGALEPHISGQINELH-SKHHATYVKGANDAVAKLEEARAKEDHSAIL59主題11156VAEYTLPDLDWDYGALEPHISGQINELHHSKHHATYVKGA飄VAKLEEARAKEDHSAIL11335查詢60LNEKNLAFNLAGHVN-TIWWKNLSPNGGDKPTGELAAAIADAFGSFDKFRAQFHAAATTV118主題11336LNEKNLAFNLAGHV脂IW訓LSPNGGDKPTGELAAAIADAFGSFDKFRAQFHAAATTV11515查詢119QGSGWAALGWDTLGNKLLIFQVYDHQTNFPLGIVPLLLLDMWEHAFYLQYKNVKVDFAKA178主題:11516QGSGWAALGWDTLGNKLLIFQVYDHQTNFPLGIVPLLLL隨EHAFYLQYKNVKVDFAKA11695查詢179FWNVVNWADVQSRYAAATSQTKGLIFG205(SEQIDNO:8)主題11696FWNVVNWADVQSRYAAATSQTKGLTFG11776(SEQIDNO:9)接下來，將突變體sodA等位基因連接到染色體整合載體pMP399和質(zhì)粒栽體pMP349內(nèi)aceA(icl)啟動子后，以產(chǎn)生pMP399-mutSodA△H28AH76和pMP349-mutSodAAH28AH76(表l)。質(zhì)粒圖譜顯示于圖2中，并且這些構(gòu)建體的全部核苷酸序列包括在表l的腳注中。下文顯示的序列著重突出通過突變體sodA開放讀碼框的aceA(icl)啟動子的核苷酸序列。關(guān)鍵特征是[a]編碼aceA(icl)相關(guān)啟動子的序列(堿基5044-堿基5385)，[b]關(guān)于sodA(AH28AH76)突變體的開放讀碼框(堿基9-堿基626)，和[c]用于連接[a]和[b的Kpnl限制位點(堿基1-堿基8):SEQIDNO:105041ctgttacaacgctcacatatgtggttggcgacgagcccaaggcagtcgcctcgctgt5101tcaatctgtgaccggatccgcaggacgtcgatccgtgggtttacctgcggatttgtcgtt5161actggcgggtagcttctgaaacggttcagtttttgggcgacttcgcaaaatttgcaaaaa5221gtccgcaggccgttgccgaaattcgcaagtgaaatgggtggaccagcgttgacacgctgt5281gccatggtcgagtUgcacaccagtgaagctgcgccgttgacaccgcctggacgacggta5341gggcgtcaicgttttcggcaatgaaagaccgttaaggagttgtct1ggtaccccgtggccgaatacaccttgccagacctggactgggactacggagcactggaac61cgcacatctcgggtcagatcaacgagcttcacagcaagcaccacgccaccUcgUaagg121gcgccaatgacgccgtcgccaaactcgaagaggcgcgcgccaaggaagatcactcagcga181tcttgctgaacgaaaagaatCUgCtttCBacctcgccggccacgttaataccatctggt241ggaagaacctgtcgcctaacggtggtgaca8Lgcccaccggcgaactcgccgcagccatcg301ccgacgcgttcggttcgttcgacaagttecgtgcgcagttccacgcggccgcUccaccg361tgcaggggtcgggctgggcggcactgggctgggacacacteggcaacaagctgetgatat421tccaggtttacgaccaccagacgaactteccgctaggcattgttccgctgctgctgctcg481acatgtgggaacacgccttctacctgeagtacaagaacgtcaaagtcgactttgecaagg541cgttttggaacgtcgtgaactgggccgatgtgcsgtcacgg"tgcggccgcgacctcgc601agaccaaggggttgatattcagctga接下來，將pMP399-mutSodA△H28AH76電穿孔到BCGTice內(nèi)，以產(chǎn)生SAD-BCGAH28AH76(SodA-減少性BCG，也稱為BCG(mutsodAAH28AH76)。在包含阿泊拉霉素的瓊脂上選擇轉(zhuǎn)化抹。使用對pMP399栽體獨特的核苷酸序列的染色體DM的PCR用于驗證載體成功整合到BCG染色體內(nèi)。為了測定突變體AH28AH76SodA表達對整個細菌的SOD活性的影響，如上所述制備BCG和SAD-BCG△H28△H76的上清液和裂解物，并且通過監(jiān)測干擾(通過SOD)經(jīng)由黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生的超氧化物(02-)的細胞色素C還原就SOD活性進行比較。結(jié)果顯示于圖3中，并證實大多數(shù)活性可以在上清液中發(fā)現(xiàn)，并且顯性失活策略導致SOD活性中約8-16倍的減少。實施例2.SAD-BCGAE54[akaBCG(mutsodAAE54)，或表達顯性失活的厶E54突變體SodA的SodA減少性BCG]的構(gòu)建和體外降低的SOD活性的證明使用描述的技術(shù)構(gòu)建具有△E54缺失的另外的顯性失活的SodA突變體。SodA單體的主要oc螺旋、P鏈和活性部位Fe(III)中的這個氨基酸缺失的位置顯示于圖1中。pCR2.1-T0P0中的基因的DM測序鑒定在第28位上引入組氨酸^精氨酸置換的另外核普酸置換。將突變體AE54sodA等位基因連接到染色體整合栽體pMP399和質(zhì)粒載體pMP349內(nèi)aceA(icl)啟動子后，以產(chǎn)生pMP399-mutSodA△E54和pMP349-mutSodAAE54(表l)。這些構(gòu)建體的全部核苷酸序列包括在表l的腳注中。將pMP399-mutSodAAE54電穿孔到BCGTice內(nèi)，以產(chǎn)生SAD-BCGAE54(SodA-減少性BCG，也稱為BCG(mutsotU△E54)。為了測定突變體AE54SodA表達對整個細菌的S0D活性的影響，如上所述制備BCG和SAD-BCGAE54的上清液和裂解物，并且就SOD活性進行比較。結(jié)果顯示于圖4中，并證實總體SOD活性中比用SAD-BCGAH28AH76觀察到的較不顯著的減少。實施例3.SD-BCG-AS-SOD的疫苗功效-暗示關(guān)于顯性失活的SodA減少性BCG菌株的有用性。為了定量由于經(jīng)由BCG減少SodA生產(chǎn)而發(fā)生的疫苗功效中的改善量，比較BCG和SD-BCG-AS-S0D(通過使用如在WO02/062298中先前描述的反義技術(shù)構(gòu)建的SodA減少性BCG)。實驗細節(jié)和結(jié)果顯示于圖5中，并且說明與用BCG接種后6個月用有毒結(jié)核分枝桿菌氣溶膠攻擊的小鼠比較，用SD-BCG-AS-SOD接種的C57B1/6小鼠具有更少的cfu計數(shù)和更少的肺損害。在分開的接種-攻擊實驗中，C57B1/6小鼠進行皮下接種，休息100天，并且在用有毒結(jié)核分枝桿菌氣溶膠攻擊后4、10和18天時收獲用于分析肺中的T細胞應(yīng)答。與用BCG接種的小鼠比較，用SD-BCG-AS-SOD接種的小鼠顯示出在攻擊后第4天時是CD44+/CD45RBhigh的更多數(shù)目的CD4+和CD8+T細胞，以及在第18天時是0044+/00451181168的更多數(shù)目的CD4+T細胞(圖6)。T細胞應(yīng)答中的這些差異與早期攻擊后肺的組織病理學外觀中的差異相關(guān)，包括高恩損害的更快速的發(fā)展(圖7)?；谶@些結(jié)果和本文其他地方報道的結(jié)果，預(yù)期用通過如上所述使用顯性失活突變體SodA表達構(gòu)建的SAD-BCG菌林的疫苗功效可比較的增強。實施例4.SIG-BCG(也稱為BCGAsigH)的構(gòu)建和疫苗評估。評估了減少經(jīng)由BCG產(chǎn)生的其他抗氧化劑對疫苗功效的影響。如上所述，sigH是涉及針對氧化性應(yīng)激的細菌應(yīng)答的S因子，并調(diào)節(jié)硫氧還蛋白、硫氧還蛋白還原酶和谷氧還蛋白同系物的生產(chǎn)。在BCGTice的染色體上的sigH通過使用WilliamJacobs,Jr.fromAlbertEinsteinCollegeofMedicine的質(zhì)泮立系統(tǒng)進行滅活，其中使用用于將這種系統(tǒng)應(yīng)用于使分枝桿菌中的基因失活的公開方法[Braunstein，M.等人，2002]。將sigH的上游和下游區(qū)克隆到pYUB854內(nèi)，以構(gòu)建等位失活栽體-pYUB854-sigH的DNA序列顯示于表1的腳注中，并且這種載體的圖和特征顯示于圖8中。用于構(gòu)建SIG-BCG(BCGAsigH)的備選策略涉及使用如上文所描述和引用的自殺質(zhì)粒載體的使用，所述自殺質(zhì)粒栽體的使用是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。SIG-BCG作為疫苗進行檢測。C57B1/6小鼠用BCG或SIG-BCG進行皮下接種，休息100天，并隨后用有毒結(jié)核分枝桿菌的AcrR-Erdman菌林通過氣溶膠進行攻擊。在攻擊后6個月時，與用BCG接種的小鼠比較，用SIG-BCG接種的小鼠具有有毒結(jié)核分枝桿菌的更少的肺cfu計數(shù)(圖9)和更少的肺損害(圖10)。隨著時間過去用有毒結(jié)核分枝桿菌攻擊的SIG-BCG接種的小鼠肺的組織病理學外觀顯示與上文關(guān)于用SD-BCG-AS-SOD接種的小鼠顯示的結(jié)果(實施例4)的類似處-最值得注意的是在用SIG-BCG疫苗接種的小鼠中高恩損害的較早發(fā)展，及其隨著時間過去的明顯消退(圖11)對應(yīng)具有較少的肺cfu計數(shù)。實施例5.SAD-SIG-BCG，"第二代促凋亡BCG疫苗"的構(gòu)建，和體外降低的SOD活性的證明。如實施例3和4中例示的2種不同的促凋亡BCG疫苗(SD-BCG-AS-S0D和SIG-BCG)增加的疫苗功效顯示宿主產(chǎn)生的氧化劑在宿主免疫應(yīng)答中具有重要功能。微生物抗氧化劑干擾氧化劑的這些重要功能(圖12)，并由此破壞發(fā)展強保護性免疫應(yīng)答所需的早期信號。涉及各自具有單一遺傳修飾的2種促凋亡BCG疫苗的實施例3和4中的觀察指出在經(jīng)由BCG的抗氧化劑生產(chǎn)中引入2種或更多缺陷產(chǎn)生更有效的疫苗。如上所述，微生物產(chǎn)生一批不同的抗凋亡酶，其中許多涉及使宿主氧化劑失活。圖13顯示用于使BCG(和結(jié)核分枝桿菌)中的遺傳修飾組合以引入1、2、3或4種遺傳操作的策略，所述遺傳操作減少抗氧化劑生產(chǎn)，分別產(chǎn)生第一代、第二代、第三代和第四代促凋亡疫苗。為了產(chǎn)生"第二代"促凋亡BCG疫苗，將顯性失活突變體sodA表達載體(pMP399-mutSodAAH28AH76;pMP349-mutSodAAH28△H76;pMP399-mutSodAAE54;和pMP349-mutSodAAE54)電穿孔到SIG-BCG內(nèi)以產(chǎn)生SAD-SIG-BCG。關(guān)于這些菌林的裂解物和上清液的SOD活性測定法的結(jié)果顯示于圖l4中，并證實SOD活性中與用第一代SAD-BCG疫苗顯示的類似的減少。顯性失活的AH28AH76sodA突變體的過量表達導致SOD活性中比AE54sodA突變體的過量表達57(約4倍)更大的減少(約8倍)。實施例6，DD-BCG(也稱為BCGAsigHAsecA2)的構(gòu)建通過使用實施例4中概述的方法來產(chǎn)生另一種"第二代"促凋亡BCG疫苗，以使SEC-BCG(也稱為"BCGAsecA2")的染色體上的sigH失活以產(chǎn)生DD-BCG，這是"雙重缺失BCG"的縮寫。圖15顯示證明DD-BCG的成功構(gòu)建的Southern雜交膜。實施例7.3D-BCG的構(gòu)建和體外降低的SOD活性的證明。為了產(chǎn)生"第三代"促凋亡BCG疫苗，將顯性失活突變體sodA表達載體(pMP399-mutSodAAH28AH76;pMP349-mutSodAAH28△H76;pMP399-mutSodAAE54;和pMP349-mutSodAAE54)電穿孔到DD-BCG內(nèi)，以產(chǎn)生3D-BCG。對這些菌林的裂解物和上清液的SOD活性測定法的結(jié)果顯示于圖16中。與涉及其中SOD活性在上清液中占優(yōu)勢的(圖3、4、14)SAD-BCG和SAD-SIG-BCG的結(jié)果相反，圖16A中的結(jié)果顯示DD-BCG和3D-BCG中的SOD活性在細胞裂解物中占優(yōu)勢。這種逆轉(zhuǎn)的發(fā)生是由于BCG中secA2的失活破壞關(guān)于SodA的分泌通道，致使其被細菌阻止而不是細胞外分泌。SodA在這些菌林的裂解物中的這種定位促進其他技術(shù)的使用以定量SodA的量。圖17顯示比較SodA的量的SDS-PAGE和Western印跡結(jié)果，所述SodA的量通過在SDS-PAGE上的23-kDaSodA條帶的直接觀察并且與兔多克隆抗SodA抗體雜交(Western)后測定的。這些結(jié)果指出盡管由其中AH28AH76和AE54SodA突變體已過量表達的3D-BCG分離物顯示的SOD活性顯著減少，但存在可比較的SodA蛋白質(zhì)的量。這指出AH28AH76和AE54SodA突變體的過量表達誘導顯性失活效應(yīng)，千擾SodA的生物活性，盡管總體(野生型加突變型)SodA蛋白質(zhì)的量可比較。這些結(jié)果還指出實踐顯性失活突變體SodA策略與secA2的等位失活組合具有優(yōu)點。與沒有這種缺失的菌株比較，在具有secA卩缺失的菌抹中的總體SOD活性中似乎存在更大的總體減少。例如，盡管具有過量表達的顯性失活的△H28△H76SodA突變體的SAD-BCG和SAD-SIG-BCG分離物顯示出總體SOD活性中8-16倍的減少(圖3、14)，但當將AH28AH76SodA突變體加入DD-BCG時，減少看起來是32倍或更多(圖16)。類似地，當將AE54SodA突變體置于DD-BCG內(nèi)時，達到SOD活性中比BCG或SIG-BCG中(圖4，14;2-4倍的減少)更大的減少(圖16;16倍的減少)。實施例8.給3D-BCG添加顯性失活的谷氨酰胺合酶以產(chǎn)生4D-BCG疫苗。亡效應(yīng)。谷氨酰胺合酶(也稱為"谷氨酰胺合成酶")催化谷氨酸鹽和氨之間的反應(yīng)，以產(chǎn)生谷氨酰胺。結(jié)核分枝桿菌和BCG在其染色體上具有編碼谷氨酰胺合酶或同系物的幾個等位基因。這些中的一個glnAl大量生產(chǎn)且細胞外分泌。為了構(gòu)建4D-BCG，通過在野生型glnAl等位基因上進行基于PCR的定點誘變來構(gòu)建pCR2.1-T0P0中的顯性失活glnAl突變體，所述野生型glnAl等位基因已從來自結(jié)核分枝桿菌H37Rv的染色體DNA進行PCR擴增。AD54AE335突變體glnAl等位基因的開放讀碼框在下文顯示。起始和終止密碼子是粗體的，并且-一顯示對應(yīng)酶的氨基酸54和氨基酸335的2個缺失密碼子的位置。SEQIDNO:111—gtgacggaaaagacgcccgacgacgtcttc31—aaacttgccaaggacgagaaggtcgaatat61-gtcgacgtceggttctgtgacctgcctggc91_ateatgcagcacttcacgattccggetteg121—gcctttgacaagagegtgtttgacgacggc151—ttggccttt—ggctegtegattcgcggg181一ttccagtegatecacgaatecgacatgttg211一cttcttcccgatcccgagacggcgcgcate241_gacccgttccgcgcggccaagacgctgaat271一ateaacttctttgtgcacgacccgUcacc301—ctggagccgtacteccgcgacccgcgcaac331—ategcccgcaaggccgagaactacctgate361—ageactggcategccgacaccgcatacttc391—ggcgccgaggccgagttctacattttcgat421—tcggtgagettcgactcgcgcgccaacggc451一tecttctacgaggtggacgccatetcgggg481—tggtggaacaccggcgcggcgaccgaggcc511一gacggcagtcccaaceggggctacaaggtc541一cgccacaagggcgggUtUcccagtggcc571—cccaacgaccaatacgtcgacctgcgcgac601—Bagatgctgaccaacctgateaactecggc631一Ucatectggagaagggccaccacgaggtg661—ggcageggcggacaggccgagateaactac691—cagttcaattcgctgctgcacgccgccgac721_gacatgcagttgtacaagtacateateaag751一aacaccgcctggcagaacggcaaaacggtc781一acgUcatgcccaagccgctgttcggcgac811—aacgggtecggcatgcactgtcatcagtcg841—ctgtggaaggacggggccccgctgatgtac871一gacgagacgggttatgccggtctgtcggac901_acggcccgtcattacateggcggcctgtta931—caccacgcgccgtcgctgctggccttcacc961一aacccgacggtgaactecUcaageggctg991—gttcccggttac—gccccgateaacctg1021-gtctatagecagcgcaaceggtcggcatgc1051-gtgcgcateccgateaccggcageaacccg1081-aaggccaageggctggagttccgaageccc1111一gactcgtcgggcaacccgtatctggcgttc1141—tcggecatgctgatggcaggcctggacggt1171一ateaagaacaagategagccgcaggcgccc1201-gtcgacaaggatetctacgagctgccgccg1231—gaagaggecgcgagtateccgcagactccg1261—acccagctgteagatgtgategaccgtetc1291一gaggecgaccacgaatacetcaccgaagga1321一ggggtgttcacaaacgacctgategagacg1351—tggateagtttcaagcgcgaaaacgagate1381—gagccggtcaacateeggccgcatccctac1411—gaattcgcgctgtacgacgtttaa六聚glnAl環(huán)的活性部位錳鐵中的這些氨基酸缺失的位置顯示于圖18中。因為來自鄰接單體的D54和E335涉及構(gòu)成位于單體之間的活性部位，所以將2個缺失引入單個單體中破壞單體每側(cè)上的活性部位，因為它與野生型單體裝配成環(huán)。因此，它誘導顯性失活效應(yīng)。這種DNA序列針對全部結(jié)核分枝桿菌H37Rv序列的核苷酸序列的BLASTN查詢4吏用TubercuList萬維網(wǎng)站(http:〃genolist.pasteur.fr/TubercuList/)的BLAST月良務(wù)器來進行，證明2個密碼子的缺失?！到Y(jié)核分枝桿菌H37Rvl無毒結(jié)核分枝桿菌H37RV(4411532bp)長度=4411532分數(shù)-2793bits(1409),預(yù)期=0.0同一性=1431/1437(99%),缺口=6/1437(0%)鏈-+/+查詢1gtgacggaaaagacgcccgacgacgtcttcaaacttgccaaggacgagaaggtcgaaUt60主題2487615gtgacggaaaagacgcccgacgacgtcttcaaacttgccaaggacgagaaggtcgaatat2487674查詢61gtcgacgtccggttctgtgacctgcctggcatcatgcagcacttcacgattccggcttcg120主題2487675gtcgacgtccggttctgtgacctgcctggcatcatgcagcacttcacgattccggcttcg2487734查詢121gcctttgacaagagcgtgtttgacgacggcttggccttt—ggctcgtcgattcgcggg177Miiiiiiimiiimiiiimmiiimiiiiiiiiiimmimiii主題2487735gcctttgacaagagcgtgtttgacgacggcttggcctttgacggctcgtcgattcgcggg2487794查詢-178ttccagtcgatccacgaatccgacatgttgcttcttcccgatcccgagacggcgcgcatc237主題24878542487795ttccagtcgatccacgaatccgacatgttgcttcttcccgatcccgagacggcgcgcatc查詢238gacccgttccgcgcggccaagacgctgaatatcaacttcUtgtgcacgacccgttcacc297題2487855gacccgttccgcgcggccaagacgctgaaUtcaacttctttgtgcacgacccgttcacc2487914查詢c298ctggagccgtactcccgcgacccgcgcaacatcgcccgcaaggccgagaactacctgatc357題2487915ctggagccgtactcccgcgacccgcgcaacatcgcccgcaaggccgagaactacctgatc2487974查詢358agcactggcatcgccgacaccgcatacttcggcgccgaggccgagttctacattttcgat417主題2487975agcactggcatcgccgacaccgcatacttcggcgccgaggccgagttctacattttcgat2488034查詢418tcggtgagcttcgactcgcgcgccaacggctccttctacgaggtggacgccatctcgggg477主題2488035tcggtgagcttcgactcgcgcgccaacggctccttctacgaggtggacgccatctcgggg2488094查詢478tggtggaacaccggcgcggcgaccgaggccgacggcagtcccaaccggggctacaaggtc537主題2488095tggtggaacaccggcgcggcgaccgaggccgacggcagtcccaaccggggctacaaggtc2488154查詢538cgccacaagggcgggtatttcccagtggcccccaacgaccaatacgtcgacctgcgcgac597題2488155cgccacaagggcgggtaUtcccagtggcccccaacgaccaatacgtcgacctgcgcgac2488214查詢598aagatgctgaccaacctgatcaactccggcttcatcctggagaagggccaccacgaggtg657主題2488274查詢658tcaattcgctgctgceicgccgccgac717題24882752488334查詢718gacatgcagttgtacaagtacatcatcaagaacaccgcctggcagaacggcaaaacggtc777llllllllllimiMIII主題24883942488335gacatgcagttgtacaagtacatcatcaagaacaccgcctggcagaacggcaaaacggtc查詢778acgttcatgcccaagccgctgttcggcgacaacgggtccggcatgcactgtcatcagtcg837主題2488395acgttcatgcccaagccgctgttcggcgacaacgggtccggcatgcactgtcatcagtcg2488454查詢838cl897主題24884552488514查詢898acggcccgtcattacatcggcggcctgttacaccacgcgccgtcgctgctggcctteacc957主題2488515acggcccgtcattacatcggcggcctgttacaccacgcgccgtcgctgctggccttcacc2488574查詢958aacccgacggtgaactcctacaagcggctggttcccggttac---gccccgatcaacctg1014題24885752488634查詢.'1015gtctatagcc8gcgcaaccggtcggc"gcgtgcgcatcccg"caccggcagcaacccg1074主題2488635gtctatagccagcgcaaccggtcggcatgcgtgcgcatcccgatcaccggcagcaacccg2488694查詢1075aaggccaagcggctggagttccgaagccccgactcgtcgggcaacccgtatctggcgttc1134主題2488695aaggccaagcggctggagttccgaagccccgactcgtcgggcaacccgtatctggcgttc2488754查詢1135tcggccatgctgatggcaggcctggacggtatcaagaacaagatcgagccgcaggcgccc1194主題2488755tcggccatgctgatggcaggcctggacggtatcaagaacaagatcgagccgcaggcgccc2488814查詢1195gtcgacaaggatctctacgagctgccgccggaagaggccgcgagtatcccgcagactccg1254主題24888742488815gtcgacaaggatctctacgagctgccgccggaagaggccgcgagtatcccgcagactccg查詢1255acccagctgtcagatgtgatcgaccgtctcgaggccgaccacgaaUcctcaccgaagga1314主題24889342488875acccagctgtcagatgtgatcgaccgtctcgaggccgaccacgaatacctcaccgaagga查詢1315主題1374查詢1375IDNO:12)1431(SEQ主題2488995gagccggtcaacatccggccgcatccctacgaattcgcgctgtactacgacgttUa2489051(SEQIDNO:13)還在TubercuUstBLAST網(wǎng)站(http:〃genolist.pasteur.fr/TubercuList/)上針對翻譯的核普酸序列數(shù)據(jù)進行TBLASTN查詢，顯示缺失的天冬氨酸和谷氨酸的位置。〉結(jié)核分枝桿菌H37Rvl無毒結(jié)核分枝桿菌H37RV(4411532bp)長度=4411532分數(shù)=973bits(2515),預(yù)期-0,0同一性=476/478(99%)，陽性=476/478(99%)，缺口=2/478(0%)框=+3查詢1VTEKTPDDVFKLAKDEKVEYVDVRFCDLPGIMQHFTIPASAFDKSVFDDGLAF-GSSIRG59VTEKTPDDVFKLAKDEKVEYVDVRFCDLPGIMQHFTIPASAFDKSVF咖LAFGSSIRG主題2487615VTEKTPDD雨LAKDEKVEY麗RFCDLPGIMQHFTIPASAFDKSVFDDGLAFDGSSIRG2487794查詢60FQSIHESDMLLLPDPETARIDPFRAAKTLNINFFVHDPFTLEPYSRDPRNIARKAENYLI119FQSIHESDMLLLPDPETARIDPFRAAKTLNINFFVHDPFTLEPYSRDPRNIARKAENYLI主題2487795FQSIHESDMLLLPDPETARIDPFRAAKTLNINFFVHDPFTLEPYSRDPRNIARKAENYLI2487974查詢120STGIADTAYFGAEAEFYIFDSVSFDSRANGSFYEVDAISGWWNTGAATEADGSPNRGYKV179STGIADTA!TGAEAEFnFDSVSFDSRANGSFYEVDAISGWWNTGAATEADGSPNRGYKV主題2487975STGIADTAYFGAEAEFnFDSVSFDSRANGSFYEVDAISGWWNTGAATEADGSPNRGYKV2488154查詢180RHKGGYFPVAPNDQYVDLRDKMLTNLINSGFILEKGHHEVGSGGQABINYQFNSLLHAAD239RHKGGYFPVAPNDQYVDLRDKMLTNLINSGFILEKGHHEVGSGGQAEINYQFNSLLHAAD主題2488155RHKGGYFPVAPNDQyyDLRDOfJLTNLINSGFILEKGHHEVGSGGQAEINYQFNSLLHAAD2488334查詢240DMQLYKYIIKNTAWQNGKTVTFMPKPLFGDNGSGMHCHQSLWKDGAPLMYDETGYAGLSD299DMQLYKniKNTAWQNGKTVTFMPKPLFGDNGSGMHCHQSLWKDGAPLMYDETGYAGLSD主題2488335DMQLYKYIIKNTAWQNGKTVTFMPKPLFGDNGSGMHCHQSLWKDGAP匿DETGYAGLSD2488514查詢300TARHYIGGLLHHAPSLLAFTNPTVNSYKRLVPGY-APINLVYSQRNRSACYRIPITGSW35866查詢359主題2488874查詢419IDNO:14)TARHYIGGLLHHAPSLLAFTNPTVNSYKRLVPGYAPINLVYSQRNRSACVRIPITGSNP2488515TARHYIGGLLHHAPSLLAFTNPTVNSYKRLVPGYEAPINLVYSQRNRSACVRIPITGSNPKAKRLEFRSPDSSGNPYLAFSAMLMAGLDGIKNKIEPQAPVDKDLYELPPEEAASIPQTP418KAKRLEFRSPDSSGNPYLAFSAMLMAGLDGIKNKIEPQAPVDKDLYELPPEEAASIPQTP2488695KAKRLEFRSPDSSGNPYLAFSAMLMAGLDGIKNKIEPQAPVDKDLYELPPEEAASIPQTPTQLSDVIDRLEADHEYLTEGGVFTNDLIETWISFKRENEIEPVNIRPHPYEFAL\TDV476(SEQTQLSDVIDRLEADHEYLTEGGVFT亂IETWISFKRENEIEPVNIRPHPYEFALYYDV(SEQIDNO:14)主題2488875TQLSDVIDRLEADHEYLTEGGVFTNDLIETWISFKRENEIEPVNIRPHPYEFALYYDV2489048(SEQIDNO:15)還在SangerCentre(http://www.Sanger,ac.uk/cgi-bin/blast/submitblast/m—bovis)的牛分枝桿菌BLAST服務(wù)器中針對核苷酸序列數(shù)據(jù)進行BLASTN和TBLASTN查詢。SangerCentre測序牛分枝桿菌BCGPasteur,并且使用初步牛分枝桿菌BCG裝配。結(jié)果顯示BCGPasteur中的glnAl核苷酸序列等同于結(jié)核分枝桿菌H37Rv中的glnAl核苷酸序列。BLASTN結(jié)果>BCG260cll.qlk3891bp,23reads,35.42AT查詢1431TTAAACGTCGTAGTACAGCGCGAATTCGTAGGGATGCGGCCGGATGTTGACCGGCTCGAT1372主題376TTAAACGTCGTAGTACAGCGCGAATTCGTAGGGATGCGGCCGGATGTTGACCGGCTCGAT435查詢1371CTCGTTTTCGCGCTTGAAACTGATCCACGTCTCGATCAGGTCGTTTGTGAACACCCCTCC1312主題436CTCGTTTTCGCGCTTGAAACTGATCCACGTCTCGATCAGGTCGTTTGTGAACACCCCTCC495查詢1311TTCGGTGAGGTATTCGTGGTCGGCCTCGAGACGGTCGATCACATCTGACAGCTGGGTCGG1252主題496TTCGGTGAGGTATTCGTGGTCGGCCTCGAGACGGTCGATCACATCTGACAGCTGGGTCGG555查詢1251AGTCTGCGGGATACTCGCGGCCTCTTCCGGCGGCAGCTCGTAGAGATCCTTGTCGACGGG1192主題556AGTCTGCGGGATACTCGCGGCCTCTTCCGGCGGCAGCTCGTAGAGATCCTTGTCGACGGG615查詢1191CGCCTGCGGCTCGATCTTGTTCTTGATACCGTCCAGGCCTGCCATCAGCATGGCCGAGAA1132主題616CGCCTGCGGCTCGATCTTGTTCTTGATACCGTCCAGGCCTGCCATCAGCATGGCCGAGAA675查詢1131CGCCAGATACGGGTTGCCCGACGAGTCGGGGCTTCGGAACTCCAGCCGCTTGGCCTTCGG1072主題676CGCCAGATACGGGTTGCCCGACGAGTCGGGGCTTCGGAACTCCAGCCGCTTGGCCTTCGG735查詢1071GTTGCTGCCGGTGATCGGGATGCGCACGCATGCCGACCGGTTGCGCTGGCTATAGACCAG1012主題736GTTGCTGCCGGTGATCGGGATGCGCACGCATGCCGACCGGTTGCGCTGGCTATAGACCAG795查詢1011GTTGATCGGGGC-—-GTAACCGGGAACCAGCCGCTTGTAGGAGTTCACCGTCGGGTTGGT955主題796GTTGATCGGGGCCTCGTAACCGGGAACCAGCCGCTTGTAGGAGTTCACCGTCGGGTTGGT855查詢954GAAGGCCAGCAGCGACGGCGCGTGGTGTAACAGGCCGCCGATGTAATGACGGGCCGTGTC895主題856GAAGGCCAGCAGCGACGGCGCGTGGTGTAACAGGCCGCCGATGTAATGACGGGCCGTGTC915查詢894CGACAGACCGGCATAACCCGTCTCGTCGTACATCAGCGGGGCCCCGTCCTTCCACAGCGA835主題916CGACAGACCGGCATAACCCGTCTCGTCGTACATCAGCGGGGCCCCGTCCTTCCACAGCGA975查詢834CTGATGACAGTGCATGCCGGACCCGTTGTCGCCGAACAGCGGCTTGGGCATGAACGTGAC775主題976CTGATGACAGTGCATGCCGGACCCGTTGTCGCCGAACAGCGGCTTGGGCATGAACGTGAC1035查詢774CGTTTTGCCGTTCTGCCAGGCGGTGTTCTTGATGATGTACTTGTACAACTGCATGTCGTC715主題1036CGTTTTGCCGTTCTGCCAGGCGGTGTTCTTGATGATGTACTTGTACAACTGCATGTCGTC1095查詢714GGCGGCGTGCAGCAGCGAATTGAACTGGTAGTTGATCTCGGCCTGTCCGCCGCTGCCCAC655主題1096GGCGGCGTGCAGCAGCGAATTGAACTGGTAGTTGATCTCGGCCTGTCCGCCGCTGCCCAC1155查詢654CTCGTGGTGGCCCTTCTCCAGGATGAAGCCGGAGTTGATCAGGTTGGTCAGCATCTTGTC595主題1156CTCGTGGTGGCCCTTCTCCAGGATGAAGCCGGAGTTGATCAGGTTGGTCAGCATCTTGTC1215查詢594GCGCAGGTCGACGTATTGGTCGTTGGGGGCCACTGGGAAATACCCGCCCTTGTGGCGGAC535主題1216GCGCAGGTCGACGTATTGGTCGTTGGGGGCCACTGGGAAATACCCGCCCTTGTGGCGGAC1275查詢534CTTGTAGCCCCGGTTGGGACTGCCGTCGGCCTCGGTCGCCGCGCCGGTGTTCCACCACCC475iimiiiiimimimiiiiMMiimiMiiiMiiiimmiiiiiiii主題1276CTTGTAGCCCCGGTTGGGACTGCCGTCGGCCTCGGTCGCCGCGCCGGTGTTCCACCACCC1335查詢474CGAGATGGCGTCCACCTCGTAGAAGGAGCCGTTGGCGCGCGAGTCGAAGCTCACCGAATC415主題1336CGAGATGGCGTCCACCTCGTAGAAGGAGCCGTTGGCGCGCGAGTCGAAGCTCACCGAATC1395查詢414GAAAATGTAGAACTCGGCCTCGGCGCCGAAGTATGCGGTGTCGGCGATGCCAGTGCTGAT355主題1396GAAAATGTAGAACTCGGCCTCGGCGCCGAAGTATGCGGTGTCGGCGATGCCAGTGCTGAT1455查詢354CAGGTAGTTCTCGGCCTTGCGGGCGATGTTGCGCGGGTCGCGGGAGTACGGCTCCAGGGT295主題1456CAGGTAGTTCTCGGCCTTGCGGGCGATGTTGCGCGGGTCGCGGGAGTACGGCTCCAGGGT1515查詢294GAACGGGTCGTGCACAAAGAAGTTGATATTCAGCGTCTTGGCCGCGCGGAACGGGTCGAT235主題1516GAACGGGTCGTGCACAAAGAAGTTGATATTCAGCGTCTTGGCCGCGCGGAACGGGTCGAT1575查詢234GCGCGCCGTCTCGGGATCGGGAAGAAGCAACATGTCGGATTCGTGGATCGACTGGAACCC175主題1576GCGCGCCGTCTCGGGATCGGGAAGAAGCAACATGTCGGATTCGTGGATCGACTGGAACCC1635查詢174GCGAATCGACGAGCC-AAAGGCCAAGCCGTCGTCAAACACGCTCTTGTCAAAGGCCGA118主題1636GCGAATCGACGAGCCGTCAAAGGCCAAGCCGTCGTCAAACACGCTCTTGTCAAAGGCCGA1695查詢117AGCCGGAATCGTGAAGTGCTGCATGATGCCAGGCAGGTCACAGAACCGGACGTCGACATA58主題1696AGCCGGAATCGTGAAGTGCTGCATGATGCCAGGCAGGTCACAGAACCGGACGTCGACATA1755查詢57TTCGACCTTCTCGTCCTTGGCAAGTTTGAAGACGTCGTCGGGCGTCTTTTCCGTCAC1(SEQIDNO:16)主題1756TTCGACCTTCTCGTCCTTGGCAAGTTTGAAGACGTCGTCGGGCGTCTTTTCCGTCAC1812(SEQIDNO:17)TBLASTN結(jié)果>BCG260cll.qlk3891bp,23reads,35.42AT長度=3891-鏈HSPs:分數(shù)=2521(892.5bits)，預(yù)期=9.Oe-264,P=9.Oe-264同一性=476/478(99%)，陽性=476/478(99%)，框=-1[HSP序列〗查詢1VTEKTPDDVFKLAKDEKVEYVDVRFCDLPGIMQHFTIPASAFDKSVFDDGLAF-GSSIRG59VTEKTPDDVFKLAKDEKVEY麗RFCDLPGIMQHFTIPASAFDKSVFDDGLAFGSSIRG主題1812VTEKTPDDVFKLAKDEKVEYVDVRFCDLPGIMQHFTIPASAFDKSVFDDGLAFDGSSIRG1633查詢60FQSIHESDMLLLPDPETARIDPFRAAKTLNINFFVHDPFTLEPYSRDPRNIARKAENYLI119FQSIHESDMLLLPDPETARIDPFRAAKTLNINFFVHDPFTLEPYSRDPRNIARKAENYLI主題1632FQSIHESDMLLLPDPETARIDPFRAAKTLNINFFVHDPFTLEPYSRDPRNIARKAENY1I1453查詢120STGIADTAYFGAEAEFYIFDSVSFDSRANGSFYEVDAISGWWNTGAATEADGSPNRGYKV179STGIADTAYFGAEAEFYIFDSVSFDSRANGSFYEVDAISG鼎NTGAATEADGSPNRGYKV主題1452STGIADTAYFGAEAEFYIFDSVSFDSRANGSFYEVDAISGWWNTGAATEADGSPNRGYKV1273查詢180RHKGGYFPVAPNDQYVDLRDKMLTNLINSGFILEKGHHEVGSGGQAEINYQFNSLLHAAD239RHKGGYFPVAPNDQYVDLRDKMLTNLINSGFILEKGHHEVGSGGQAEINYQFNSLLHAAD主題1272RHKGGYFPVAPNDQYVDLRDKMLTNLINSGFILEKGHHEVGSGGQAEINYQFNSLLHAAD1093查詢240DMQLYKYIIKNTAWQNGKTVTFMPKPLFGDNGSGMHCHQSLWKDGAPLMYDETGYAGLSD299DMQLTrKYIIKNTAWQNGKTVTFMPKPLFGDNGSGMHCHQSLWKDGAPLMYDETGYAGLSD主題1092DMQLYniIKNTAWQNGKTVTFMPKPLFGDNGSGMHCHQSLWKDGAPLMYDETGYAGLSD913查詢300TARHYIGGLLHHAPSLLAFTNPTVNSYKRLVPGY-APINLVYSQRNRSACVRIPITGSNP358TARHYIGGLLHHAPSLLAFTNPTVNSYKRLVPGYAPINLVYSQRNRSACVRIPITGSNP主題912TARHYIGGLLHHAPSLLAFTNPTVNSYKRLVPGYEAPINLVYSQRNRSACVRIPITGSNP733查詢359KAKRLEFRSPDSSGNPYLAFSAMLMAGLDGIKNKIEPQAPVDKDLYELPPEEAASIPQTP418KAKRLEFRSPDSSGNPYLAFSAMLMAGLDGIKNKIEPQAPVDKDLYELPPEEAASIPQTP主題732KAKRLEFRSPDSSGNPYLAFSAMLMAGLDGIKNKIEPQAPVDKDLYELPPEEAASIPQTP553查詢419TQLSDVIDRLEADHEYLTEGGVFTNDLIETWISFKRENEIEPVNIRPHPYEFALYYDV476(SEQIDNO:18)TQLSDVIDRLEADHEYLTEGGVFTNDLIETWISFKRENEIEPVNIRPHPYEFALYYDV(SEQIDNO:18).主題552TQLSDVIDRLEADHEYLTEGGVFTNDLIETWISFKRENEIEPVNIRPHPYEFALYYDV379(SEQIDNO:19)接下來，將包括其自身的啟動子區(qū)的突變體glnAl等位基因連接到pHV203中的spel位點內(nèi)，以產(chǎn)生pHV203-mutglnAlAD54AE335，以及連接到染色體整合栽體pMP399和質(zhì)粒栽體pMP349啟動子內(nèi)，以產(chǎn)生pMP399-mutglnAlAD54AE335和pMP349-mutglnAl厶D54AE335(表l)。pHV203-mutglnAlAD54AE335質(zhì)粒圖譜顯示于圖19中，并且這些質(zhì)粒各自的全部核苷酸序列包括在表1的腳注中。將pHV203-mutglnAlAD54AE335質(zhì)粒電穿孔到3D-BCG疫苗內(nèi)，以產(chǎn)生4D-BCG疫苗?？梢詫⑦@些栽體引入BCG以及第一代、第二代和第三代促凋亡BCG疫苗內(nèi)，以分別產(chǎn)生第一代、第二代、第三代和第四代疫苗。構(gòu)建另外的質(zhì)粒和染色體整合載體，其使突變體SodA等位基因和突變體glnAl等位基因組合在相同栽體上。這些包括pMP399-mutSodA△H28AH76mutglnAlAD54AE335(圖20)、pMP399—mutSodA△E54mutglnAlAD54AE335、pMP349-mutSodAAH28△H76mutglnAl△D54AE335(圖20)和pMP349-mutSodAAE54mutglnAlAD54△E335(表l)。將這些載體引入BCG以及第一代、第二代和第三代促凋亡BCG疫苗內(nèi)，以分別產(chǎn)生第一代、第二代、第三代和第四代疫苗。實施例9.通過促凋亡BCG表達外源性抗原。上述促凋亡BCG疫苗可以用于表達外源性抗原，其中包括來自其他感染因子的抗原和癌抗原。構(gòu)建其中重組布魯桿菌屬2，4-二氧四氫蝶啶合酶，一種流產(chǎn)布魯桿菌的免疫顯性T細胞抗原[Velikovsky，C.A.等人，2002]，由DD-BCG表達的DD-BCGrBLS。將bls基因連接到pMP349中aceA(icl)啟動子后，以產(chǎn)生pMP349-rBLS(表l)。將這種質(zhì)粒電穿孔到DD-BCG內(nèi)，以產(chǎn)生DD-BCGrBLS。經(jīng)由DD-BCGrBLS的rBLS表達顯示于圖21中。這些結(jié)果證實外來抗原可以在促凋亡BCG中進行表達。這種能力允許構(gòu)建新一代疫苗，其通過使用促凋亡胞內(nèi)細菌作為用于接近抗原呈遞的凋亡相關(guān)交叉啟動途徑的載體來誘導強T細胞應(yīng)答。以這種方式，可以將外源性抗原遞送給樹突細胞，以誘導強CD4和CD8T細胞應(yīng)答。例如，本文顯示的DD-BCGrBLS菌林或表達重組布魯桿菌屬抗原的其他促凋亡胞內(nèi)細菌疫苗可以用于免疫?；蚱渌溉閯游锼拗鳌＿@種技術(shù)可以用于同時保護牛不受牛結(jié)核和布魯氏菌病。由于不同物種中的密碼子使用中的差異，使外源基因中的密碼子對于在分枝桿菌中的表達優(yōu)化可能是有益的。這可以通過下述來常規(guī)完成使用定點誘變以改變基因，或構(gòu)建遵循分枝桿菌的密碼子使用優(yōu)先的合成基因。此類改變是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。實施例10.針對sigH缺失的備選，包含硫氧還蛋白、硫氧還蛋白還原酶和谷氧還蛋白的等位失活。sigH的失活影響多種微生物因子的生產(chǎn)，其中某些可能是宿主免疫應(yīng)答的重要靶。目前這是假說，并且目前數(shù)據(jù)支持下述提議由sigH缺失突變體表達的低水平的sigH調(diào)節(jié)蛋白足以誘導針對這些蛋白質(zhì)的強T細胞應(yīng)答。然而，作為用于誘導針對肺結(jié)核的保護的促凋亡BCG疫苗的sigH失活的備選方案，直接減少在sigH控制下的關(guān)鍵抗凋亡酶的活性以使對應(yīng)激相關(guān)蛋白質(zhì)組的影響降到最低，可能是有利的。在其中促凋亡疫苗主要用于表達來自其他感染因子的外源性抗原或癌抗原的情況下，sigH缺失是優(yōu)選的并且提供用于減少多種抗凋亡抗氧化劑生產(chǎn)的機制。硫氧還蛋白(trxC、亦為trx、MPT46)和疏氧還蛋白還原酶(trxB2、亦為trxr)是sigH調(diào)節(jié)的基因，其是針對氧化性應(yīng)激的細菌應(yīng)答的占優(yōu)勢部分。它們在結(jié)核分枝桿菌/BCG染色體上彼此相鄰的位置(trxB2在H37Rv染色體中的堿基4，404，728-4，402，735上，和trxC在4，402，732—4，403，082上，才艮據(jù)TubercuList網(wǎng)頁服務(wù)器上的完全基因組序列)。已構(gòu)建同時去除trxB2和trxC的基于噬菌粒的載體(pYUB854-trx-trxr),并且序列數(shù)據(jù)在表1中提供。這種載體的圖和特征顯示于圖22中。用于構(gòu)建TRX-TRXR-BCG(BCGAtrxCAtrxB2)的備選策略涉及如上文所描述和引用的自殺質(zhì)粒載體的使用，所述自殺質(zhì)粒載體的使用是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的?；谫|(zhì)粒的系統(tǒng)的l個潛在優(yōu)點是更容易實現(xiàn)未標記的缺失，其中等位基因由失活突變體替換而不是阻斷抗生素抗性決定簇。硫氧還蛋白、硫氧還蛋白還原酶和許多其他氧化還原修復酶的活性部位包含在氧化時形成二硫橋的活性半胱氨酸。"硫氧還蛋白活性部位基序"是C-X-X-C序列，其中C-半胱氨酸和X-任何氨基酸。這個標記使得鑒定氧化還原活性酶的活性部位成為常規(guī)。隨后基因可以進行誘變或合成以消除活性部位。硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶的下述氨基酸序列顯示分別在殘基37-40和145-148處的粗體的CXXC基序。>結(jié)核分枝桿菌H37Rv|Rv3914|TrxC:116aa-THIOREDOXINTRXC(TRX)(MPT46)1-MTDSEKSATIKVTDASFATDVLSSNKPVLVDFWATWCGPCKMVAPVLEEIATERATDLTV61-AKLDVDTNPETARNFQVVSIPTLILFKDGQPVKRIVGAKGKAALLRELSDVVPNLN(SEQIDNO:20)〉結(jié)核分枝桿菌H37RvlRv3913lTrxB2:335aa-PROBABLETHIOREDOXINREDUCTASETRXB2(TRXR)(TR)1-MTAPPVHDRAHHPVRDVIVIGSGPAGYTAALYAARAQLAPLVFEGTSFGGALMTTTDVEN61-YPGFRNGITGPELMDEMREQALRFGADLRMEDVESVSLHGPLKSVVTADGQTHRARAVIL121-AMGAAARYLQVPGEQELLGRGVSSCATCDGFFFR,AVIGGGDSAMEEATFLTRFARS181-VTLVHRRDEFRASKIMLDRARNNDKIRFLTNHTVVAVDGDTTVTGLRVRDTNTGAETTLP241-VTGVFVAIGHEPRSGLVREAIDVDPDGYVLVQGRTTSTSLPGVFAAGDLVDRTYRQAVTA301-AGSGCAAAIDAERWLAEHAATGEADSTDALIGAQR(SEQIDNO:21)使用涉及重疊引物的基于PCR的基因誘變技術(shù)，構(gòu)建編碼失活突變體的基因。trxC等位基因編碼缺乏"WCGPCK"活性部位的失活的硫氧還蛋白突變體，和trxB2等位基因編碼缺乏"SCATCD"活性部位的失活的硫氧還蛋白還原酶序列。將這些突變體等位基因并入由Parish和Stoker[Parish,T.等人，2000]描述的p2NIL-pGOAL19等位失活載體系統(tǒng)內(nèi)，用于引入"未標記的，，(即，最終的構(gòu)建體缺乏抗生素抗性基因)以生產(chǎn)p2NIL/GOAL19-muttrxC-muttrxB2(圖23和表1)。這種策略還可以應(yīng)用于其他sigH調(diào)節(jié)的基因。例如，RV2466c是sigH調(diào)節(jié)的，是谷氧還蛋白同系物，并且具有C-X-X-C基序>結(jié)核分枝桿菌H37RvlRv2466clRv2466c:207aa-CONSERVEDHYPOTHETICALPROTEIN1-MLEKAPQKSVADFWFDPLCPWCWITSRWILEVAKVRDIEVNFHVMSLAILNENRDDLPEQ61-YREGMARAWGPVRVAIAAEQAHGAKVLDPLYTAMGNRIHNQGNHELDEVITQSLADAGLP121-AELAKAATSDAYDNALRKSHHAGMDAVGEDVGTPTIHVNGVAFFGPVLSKIPRGEEAGKL181-WDASVTFASYPHFFELKRTRTEPPQFD(SEQIDNO:22)實施例11.S因子E(sigE)的缺失以進一步減少經(jīng)由BCG的抗凋亡微生物酶生產(chǎn)。如上所述，其他S因子調(diào)節(jié)對應(yīng)激刺激的應(yīng)答重要的微生物因子生產(chǎn)。已顯示S因子E(sigE)對SodA和glnAl生產(chǎn)有影響[Manganelli，R.等人，2001]。因此，sigE的失活i秀導與上文描述的其他缺陷類似的微生物抗凋亡酶生產(chǎn)中的缺陷，并因此可以單獨或與其他突變組合使用以制備更有效的促凋亡BCG菌林。已構(gòu)建使sigE失活的基于質(zhì)粒(pYUB854-sigE)的栽體，并且序列數(shù)據(jù)在表l中提供。這種載體的圖和特征顯示于圖24中。實施例12.經(jīng)由4D-BCG在體外減少的谷氨酰胺合酶活性的證明。為了測定突變體AD55AE335GlnAl表達對整個細菌的谷氨酰胺合成酶活性的影響，制備DD-BCG、3D-BCG和涉及突變體AD55AE335GlnAl的質(zhì)粒或染色體表達的2種形式的4D-BCG的裂解物，并且就谷氨酰胺合成酶活性進行比較?；钚詼y定法使用由Woolfolk等人描述的轉(zhuǎn)移反應(yīng)來進行，通過監(jiān)測540nm處的吸光度以檢測y-谷氨酸氧坊酸鹽的形成。結(jié)果顯示于圖25中，并證明顯性失活策略導致谷氨酰胺合酶活性中4-8倍的減少。實施例13.與用親代BCG菌株接種的小鼠比較，來自用DD-BCG、3D-BCG和4D-BCG疫苗接種的小鼠的脾細胞顯示出增強的IL-2生產(chǎn)。為了評估針對所選擇的促凋亡BCG(paBCG)疫苗和親代BCGTice疫苗林的免疫應(yīng)答，使用C57B1/6小鼠中的IV接種模型，包含施用約5x105cfu疫苗林作為單次劑量。收獲脾并且使脾細胞在來自這些小鼠品系的未感染的或受BCG感染的骨髓衍生的巨噬細胞(BMDMs)上進行過夜再刺激，所述小鼠品系已用IFN-y刺激以促進細菌抗原的呈遞。因此，這是非常生理學的測定法，其中從已接種疫苗的小鼠中收獲淋巴細胞，并且隨后就其響應(yīng)體外巨噬細胞感染模型應(yīng)答產(chǎn)生細胞因子的能力進行測試，所述體外巨噬細胞感染模型與體內(nèi)感染具有許多類似處。用抗CD3、抗CD4和抗CD8表面抗體、以及抗IFN-y、抗IL-2和抗TNF-ot胞內(nèi)抗體進行胞內(nèi)細胞因子染色(ICS)。隨后在FACSaria分選器上分析樣品。通過比較經(jīng)由在受BCG感染的BMDMs上過夜再刺激的脾細胞的IFN-y、IL-2和偶爾地TNF-ot生產(chǎn)與在未感染的BMDMs上過夜溫育的細胞因子生產(chǎn)測定BCG抗原特異性應(yīng)答。為了測定免疫應(yīng)答，進行多個實驗以比較BCG、DD-BCG、3D-BCG和句-BCG(圖26)。用BCG和DD-BCG接種后，觀察到持續(xù)的細胞因子生產(chǎn)。在接種后第70天時，小鼠脾中約0.7%的CD4T細胞能夠響應(yīng)抗原刺激而生產(chǎn)IFN-y。在接種后第259天時，0.30%和0.27%的脾CD4細胞仍分別在BCG和DD-BCG接種者中產(chǎn)生IFN-Y(數(shù)據(jù)未在圖中顯示)。這些結(jié)果與C57B1/6小鼠脾中BCG和DD-BCG的延長存活相關(guān)，所述C57B1/6小鼠是已知其關(guān)于突變型^認W基因座的"BCG易感性"的品系[Govoni，G.等人，1996]。特異性細胞因子生產(chǎn)中的差異也是顯著的。BCG接種的小鼠顯示出占優(yōu)勢的IFN-Y應(yīng)答，和BCG接種的小鼠中的IL-2生產(chǎn)未可靠地超過測定法中的天然變異性(即，如由陰影面積指示的在用磷酸鹽緩沖鹽水接種[假接種對照]的小鼠中觀察到的IL-2值的范圍)。當在BCG接種的小鼠中觀察到IL-2生產(chǎn)時，它處于低水平并且在4周時初次T細胞應(yīng)答的峰值時間附近檢測到。相反的，相對于BCG接種的小鼠，用DD-BCG接種的小鼠具有更少的IFN-v生產(chǎn)CD4T細胞但更多的IL-2生產(chǎn)細胞。生產(chǎn)IL-2的CD4+T細胞％大致與評估的paBCG疫苗的"代數(shù)"相關(guān)，并且1卜2+004+T細胞應(yīng)答的誘導由大至小為4D-BCG>3D-BCG>DD-BCG>BCG(圖26A，下圖)。這些結(jié)果顯示促凋亡修飾具有累積效應(yīng)，并且當組合時在初次接種期間產(chǎn)生對IL-2生產(chǎn)的逐漸增強。在同一脾中，IFN-Y生產(chǎn)與IL-2生產(chǎn)CD4細胞的比率對于BCG和paBCG疫苗的接受者一般平均分別為約10:1和3:1(圖26B，其中來自未感染的BMDMs的IL-2+背景值已被扣除)。這個觀察與下文顯示的某些其他差異組合顯示與BCG誘導的免疫應(yīng)答比較，由paBCG疫苗誘導的免疫應(yīng)答中存在定性增強。細胞因子生產(chǎn)中的差異通過比較初級T細胞應(yīng)答的峰周圍的結(jié)果得到最佳舉例說明。圖27顯示在比較BCG、DD-BCG和3D-BCG的實驗中從接種后第25天到第31天的結(jié)果。除了經(jīng)由cd4t細胞的IFN-y生產(chǎn)中的差異(BCG>>DD-BCG>3D-BCG)和經(jīng)由CD4+T細胞的IL-2生產(chǎn)中的差異(3D-BCG>>DD-BCG>BCG)，結(jié)果還顯示在第25天時在3D-BCG接種的小鼠中經(jīng)由CD8+T細胞的增加的IFN-y生產(chǎn)(.30%)。盡管CD卩和CD8IFN-Y生產(chǎn)細胞的百分比相同，但此小鼠具有更高數(shù)目的循環(huán)CD8細胞，所以在第25天時的絕對時限，CD8+IFN-Y+細胞的數(shù)目高于CD4IFN-y+細胞的數(shù)目。與DD-BCG對3D-BCG相關(guān)的值中的差異再次暗示每種促凋亡修飾在增強BCG的免疫原性方面具有累積效應(yīng)。總之，在初次接種期間由paBCG疫苗誘導的T細胞效應(yīng)物細胞因子的模式不同于由BCG誘導的T細胞效應(yīng)物細胞因子的模式。如下文顯示的，在接種-攻擊實驗中進行另外的免疫學研究中，在初次接種期間的這些差異促進記憶應(yīng)答的發(fā)展，所述記憶應(yīng)答使得已接種的宿主迅速響應(yīng)感染。由paBCG疫苗抹對IL-2生產(chǎn)的更多誘導應(yīng)促進T細胞生長，因為在初次T細胞應(yīng)答的收縮期間IL-2的存在增強抗原特異性T細胞的存活[Blattman,J.N.等人，2003〗。實施例14.與先前用BCG疫苗接種的小鼠比較，先前用3D-BCG接種的小鼠在氣管內(nèi)攻擊后增強的回憶T細胞應(yīng)答。接種的目的是在已免疫的宿主中產(chǎn)生針對感染因子并且可以活躍響應(yīng)感染的記憶淋巴細胞群體。為了測定回憶T細胞應(yīng)答的動力學和量級，小鼠用5x105cfuBCG或3D-BCG進行皮下接種。對照小鼠用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)進行假接種。接種后30天，小鼠用抗生素進行處理以消除任何持續(xù)的疫苗桿菌。盡管初步數(shù)據(jù)指出3D-BCG和4D-BCG疫苗隨著適應(yīng)性免疫應(yīng)答發(fā)展被清除，但BCG在C5"7B1/6小鼠中長時期地持續(xù)并且在SubQ接種后在脾中持續(xù)至少5個月[Olsen，A.W.等人，2004]。因此，為了避免受BCG的持久性干擾，通過在疫苗接種后1個月時開始用飲用水中的異煙肼和利福平處理所有小鼠來消除疫苗株。發(fā)現(xiàn)這在使脾中的BCG數(shù)目減少低于檢測下限方面是有效的。處理1個月并另外休息4周后，小鼠接受4x107cfuBCG的氣管內(nèi)攻擊(所有小鼠組，與最初疫苗林無關(guān))。攻擊前細胞因子+T細胞的基線(第0天)數(shù)目很低(未顯示)。攻擊后5天，對小鼠實施安樂死并且收獲肺以測定T細胞應(yīng)答。結(jié)果顯示于圖28中，并且與用BCG疫苗接種的小鼠比較，在用3D-BCG疫苗接種的小鼠中顯示出強得多的CD4+T細胞應(yīng)答。與BCG比較，高IO倍百分比的來自用3D-BCG接種的小鼠的IL-2+CD4+T細胞重演在初次接種期間可見的更多的IL-2生產(chǎn)(圖26和27)。盡管在這個實驗中使用的攻擊劑量對于TB感染很高/非生理學，但設(shè)計的確允許我們評估在相對高抗原負載的條件下二次T細胞應(yīng)答的快速性。因此，該結(jié)果支持paBCG用于遞送感染因子抗原的栽體功能，所述感染因子在接種后可能非?？斓厣咧粮叩味?例如，病毒病原體，癡疾)?？傊?，在對用3D-BCG接種的小鼠攻擊后觀察到的二次T細胞應(yīng)答強于用BCG接種的小鼠中觀察到的二次T細胞應(yīng)答。結(jié)果顯示paBCG在誘導記憶T細胞群體方面優(yōu)于BCG，所述記憶T細胞在二次(回憶)應(yīng)答期間可以迅速響應(yīng)攻擊。與比目前的BCG疫苗更大的減毒作用及其針對肺結(jié)核誘導更大的保護的能力組合，免疫學研究突出paBCG作為平臺技術(shù)用于遞送針對其他重要的感染性疾病和靶癌癥的外源性抗原的用途。表l.菌抹、用于遺傳操作的工具和基因構(gòu)建體<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>*注術(shù)語pHV202和pHV203可互換4吏用。pHV203通過下述衍生自pHV202，修復在用于驅(qū)動反義DNA表達的65kDa熱休克蛋白的啟動子區(qū)中的突變，和包括DNA的大上游區(qū)以增強穩(wěn)定性。序列腳注(A)pMP349-mutSodAAE54(SEQIDNO:23)質(zhì)粒載體pMP349-mutSodAAE54的全部核苷酸序列用于在BCC中表達突變體^W，以制備SAD-BCGAE54(質(zhì)粒表達的)。它還可以加入促凋亡BCG的第一代、第二代和第三代突變體中，以分別產(chǎn)生第二代、第三代和第四代促凋亡BCG疫苗。1cUgttccactgagcgtcagaccccgUgaaaagatcaaaggatcttcttgagatccttt61ttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttg121tttgccggatcaagagctaccaactctUttccgaaggtaactggctteageagagegea181gataccaaatactgtccttcUgtgUgccgtagttaggccaccactteaagaactctgt241agcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcga301Uagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaceggataaggcgcagcggtc361gggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctBcaccgaact421gagatacctacagcgtgagcattgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcgga481caggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccaggggg541aaacgcctggUtctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagegtcgatt601tttgtg"gctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgeggecttttt661acggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttcUtectgegtUtcccctga721ttctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaac781gaccgagcgcaacgcgtgagcccaccagctccgtaagttcgggtgctgtgtggctegtae841ccgcgcattcaggcggcagggggtctaacgggtctaaggcggcgtgtacggccgccacag901cggctcttagcggcccggaaacgtcctcgaacicgacgcatgtgttcctcctggttggtac961aggtggttgggggtgctcggctgtcgctggtgtttcatcatCBgggCtCgaegggagage1021gggggagtgtgcagttgtggggtggcccctcagegaaatatCtgBCttggagctcgtgtc1081ggaccatacaccggtgattaatcgtggUtatUtcaagcgtgagccacgtcgccgacga1141atttgagcagctctggctgccgtactggtccctggcaagcgaegatctgetcgaggggat1201ctaccgccaaagccgcgcgtcggccctaggccgccggUcategaggegaacccaacagc1261gctggcaaacctgctggtcgtggaegtagaccatccagacgcagcgctccgagegctcag1321cgcccgggggtcccatccgctgcccaacgcgatcgtgggcaatcgcgccaacggccacgc1381acaegcagtgtgggcactcaacgcccctgttccacgcaccgaatacgegeggcgUagcc1441gctcgcatacatggcggcgtgegecgaaggccttcggcgcgccgtcgatggcgaccgcag1501ttactcaggcctcatgaccaaaaaccccggccacatcgcctgggaaaeggaatggctcca1561ctcagatctctaca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1ttcatggaaatggtgcggcgtcagcacgacgctcagcaccggcacttccg2901Utcaagctgcacctgcatcatgccgttgataacggccgtcgccacgaaa2951tcatgacgatag"gccgccgtcgatcacgaaggccgcaccgacgatggc3001tgcaUgcgcccggUctggccaatgtcttggcgtgaaggggaat"cat3051atgcacccggcacgtcgaat8tctctacctcgacgctgccacccgtcttt3101gcggccagttcggcgacaaagcttttgcgcgettcgtcaaegatgtegge3151gtgccagcgggcctgaatgaatgcgattttaaaggatgtcttgttcggac3201agctttggttcatgggUccccagacaactccttaacggtcttteattgc3251cgaaaacgctgacgccctaccgtcgtccaggcggtgtcaacggcgcagct3301UactggtgtgctaactcgBccatggcacagcgtgtcaacgctggtccac3351ccatttcacttgcgaatttcggcaacggcctgcggactttttgcaaattt3401tgcgaagtcgcccaaaaactgaaccgtUcagaagctacccgccagtaac3451gacaaatccgcaggtaaacccacggatcgacgtcctgcggatccggtcac3501agattgaacagcgaggcgBCtgccttgggctcgtcgccaaccacatatgt3551gagcgttgtaacatctagaggtgaccacaacgacgcgcccgetttgatcg3601gggacgtctgcggccgsccatttacgggtcttgttgtcgttggeggtcat3651gggccgaacatactcacccggatcggagggccgaggacaaggtcgaacga3701ggggc"gacccggtgcggggCttCttgCfiLcteggcataggcgagtgcU3751agaataacgttggcactcgcgaccggtgagtegtaggtegggacggtgag3801gccaggcccgtcgtcgcagcgagtggcagcgaggacaacttgagccgtcc3851gtcgcgggcactgcgcccggccagcgtaagtageggggttgccgtcaccc3901ggtgacccccggtttcatccccgatccggaggaatcacttcgcaatggcc3951aagacaattgcggatccagctgcagaattcctgcagctcaeggtaactga4001tgccgUtttgcagtaccagcgtacggcccacagaatgatgtcacgctga4051aaatgccggcctttgaatgggttcatgtgcagctccatcagcaaaagggg4101atgaUagttUtcaccaccgacUtttgcaacagtgccgttgatcgtgc4151tatgatcgactgatgtcatcagcggtggagtgcaatgtcgtgeaataega4201atggcgaaaagccgagcteatcggtcagcttctcaaccttggggttaccc4251ccggcggtgtgctgctggtccacagctccttccgUgcgtccggcccctc4301gaagatgggcccacttggactgatcgaggccctgcgtgctacgctgggtc4351cgggagggacgctcgtcatgccctcgtggtcaggtctggacgacgagccg4401ttcgatcctgccacgtcgcccgttacaccggaccttggagttgtctctga4451cacattctggcgcctgccaaatgtaaagcgcagcgcccatccatttgcct4501ttgcggcagcggggccacaggcagagcagatcatctctgatccattgccc4551ctgccaccttactcgcctgcaagcccggtcgcccgtgtccatgaactcga楊ltgggcaggtacttctcctcggcgtgggacacgatgccaacacgacgctgc4651atcttgccgagttgatggcaaaggttccctatggggtgccgagacactgc4701accattcUcagg"ggcaagttggUcgcgtcgattatctcgagaatga4751ccactgctgtgagcgctttgccttggcgggacaggtggctcaaggagaag4801agccttcagaagtcggtcatgcctttgctcggttgatccg4851ctcccgcgacattgtggcgacagccctgggtcaactgggccgagatccgt4901tgatcttcctgcatccgccagagggcgggatgcgaagaatgcgatgccgc4951tcgccagtcg"tggctgagctcatgagcggagaacgagatgacgttgga5001ggggcaaggtcgcgctgattgctggggcaacacgggggatcca本申請自始至終參考了各種出版物。這些出版物的公開內(nèi)容通過引用到本申請內(nèi)在此整體合并，以便更充分地描迷本發(fā)明所屬領(lǐng)域的狀態(tài)。1，AlbertML，SauterB，BhardwajN.DendriticcellsacquireantigenfromapoptoticcellsandinduceclassI-restrictedCTLs.Nature1998;392:86-9.2,AldoviniA，HussonRN，YoungRA.Thez/"^locusandhomologousrecombinationin拳o6s"e/7"邊6o"sBCG.J.Bacteriol.1993;175:7282-9.3,AndersenP，SmedegaardB,CD4+T-cellsubsetsthatmediateimmunologicalmemoryto妙c065""/咖^ercu/o"'sinfectioninmice.Infect.Immun.2000;68:621-9.4,Balcewicz-SablinskaMK，KeaneJ，KornfeldH，RemoldHG.PathogenicMycobacteriumtuberculosisevadesapoptosisofhostmacrophagesbyreleaseofTNF-R2，resultingininactivaUonofTNF-alpha.J,Immunol,1998;161:2636-41.5.BardarovS，KriakovJ，CarriereC等人。Conditionallyreplicatingmycobacteriophages:asystemfortransposondeliverytoJZ/co6s"er/咖"6e"u/os/s.Proc.Natl.Acad,ScLU.S，A1997;94:10961-6,6.BehrMA，SmallPM.HasBCGattenuatedtoimpotenceNature1997;389:133-4.7.BerthetFX，LagranderieM，GounonP等人。AttenuationofvirulencebydisruptionoftheA(rco6s"e"'園ft;6erci;/os/serpgene.Science1998;282:759-62.8.BeyerWF，Jr.，F(xiàn)ridovichI.Assayingforsuperoxidedismutaseactivity:somelargeconsequencesofminorchangesinconditions.Anal,Biochenu1987;161:559-66，9.BraunsteinM,BardarovSS,JacobsWR，Jr.GeneticmethodsfordecipheringvirulencedeterminantsofJ/yco6s"er/咖"6ercu7c^/s.MethodsEnzymol，2002;358:67-99.10，BraunsteinM，EspinosaBJ，ChanJ，BelisleJT，JacobsWR，Jr.SecA2functionsinthesecretionofsuperoxidedismutaseAandinthevirulenceof妙co6fl"e"'咖f由環(huán)/w/s.Mol.Microbiol.2003;48:453-64.11.ChoS，MehraV,Thoma一UszynskiS等人。AntimicrobialactivityofMHCclassI-restrictedCD8+Tcellsinhumantuberculosis.Proc.Natl,Acad.Sci.U.S.A2000;97:12210-5.12.ColemanJ，GreenPJ，InouyeM.TheuseofRNAscomplementarytospecificmRNAstoregulatetheexpressionofindividualbacterialgenes，Cell1984;37:429—36.13.ConsaulSA，PavelkaMS，Jr,UseofanovelalleleoftheEscherichiacoliaacC4aminoglycosideresistancegeneasagenetic邁arkerinmycobacteria,FEMSMicrobiol.Lett.2004;234:297-301.14.CookseyRC,CrawfordJT,JacobsWR，Jr.,ShinnickTM.Arapidmethodforscreeningantimicrobialagentsforactivitiesagainstastrainof^TroZ^"eri礎(chǔ)rz/^rcu/oWsexpressingfireflyluciferase.AnUmicrob.AgentsChemother.1993;37:1348-52.15.CooperJB，MclntyreK，BadassoMO等人。X-raystructureanalysisoftheiron—dependentsuperoxidedismutasefromJfyro辦5Ce/7i/邁fz/^e/^y/c^/sat2.0Angstromsresolutionrevealsnoveldimer-dimerinteractions.J.Mol.Biol,1995;246:531-44.16.Dussurget0，StewartG,Neyrolles0，PescherP，YoungD，MarchalG.Roleof炒co6a"er/"邁fi/^rc"/os/scopper-zincsuperoxidedismutase.Infect.I邁mun.2001;69:529-33.17.EddineAN,KaufmannSH.ImprovedprotectionbyrecombinantBCG,Microbes.Infect.2005;7:939-46.18.EdwardsKM,CynamonMH，VoladriRK等人。Iron-cofactoredsuperoxidedismu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性。2.經(jīng)修飾的細菌，其依照權(quán)利要求1的方法制備。3.免疫原性組合物，其包含權(quán)利要求2的經(jīng)修飾的細菌。4.修飾減毒細菌以增強所述減毒細菌的免疫原性的方法，其包括遺傳上改變所述細菌以表達抗凋亡酶的顯性失活突變體，由此所述細菌在受試者中具有增強的免疫原性。5.權(quán)利要求1和4的方法，其中所述細菌選自結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、牛分枝桿菌菌林BCG、BCG亞林、鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、非洲分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種、星狀諾卡氏菌、其他諾卡氏菌屬物種、嗜肺軍團菌、其他軍團菌屬物種、傷寒沙門氏菌、其他沙門氏菌屬物種、志賀菌屬物種、鼠疫耶爾森氏菌、溶血巴斯德菌、多殺巴斯德菌、其他巴斯德菌屬物種、胸膜炎肺炎放線桿菌、單核細胞增生李斯特氏菌、依氏李斯特氏菌、流產(chǎn)布魯桿菌、其他布魯桿菌屬物種、反芻類考德里氏體、肺炎衣原體、沙眼衣原體、鷚鵠衣原體、伯氏柯克斯體、其他立克次氏體屬物種、埃里希氏體屬物種、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、釀膿鏈球菌、無乳鏈球菌、炭疽桿菌、大腸桿菌、霍亂弧菌、彎曲桿菌屬物種、腦膜炎奈瑟氏球菌、淋病奈瑟氏球菌、銅綠假單胞菌、其他假單胞菌屬物種、流感嗜血桿菌、杜氏嗜血桿菌、其他嗜血桿菌屬物種、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、及其他耶爾森氏菌屬物種。6.權(quán)利要求1和4的方法，其中所述顯性失活突變體是SodA的顯性失活突變體，其中天然存在的核酸中的核苷酸缺失、插入和/或置換編碼干擾所述生物的S0D活性的分子。7.權(quán)利要求1和4的方法，其中所述顯性失活突變體是谷氨酰胺合酶的顯性失活突變體，其中天然存在的核酸中的核苷酸缺失、插入和/或置換編碼千擾所述生物的谷氨酰胺合酶活性的分子。8.權(quán)利要求6和7的方法，其中所述細菌是BCG。9.權(quán)利要求8的方法，其包括進一步的促凋亡修飾。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述進一步的促凋亡修飾包含選自SigH的失活、sigE的失活、SecA2的失活、硫氧還蛋白的失活、硫氧還蛋白還原酶的失活和谷氧還蛋白的失活的一種或多種修飾。11.權(quán)利要求8的方法，其中所述顯性失活突變體是具有在第28位上的組氨酸和第76位上的組氨酸缺失的突變體SodA。12.權(quán)利要求8的方法，其中所述顯性失活突變體是具有在第28位上的組氨酸或第76位上的組氨酸缺失的突變體SodA。13.權(quán)利要求8的方法，其中所述顯性失活突變體是具有在第54位上的谷氨酸缺失的突變體SodA。14.權(quán)利要求8的方法，其中所述顯性失活突變體是具有在第54位上的谷氨酸缺失和第28位上用精氨酸置換組氨酸的突變體SodA。15.權(quán)利要求IO、11、12、13或14的方法，其中所述細菌包含SodA的顯性失活突變體和W^^的活性降低突變。16.權(quán)利要求IO、11、12、13或14的方法，其中所述細菌包含SodA的顯性失活突變體和Md2的活性降低突變。17.權(quán)利要求IO、11、12、13或14的方法，其中所述細菌包含SodA的顯性失活突變體、s/g^的活性降低突變和""2的活性降低突變。18.權(quán)利要求IO、11、12、13或14的方法，其中所述細菌包含SodA的顯性失活突變體、glnAl的顯性失活突變體、s/g^的活性降低突變和"d2的活性降低突變。19.權(quán)利要求8的方法，其中所述細菌包含glnAl的顯性失活突變。20.權(quán)利要求19的方法，其中所述谷氨酰胺合酶的顯性失活突變體包含在氨基酸第54位上的天冬氨酸和在氨基酸第335位上的谷氨酸的缺失。21.權(quán)利要求19的方法，其中所述谷氨酰胺合酶的顯性失活突變體包含在氨基酸第54位上的天冬氨酸或在氨基酸第335位上的谷氨酸的缺失。22.權(quán)利要求20的方法，其中所述細菌進一步包含""2的活性降低突變。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述細菌進一步包含SodA的顯性失活突變體。24.權(quán)利要求23的方法，其中所述SodA的顯性失活突變體是具有在第28位上的組氨酸和第76位上的組氨酸缺失的突變體SodA。25.權(quán)利要求20的方法，其中所述細菌進一步包含Wg^的活性降低突變和""2的活性降低突變。26.權(quán)利要求20的方法，其中所述細菌進一步包含SodA的顯性失活突變體和s/gy的活性降低突變。27.權(quán)利要求26的方法，其中所述顯性失活突變體是具有在第54位上的谷氨酸缺失的突變體SodA。28.權(quán)利要求26的方法，其中所述顯性失活突變體是具有在第28位上的組氨酸和第76位上的組氨酸缺失的突變體SodA。29.權(quán)利要求20的方法，其中所述細菌進一步包含SodA的顯性失活突變體和"c^的活性降低突變。30.權(quán)利要求29的方法，其中所述顯性失活突變體是具有在第54位上的谷氨酸缺失的突變體SodA。31.權(quán)利要求29的方法，其中所述顯性失活突變體是具有在第28位上的組氨酸和第76位上的組氨酸缺失的突變體SodA。32.權(quán)利要求4的方法，其中所述細菌包含W^^的活性降低突變。33.權(quán)利要求4的方法，其中所述細菌包含《/>#的活性降低突變和se"2的活性降低突變。34.權(quán)利要求2的經(jīng)修飾的細菌，其中所述細菌是減毒的。35.權(quán)利要求2的經(jīng)修飾的細菌，其中所述細菌選自結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、牛分枝桿菌菌株BCG、BCG亞株、鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、非洲分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種、星狀諾卡氏菌、其他諾卡氏菌屬物種、嗜肺軍團菌、其他軍團菌屬物種、傷寒沙門氏菌、其他沙門氏菌屬物種、志賀菌屬物種、鼠疫耶爾森氏菌、溶血巴斯德菌、多殺巴斯德菌、其他巴斯德菌屬物種、胸膜炎肺炎放線桿菌、單核細胞增生李斯特氏菌、依氏李斯特氏菌、流產(chǎn)布魯桿菌、其他布魯桿菌屬物種、反芻類考德里氏體、肺炎衣原體、沙眼衣原體、鸚鷸衣原體、伯氏柯克斯體、其他立克次氏體屬物種、埃里希氏體屬物種、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、釀膿鏈球菌、無乳鏈球菌、炭疽桿菌、大腸桿菌、霍亂弧菌、彎曲桿菌屬物種、腦膜炎奈瑟氏球菌、淋病奈瑟氏球菌、銅綠假單胞菌、其他假單胞菌屬物種、流感嗜血桿菌、杜氏嗜血桿菌、其他嗜血桿菌屬物種、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、及其他耶爾森氏菌屬物種。36.權(quán)利要求2的經(jīng)修飾的細菌，其中所述顯性失活突變體是選自下述的顯性失活突變體a)其中天然存在的核酸中的核普酸缺失、插入和/或置換編碼降低所述生物的S0D活性的分子的SodA;和b)其中天然存在的核酸中的核苷酸缺失、插入和/或置換編碼降低所述生物的谷氨酰胺合酶活性的分子的谷氨酰胺合酶。37.權(quán)利要求36的經(jīng)修飾的細菌，其中所述細菌是BCG。38.權(quán)利要求37的經(jīng)修飾的細菌，其包含進一步的促凋亡修飾。39.權(quán)利要求38的經(jīng)修飾的細菌，其中所述進一步的促凋亡修飾包含選自SigH的失活、sigE的失活、SecA2的失活、石危氧還蛋白的失活、硫氧還蛋白還原酶的失活和谷氧還蛋白的失活的一種或多種修飾。40.權(quán)利要求37的經(jīng)修飾的細菌，其中所述顯性失活突變體是具有在第28位上的組氨酸和第76位上的組氨酸缺失的突變體SodA。41.權(quán)利要求37的經(jīng)修飾的細菌，其中所述顯性失活突變體是具有在第28位上的組氨酸或第76位上的組氨酸缺失的突變體SodA。42.權(quán)利要求37的經(jīng)修飾的細菌，其中所述顯性失活突變體是具有在第54位上的谷氨酸缺失的突變體SodA。43.權(quán)利要求37的經(jīng)修飾的細菌，其中所述顯性失活突變體是具有在第54位上的谷氨酸缺失和第28位上用精氨酸置換組氨酸的突變體SodA。44.權(quán)利要求39的經(jīng)修飾的細菌，其中所述細菌包含SodA的顯性失活突變體和W^7的活性降低突變。45.權(quán)利要求39的經(jīng)修飾的細菌，其中所述細菌包含SodA的顯性失活突變體和""2的活性降低突變。46.權(quán)利要求39的經(jīng)修飾的細菌，其中所述細菌包含SodA的顯性失活突變體、s/^7的活性降低突變和"o^的活性降低突變。47.權(quán)利要求39的經(jīng)修飾的細菌，其中所述細菌包含SodA的顯性失活突變體、glnAl的顯性失活突變體、s/^y的活性降低突變和se"2的活性降低突變。48.權(quán)利要求39的經(jīng)修飾的細菌，其中所述細菌包含glnAl的顯性失活突變。49.權(quán)利要求48的經(jīng)修飾的細菌，其中所述谷氨酰胺合酶的顯性失活突變體包含在氨基酸第54位上的天冬氨酸和在氨基酸第335位上的谷氨酸的缺失。50.權(quán)利要求48的經(jīng)修飾的細菌，其中所述谷氨酰胺合酶的顯性失活突變體包含在氨基酸第54位上的天冬氨酸或在氨基酸第335位上的谷氨酸的缺失。51.權(quán)利要求49的經(jīng)修飾的細菌，其中所述細菌進一步包含sed2的活性降低突變。52.權(quán)利要求51的經(jīng)修飾的細菌，其中所述細菌進一步包含SodA的顯性失活突變體。53.權(quán)利要求52的經(jīng)修飾的細菌，其中所述SodA的顯性失活突變體是具有在第28位上的組氨酸和第76位上的組氨酸缺失的突變體SodA。54.權(quán)利要求49的經(jīng)修飾的細菌，其中所述細菌進一步包含的活性降低突變和sed2的活性降低突變。55.權(quán)利要求49的經(jīng)修飾的細菌，其中所述細菌進一步包含SodA的顯性失活突變體和W^y的活性降低突變。56.權(quán)利要求55的經(jīng)修飾的細菌，其中所述顯性失活突變體是具有在第54位上的谷氨酸缺失的突變體SodA。57.權(quán)利要求55的經(jīng)修飾的細菌，其中所述顯性失活突變體是具有在第28位上的組氨酸和笫76位上的組氨酸缺失的突變體SodA。58.權(quán)利要求49的經(jīng)修飾的細菌，其中所述細菌進一步包含SodA的顯性失活突變體和""2的活性降低突變。59.權(quán)利要求58的經(jīng)修飾的細菌，其中所述顯性失活突變體是具有在第54位上的谷氨酸缺失的突變體SodA。60.權(quán)利要求58的經(jīng)修飾的細菌，其中所述顯性失活突變體是具有在第28位上的組氨酸和第76位上的組氨酸缺失的突變體SodA。61.權(quán)利要求2的經(jīng)修飾的細菌，其中所述細菌包含s/g^的活性降低突變。62.權(quán)利要求2的經(jīng)修飾的細菌，其中所述細菌包含s/^y的活性降低突變和""2的活性降低突變。全文摘要用于增強細胞微生物的免疫原性的全細胞疫苗和方法，用于在隨后暴露于致病菌的脊椎動物宿主中產(chǎn)生保護性免疫應(yīng)答，或用作載體以表達外源性抗原并誘導針對其他感染因子或癌細胞的應(yīng)答。本發(fā)明涉及以改善疫苗功效的方式增強經(jīng)由胞內(nèi)細菌的抗原呈遞的另外方法。鑒定對胞內(nèi)微生物感染的宿主細胞具有抗凋亡作用的酶后，經(jīng)由胞內(nèi)微生物產(chǎn)生的酶的活性通過表達所述酶的突變體拷貝而降低，從而修飾微生物，使得它增加免疫原性。文檔編號C12N15/74GK101548015SQ200680051051公開日2009年9月30日申請日期2006年11月15日優(yōu)先權(quán)日2005年11月15日發(fā)明者D·S·克諾德爾申請人:范德比爾特大學;由退伍軍人事務(wù)部代表的美國政府