專利名稱：新型細菌表面展示系統(tǒng)、方法及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程技術領域，更具體地，涉及細菌表面展示技術領域，特別是 指一種新型細菌表面展示系統(tǒng)、方法及應用。
背景技術：
細胞表面定位分子在自然界中普遍存在，其表面定位過程由不同的細胞表面蛋白 調控，并形成了很多生物學現(xiàn)象，比如細胞間的識別，信號轉導，表面吸附，定殖， 免疫反應等等。研究人員利用這些表面蛋白作為錨定元件將外源的多肽和蛋白與其融 合，將其展示到細菌或病毒的表面從而達到一定的研究和應用目的。將外源蛋白定位 表達在細菌表面后，可以直接用重組微生物進行后續(xù)實驗操作，免去了目標蛋白的產 物提取，純化等一系列操作，而且如果展示的是抗原蛋白，由于抗原暴露在細胞表面， 所以更有利于免疫系統(tǒng)的識別，而且外膜上的脂多糖等因子可以增強免疫反應，還可 能作為錨定在細胞表面的目標蛋白的輔助因子而發(fā)揮作用(Lee J.S., Shin K.S.， Pan J.G., and Kim C丄2000. Surface-displayed viral antigens on 5W,"e〃a carrier vaccine. Nat. Biotechnol. 18: 645-648 )。第一篇關于將外源多肽或蛋白利用遺傳學方法融合到 載體蛋白上，從而成功將它們展示的報道是在1986年分別由Freudl等(Freudl R., Maclntyre S., Degen M., Henning U., 1986. Cell surface exposure of the outer membrane protein OmpA of Esc/zenc/z& co// K-12. J. Mol. Biol. 188, 491—494)以及Charbit等 (Charbit A.， Boulain J.C., Ryter A., Hofnung M. 1986. Probing the topology of a bacterial membrane protein by genetic insertion of a foreign epitope; expression at the cell surface. EMBO J. 5, 3029-3037)完成的。之后，許多不同的細菌表面展示系統(tǒng)被研究 和開發(fā)出來，使得表面展示技術得到迅速的發(fā)展。
在所有被開發(fā)和研究的表面展示系統(tǒng)中，應用最廣泛的 一 個系統(tǒng)是Lpp-OmpA系 統(tǒng)，它是Georgiou和他的合作者在1992年構建的，他們利用Lpp-OmpA融合子成功的 將(3-內酰胺酶展示到大腸桿菌表面(Francisco J.A., Earhart C.F., Georgiou G. 1992. Transport and anchoring of beta-lactamase to the external surface of 5"/zer/c/ /fl co//.Proc Natl Acad Sci U S A 89(7):2713-7 ),該系統(tǒng)由兩部分組成1) E co/!'主要外膜脂 蛋白Lpp信號肽以及N端的九個氨基酸；2) ￡. co/;外膜蛋白OmpA的46-159位氨基酸 (包含跨膜區(qū)B3-B7)，外源蛋白與此系統(tǒng)的C末端融合。之后，研究者利用該系統(tǒng) 展示了許多外源蛋白，使得該系統(tǒng)在生物催化，抗體制備，固定化細胞，生物傳感器 制備等方面都有應用。由于該系統(tǒng)避免了夾心法融合外源蛋白進行表面展示對外源蛋 白的諸多限制，使得以五.co/z'為宿主用該系統(tǒng)進行展示的外源蛋白的大小達到了 70 kDa ( Wan H.M., Chang B.Y., Lin S.C. 2002. Anchorage of cyclodextrin glucanotransferase on the outer membrane of Esc/zm'c/z/a co/f. Biotechnol Bioeng 79(4):457-64 )。利用該系統(tǒng)進行表面展示還有很多優(yōu)點，比如，Lpp-OmpA系統(tǒng)具有 高效的分泌信號肽和獨特的跨膜結構，并提供了適宜的目標蛋白融合位點，而且其堅 固的錨定結構能夠準確的將外源蛋白定位在細胞表面。
鰻弧菌是一種重要的魚類細菌性病原，可以在全世界范圍內引起海水魚和淡水魚 的流行性疾病，對魚類養(yǎng)殖造成很大的損失。在鰻弧菌強毒林MVM425基礎上通過 DNA重組技術構建的鰻弧菌減毒林MVAV6203 (保藏號為CCTCCNO: M204066,保 藏曰為2004年9月15日，具體請參見中國專利ZL200410089496.0,申請日為2004年12 月14日)，該減毒林毒力減弱了 10000倍，對靶標和非靶標動物安全無毒，并對弧菌 病具有較高的免疫保護力，是一林優(yōu)秀的減毒活菌疫苗候選抹。
因此，本發(fā)明人嘗試構建并開發(fā)高效的細菌表面展示系統(tǒng)，旨在將來源于其他病 原微生物的保護性抗原因子展示于該鰻弧菌減毒林表面，構建安全高效的鰻弧菌的多 效價載體疫苗。

發(fā)明內容
本發(fā)明的主要目的就是針對以上存在的問題與不足，提供一種新型細菌表面展示 系統(tǒng)、方法及應用，該新型細菌表面展示系統(tǒng)能在細菌細胞表面成功展示目標蛋白， 可用于活疫苗開發(fā)，抗體制備，多肽文庫篩選，環(huán)境生物吸附劑開發(fā)和全細胞生物催 化方面，特別用于在鰻弧菌減毒抹的基礎上構建安全高效的鰻弧菌多效價載體疫苗。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種新型細菌表面展示系統(tǒng)，包括細菌跨膜定位轉 運序列和編碼目標蛋白的基因序列，所述細菌跨膜定位轉運序列包括大腸桿菌外膜脂 蛋白信號肽的核香酸序列，其特點是，所述細菌跨膜定位轉運序列還包括鰻弧菌核苷
酸序列，所述鰻弧菌核苷酸序列連接所述大腸桿菌外膜脂蛋白信號肽的核苷酸序列和
所述編碼目標蛋白的基因序列，所述鰻弧菌核苷酸序列編碼的蛋白包括鰻弧菌外膜蛋 白的跨膜錨定序列。
所述大腸桿菌外膜脂蛋白為Lpp蛋白，所述鰻弧菌外膜蛋白為Omporfl蛋白， OmpU蛋白或Omp26La蛋白。
所述細菌跨膜定位轉運序列是編碼所述L p p蛋白的信號肽及N端的前9個氨基酸 的核苷酸序列和編碼所述Omporf 1蛋白的6-50位氨基酸的核苷酸片段\編碼OmpU蛋白 的180-238位氨基酸的核苷酸片段\編碼Omp26La蛋白的80-158位氨基酸的核苷酸片 段。
所述目標蛋白是遲鈍愛德華氏菌的EseB抗原蛋白。
在本發(fā)明的第二方面，提供了 一種利用上述的新型細菌表面展示系統(tǒng)在細菌的細 胞表面展示目標蛋白的方法，其特點是，包括以下步驟
a. 將所述新型細菌表面展示系統(tǒng)構建入表達載體上，獲得重組表達載體；
b. 將所述重組表達載體導入宿主菌中進行表達，獲得融合蛋白，所述融合蛋白 包括所述信號肽、所述跨膜錨定序列和所述目標蛋白。
所述大腸桿菌外膜脂蛋白為Lpp蛋白，所述鰻弧菌外膜蛋白為Omporf 1蛋白， OmpU蛋白或Omp26La蛋白。
所述細菌跨膜定位轉運序列是編碼所述Lpp蛋白的信號肽及N端的前9個氨基酸 的核苷酸序列和編碼所述Omporf 1蛋白的6-50位氨基酸的核苷酸片段\編碼OmpU蛋白 的180-238位氨基酸的核苦酸片段\編碼Omp26La蛋白的80-158位氨基酸的核苷酸片 段，所述宿主菌為大腸桿菌或鰻弧菌。
所述表達栽體是pUC18,所述宿主菌為大腸桿菌ToplO或鰻弧菌減毒林 MVAV6203,所述目標蛋白是遲鈍愛德華氏菌的EseB抗原蛋白。
在本發(fā)明的第三方面，提供了上述新型細菌表面展示系統(tǒng)在活疫苗開發(fā)，抗體制 備，多肽文庫篩選，環(huán)境生物吸附劑開發(fā)和全細胞生物催化方面的應用。
所述活疫苗是鰻弧菌多效價載體疫苗。
本發(fā)明的有益效果如下
1)本發(fā)明屬于基于鰻弧菌自身元件的表面展示系統(tǒng)，采用大腸桿菌外膜脂蛋白Lpp 蛋白和鰻弧菌外膜蛋白Omporfl, OmpU或Omp26La的融合子為載體，利用Lpp 的N-端信號肽，Omporfl， OmpU或Omp26La的跨膜錨定序列，成功將遲鈍愛 德華氏菌的EseB抗原蛋白展示到鰻弧菌減毒林MVAV6203的細胞表面，為進一步開發(fā)安全高效的鰻弧菌多效價載體疫苗打下了堅實的基礎。
2)利用本發(fā)明的新型細菌表面展示系統(tǒng)，通過Lpp的N-端信號肽，Omporfl， OmpU 或Omp26La的跨膜錨定序列，可以將異源蛋白(特別是具有免疫保護力的抗原蛋 白)成功地展示到細胞表面，以增強和優(yōu)化目標蛋白的生物學功能，增加所用 宿主菌林的生物學功能，本發(fā)明在抗體制備，多肽文庫篩選，環(huán)境生物吸附劑 的開發(fā)和全細胞生物催化方面等其他眾多領域具有潛在的應用價值。


圖l為本發(fā)明的質粒pUC18AE的載體圖譜，是將pUC18載體多克隆位點中的 五coR I位點的第四位堿基通過無義點突變的方法從T變?yōu)镃，從而使得五coR I位點被 去掉的產物。
圖2為本發(fā)明的質粒pLorfI、 pLU和pL26La的載體圖譜，是將/p; 基因片段和omporfl，ompU或omp26La基因片段overlap后的片段選用Sac I -SamH I酶切位點與圖 l所示的質粒pUC18AE連接得到的產物，其中在pLorfI、 pLU和pL26La基因片段 下游引物中引入了NsiI,EcoRI和BamHI的位點。
圖3是本發(fā)明的質粒pLUG和pL26LaG的載體圖譜，是將目的基因她片段選用 五coR I -Sa wH I酶切位點分別與圖2所示的質粒pLU或pL26La連接得到的產物。
圖4是本發(fā)明的質粒pLorflB、 pLUB和pL26LaB的載體圖譜，是將目標基因"e5 片段選用五coR I -SamH I酶切位點分別與圖2所示的質粒pLorfl， pLU或pL26La連接 得到的產物。
圖5是本發(fā)明的圖3所示的重組質粒pLUG和pL26LaG的構建流程圖。
圖6是本發(fā)明的圖4所示的重組質粒pLorf 1B的構建流程圖。
圖7a是分別含有質粒pLUG和pL26LaG的重組菌Top 10/pLUG和Top 10/pL26LaG 被展示到細胞表面的ELISA驗證結果。OM:外膜蛋白組分；CP:胞內蛋白組分；E/LUG: 菌林ToplO/pLUG; E/L26LaG:菌抹T叩10/pL26LaG; E/G: GFP胞內表達菌抹ToplO/pG。
圖7b是分別含有質粒pLUG和pL26LaG的重組菌Top 10/pLUG和T(jp 10/pL26LaG 被展示到細胞表面的Western-blot驗證結果。OM:外膜蛋白組分；CP:胞內蛋白組分； E/LUG:菌抹ToplO/pLUG; E/L26LaG:菌林ToplO/pL26LaG; E/G: GFP胞內表達菌 抹ToplO/pG。
圖8a是分別含有質粒pLorf 1B 、 pLUB和pL26LaB的重組菌Top 10/pLorf 1B 、
ToplO/pLUB和ToplO/pL26LaB被展示到細胞表面的ELISA驗證結果。OM:外膜蛋白 組分；CP:胞內蛋白組分；E/LorflB:菌林ToplO/pLorflB; E/LUB:菌林ToplO/pLUB; E/L26LaB:菌抹ToplO/pL26LaB; E/B: EseB胞內表達菌抹ToplO/pB。
圖8b是分別含有質粒pLorf!B 、 pLUB和pL26LaB的重組菌Topi0/pLorflB 、 ToplO/pLUB和ToplO/pL26LaB被展示到細胞表面的Western-blot驗證結果。OM:外膜 蛋白組分；CP:胞內蛋白組分；E/LorflB:菌4朱Topl0/pLorflB; E/LUB:菌抹 ToplO/pLUB; E/L26LaB:菌抹ToplO/pL26LaB; E/B: EseB胞內表達菌抹ToplO/pB。
圖9a是分別含有質粒pLorflB, pLUB和pL26LaB的重組菌AV/pLorflB、 AV/pLUB 和AV/pL26LaB被展示到細胞表面的ELISA驗證結果。OM:外膜蛋白組分；CP:胞內 蛋白組分，A/LorflB:菌林AV/pLorflB; A/LUB:菌株AV/pLUB; A/L26LaB:菌林 AV/pL26LaB; A/B: EseB胞內表達菌林AV/pB。
圖9b是分別含有質粒pLorflB, pLUB和pL26LaB的重組菌AV/pLorflB、 AV/pLUB 和AV/pL26LaB被展示到細胞表面的Western-blot驗證結果。OM:外膜蛋白組分；CP: 胞內蛋白組分，A/LorflB:菌抹AV/pLorflB; A/LUB:菌抹AV/pLUB; A/L26LaB: 菌林AV/pL26LaB; A/B: EseB胞內表達菌林AV/pB。
具體實施例方式
本發(fā)明首先構建新型細菌表面展示系統(tǒng)，首先獲得所需的細菌跨膜定位轉運序列 以及目標蛋白基因序列，然后依次連接，獲得融合序列。
所述目標蛋白基因序列是指編碼所希望在細胞表面展示的蛋白的基因序列。
上述的細菌跨膜定位轉運序列包括的大腸桿菌外膜脂蛋白信號肽的核苷酸序列 和鰻弧菌核苷酸序列，以及目標蛋白基因序列的獲得可以采用PCR擴增、直接合成或 其他合適方式獲得，可以采用酶切連接、over-lap PCR擴增或其他合適方式將上述序 列連接獲得融合蛋白。
本發(fā)明的Lpp蛋白來源于大腸桿菌五"/^n'c/z/a co//. (￡. co/!'),鰻弧菌外膜蛋白 Omporf 1 、 OmpU或Omp26La來源于鰻弧菌F/6n'o awgw7/"rww MVM425 >該菌抹具有 以下特征
兼性厭氧，弧形狀，極生單鞭毛，革蘭氏陰性，最適生長溫度25 28。C, 0%NaCl 和高于6 7。/。NaCl不生長，過氧化氫酶和氧化酶陽性，可利用檸檬酸鹽，賴氨酸脫羧 酶和鳥氨酸脫羧酶陰性，葡萄糖不產氣，蔗糖發(fā)酵產酸，可產淀粉酶、脂酶和酪蛋白
酶，脲酶陰性，青霉素抗性陽性，Ol血清型。
本發(fā)明所用的Lpp蛋白的信號肽和N端的前9個氨基酸如SEQ ID NO:l所示，所用 的Omporfl蛋白的分子量為7.4 kDa,其6-50位氨基酸如SEQ ID NO:2所示，OmpU蛋白 的分子量為35.4kDa,其180-238位氨基酸如SEQ ID NO:3所示，Omp26La蛋白的分子 量為28.2 kDa，其80-158位氨基酸如SEQ IDNO:4所示。
利用上述的新型細菌表面展示系統(tǒng)在宿主菌的細胞表面展示目標蛋白時，實現(xiàn)方 式可以將其置于載體上，比如質粒pUC18;所用的宿主菌可以是大腸軒菌、鰻孤菌或 其它細菌宿主，比如大腸桿菌Top 10或鰻弧菌減毒林MVAV6203 。
本發(fā)明利用大腸桿菌外膜脂蛋白和鰻弧菌外膜蛋白構建的一 系列新型細菌表面 展示系統(tǒng)，能將目標蛋白成功展示到細菌表面，可增強和優(yōu)化目標蛋白的生物學功能， 或增加所用宿主菌抹的生物學功能。本發(fā)明拓寬了鰻弧菌減毒林的應用范圍，為構建 減毒活疫苗提供了技術支持，也拓展了細菌表面系統(tǒng)的開發(fā)研究，為其在眾多領域的 廣泛應用打下了基礎。
為更好的理解本發(fā)明的內容，下面以大腸桿菌外膜脂蛋白Lpp和鰻弧菌外膜蛋白 Omporfl, OmpU或Omp26La為例，作進一步說明。 實施例l 新型細菌表面展示系統(tǒng)的構建和目標蛋白表面展示的檢測 1.新型細菌表面展示系統(tǒng)的構建
1.1選取要構建展示系統(tǒng)的各基因片段并通過PCR克??；
1.2回收各基因片段
從所要研究的對象上回收目標基因片段，采用TIANGEN公司的膠回收試劑盒進 行回收。瓊脂糖凝膠電泳結束后，EB染色，在長波紫外燈上迅速切下目的條帶，裝 入Eppendorf管并稱取重量，加入3倍體積的溶膠液PN， 50°C水浴放置10分鐘，其間不 斷溫和地上下翻轉離心管，以確保膠塊充分溶解；將得到的溶液加入吸附柱中離心 (12,000卬m離心30 sec),倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中；向 吸附柱中加入70(Hil漂洗液PW， 12,000 rpm離心30 sec，倒掉廢液，再用500 nl漂洗液 PW12,000rpm離心30 sec,倒掉廢液。將離心吸附柱放回收集管中，12,000 rpm離心2 min,盡量出去漂洗液，再將吸附柱置于室溫或50。C溫箱數(shù)分鐘，徹底地晾干后，將 其放到一個干凈地離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加不少于30 nl的洗脫緩沖液 EB buffer,室溫放置2 min, 12,000 rpm離心1 min收集含目的片段的DNA溶液，電泳 檢測回收DNA濃度。
1.3將pUC18栽體多克隆位點中的5②R I位點的第四位堿基通過無義點突變的方法 從T變?yōu)镃。擴增4/HII-Sac I位點中的pUC18片段，并在PCR擴增的下游引物中將EcoR I位點處的第四位石威基從T變?yōu)镃,再將此片段通過4/7III-Sflc I雙酶切，將pUC18也通
過這兩個酶切，回收純化大片段和含有4/mi-s"ci位點的目的片段，將目的片段與切
割后的質粒用T4 DNA連接酶16'C連接過夜，CaCl2轉化法轉化Top10,得到質粒載體 pUC18厶E。
1.4將/; ;7基因和ow/wr/7， owpf/或om/ 26i^基因同時正向與pUC18AE質粒連接。將/; p 和0附; 0//7， ow/ C/或ow/ 26i^基因通過overlap PCR的方法連接到一起，再將這些連接 片段分別通過Sac I和5awH I酶切，將pUC18AE也通過這兩個酶切，回收純化大片段 和含有&c I -5awH I位點的目的片段，將目的片段與切割后的質粒用T4 DNA連接酶 16。C連接過夜，CaCl2轉化法轉化Top10，得到質粒pLorfl, pLU和pL26La,將質粒pLorfl: pLU和pL26La分別用EcoR I和5a附H I酶切，將也用這兩個酶切并回收純化后的目的 基因片段與切割后的質粒用T4 DNA連接酶16'C連接過夜，CaCl2轉化法轉化Top10, 得到大腸桿菌重組菌。 1.5鰻弧菌重組菌的構建
接種鰻弧菌MVAV6203于5 ml高鹽LB培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)，再按1:100轉接100 ml 高鹽LB培養(yǎng)液，于30。C以200 rpm振蕩培養(yǎng)至OD6oo的值為0.6時，離心收集菌體，將 菌體在冰浴中放置一段時間，使細胞盡可能接近0。C,并用272mM的蔗糖緩沖液洗滌 菌體三次，再用適量蔗糖緩沖液(1 ml)懸浮菌體，使其菌液濃度為lxl0"m1,得到 電轉化感受態(tài)細胞。取100 pl感受態(tài)菌懸液于一個0.2 cm的電轉化杯(Bio-Rad公司產 品)中，加入一定濃度的供體質粒DNAIO (Lil，混勻后在冰浴上放置IO min,用 GenepulserTM型電脈沖儀(Bio-Rad公司產品)進行電脈沖。電脈沖參數(shù)選定為脈〉中 場強V-2kV/cm,脈沖時間為3ms。電脈沖完畢后，加入800 pl LB培養(yǎng)液于電轉杯 中，并轉入1.5 ml的離心管中在30 。C200rpm恢復培養(yǎng)3 h后，涂布于LB瓊脂抗性平板， 置于30 。C培養(yǎng)。氨芐為200 pg/ml。 2目標蛋白表面展示的^r測
2.1將上述得到的鰻弧菌重組菌進行外膜蛋白組分的抽提
菌體蛋白由以下方法制備將含有質粒的大腸桿菌ToplO菌抹接種在含lOO 嗎/ml氨卡青霉素的LB低鹽液體培養(yǎng)基，200 rpm 37 。C培養(yǎng)過夜，作為一級種，第二 天將一級種按1:100( v/v )接種于含有50 ml工作濃度的LB低鹽(Amp )培養(yǎng)基的250 ml 三角瓶中，作為二級種，37 °C 200卬m搖床培養(yǎng)至00600=0.6，加入誘導劑IPTG至終 濃度0.5 mmo1/1，于37 。C誘導表達12 h，收獲菌體。對含有質粒的鰻弧菌MVAV6203 菌林接種在含200叫/ml氨芐青霉素的LB高鹽液體培養(yǎng)基，200 rpm 30 。C培養(yǎng)過夜， 作為一級種，第二天將一級種按I:IOO( v/v)接種于含有50 ml工作濃度的LB高鹽(Amp) 培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，作為二級種，30°C 200rpm搖床培養(yǎng)24h,收獲菌體。對 收獲的菌體IOOOO g離心2 min, PBS洗滌三次以后，重懸在1.5 ml Tris-HCl-NaCl (50 mM， pH 8.0, containing 0.3% NaCl)緩沖液中，將此重懸液在冰浴中超聲破菌5 min至菌 體完全破碎，將得到的菌體裂解液在4 。C 10000 g離心5 min以去除未裂解的細胞和細 胞碎片。為得到全部的膜蛋白，將上清液在4 。C 20000 g超速離心l h( Sigma， Osterode, Germany),則得到的上清為可溶的胞內蛋白成分，沉淀為全部的膜蛋白。為了得到 外膜成分，將沉淀重懸在0.4mlHEPES(10mM, pH7.4)緩沖液中，再和0.4 ml含有20/0 SLS的HEPES緩沖液(IO mM， pH 7.4)混勻以溶解內膜，將此混合液在室溫下放置30 min后再在4 。C 20000 g超速離心l h，從而得到外膜蛋白顆粒，上清中為內膜蛋白，再 重復一次外膜成分的提取步驟將得到較純的外膜蛋白。
2.2 ELIS A檢測外膜、胞內蛋白組分
胞內蛋白組分和外膜蛋白組分都先稀釋到相同的OD ( OD280 = 1.0 )。然后在每個 ELISA板孔中加入50 pl各組分溶液，4 。C包被過夜，次日，棄去孔內溶液，用PBST 緩沖液洗3次，每孔加入200 nl含有3。/。BSA的PBST于37。C封閉l h,后棄去孔內溶液， 用PBST緩沖液洗3次，加入稀釋到適當倍數(shù)的兔抗一抗，37。C孵育1.5 h，用PBST緩 沖液洗3次以后細胞抗體復合物再與1:5000 (v/v)稀釋的辣根過氧化氫酶結合的羊抗 兔二抗(Jackson公司產品)37。C孵育l h, PBST洗3次以后，每孔加入IOO pl單組分 可溶型TMB底物顯色液(天根公司產品)37 。C作用10-30 min,每孔再加入IOO pl 1M H2S04終止反應，每孔的吸光值用酶標儀(Bio-Red公司產品)于450nm的波長下檢測。 其中以胞內表達該蛋白的菌為陰性對照。
2.3 SDS-PAGE凝膠的制備
取30%凝膠母液(29.2%丙烯酰胺，0.8%曱叉雙丙烯酰胺)2ml， 1.5 M Tris-HCl， pH 8.8, 1.3 ml， 10% SDS 50 pl，超純水1.6 ml， 10%過石危酸銨50 pi, TEMED 2 pl，混 勻后注入垂直板電泳制膠器中，加封一層水，于室溫下聚合l h左右即為12。/。的分離 膠。傾去上層的水，取30%凝膠母液330 ^1, lMTris-HCl, pH 6.8， 250 10 % SDS 20^1,超純水1.4ml， 10%過硫酸銨20 TEMED 2 混勻后注入分離膠上層，插 入電泳梳板，于室溫下聚合1 h。 2.4 Western-blot檢測各蛋白組分
將稀釋到相同的OD( OD280 = 1.0 )的胞內和外膜蛋白組分取等體積和上樣緩沖液 (10% SDS, 10% 2-硫醇，pH6.8 0.3MTris-HCl， 0.05%溴苯酚藍，50%甘油)混 勻，在12%的SDS-PAGE膠中進行電泳，之后將切除濃縮膠的分離膠用電轉儀(Bio-Red 公司產品)在90V電壓下的電轉緩沖液(25mmol/lTris-HCl， 192 mmol/l甘氨酸，20 %曱醇)中電轉移3 h到PVDF膜上，將電轉好的膜取出，在37 °C PBS-T-BSA溶液(含 0.05%土溫和1% BSA的PBS緩沖液)中封閉l h之后進行免疫^r測將PVDF膜在37 。C與稀釋到適當倍數(shù)的兔抗一抗孵育1.5 h,然后用l: 5000 ( v/v)稀釋的辣根過氧化 氬酶結合的羊抗兔二抗標記，37 。C孵育lh,用PBS-T溶液洗過之后，加入100pl單組 分沉淀型TMB底物顯色液，37 。C作用15 min進行顯色，再用1 M 112804終止反應，觀 察結果。其中以胞內表達該蛋白的菌為陰性對照。
實施例2綠色熒光蛋白的新型細菌表面展示系統(tǒng)的構建、展示與檢測
根據所需要展示的目標蛋白和其它所需的核苷酸序列設計引物，并在引物兩端引 入合適的酶切位點。以質粒pUC18為模板，引物pUCF和pUCR擴增得到pCU18質粒上 的一段序列，并在下游引物中將&oR I位點的第四位堿基進行突變，利用兩端的4/ 111 和&cl位點將它連到經過同樣酶切的pCU18片段中，得到突變了五coRl位點的 pCU18厶E (圖l );以鰻弧菌MVM425基因組為模板，利用引物ompUF和ompUR擴增 得到所需的OmpU蛋白的一^f殳編碼序列，利用引物omp26LaF和omp26LaR擴增得到所 需要的Omp26La蛋白的一段編碼序列，以pTX101質粒(Francisco J.A., Earhart C.F., Georgiou G. 1992. Transport and anchoring of beta-lactamase to the external surface of Esc/^〃W /a co//. Proc Natl Acad Sci U S A 89(7):2713-7 )為模板，lppF和lppR為引物擴 增得到所需要的一段/; p序列，再通過overlap PCR的方法將/p; 片段和omp[/片段或 ow; 26Za片段融合到一起，Sac I和BawH I位點被用來將這兩個融合片段分別連到 pCU18AE的相應位點內，得到重組質粒pLU和pL26La (圖2);以mTn5gM"-; 她12 質粒為模板，gfpF和gfpR為引物擴增得到gfp序列，利用五coR I和5awH I位點，將它 連到質粒pLU或pL26La上，得到重組表達質粒pLUG和pL26LaG (圖3 )。將pLUG和 pI^6LaG分別轉入ToplO中。通過對表達的ToplO/pLUG和ToplO/pLS6LaG菌抽提外膜 蛋白組分并分別做ELISA (圖7a)和Western-blot (圖7b)驗證知GFP蛋白被成功展示
到外膜上。證明了系統(tǒng)Lpp-0mpU和L卯-0mpS6La都可以在大腸桿菌宿主中將外源胞 內蛋白展示到外膜上，在抗體制備，多肽文庫篩選，環(huán)境生物吸附劑的發(fā)展和全細胞 生物催化的發(fā)展等領域有潛在的應用價值。
設計合成的引物
pUCF: 5 ， -CCACATGTTCTTTCCTGCGT-3 ，；
pUCR: 5,-TCCGAGCTCGAGTTCGTAATCATGGTC-3';
反應條件為94 。C 30 s, 55 。C 30 s, 72 。C 55 s,共30個循環(huán)，72 。C 7 min。
lppF: 5'-GGTGAGCTCAATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGG-3，；
lppR: 5，-CGGGGTACCCCGCTGATCAATTTTAGCGTTG-3，；
反應條件為94。C30s, 55 。C 30 s, 72 。C 20 s,共30個循環(huán)，72 。C 7 min。
ompUF: 5，- CAGCGGGGTACCCCGAATGCAGATGGCTACTCT國3，；
AAGTACC陽3，；
反應條件為94。C30s， 50。C30s， 72 。C 20 s，共30個循環(huán)，72 。C 7 min。 omp26LaF: 5' -C AGCGGGGT ACCCCGTTCTTTGGT A AC AC AGG-3'; omp26LaR: 5，-CGGGATCCAGCCATGAATTCCGGATGCATGACATGGAAGTA GTTAACG-3，；
反應條件為94 。C 30 s, 50 。C 30 s, 72 。C 25 s,共30個循環(huán)，72 。C 7 min。 gfpF: 5，-CCGGAATTCATGGCTAGCAAAGGAG-3 ，； gfpR: 5'國CGCGGATCCTTATTTGTACAGTTCATCCATGCCATG-3,; 反應條件為94。C30s, 51。C30s， 72 。C 55 s,共30個循環(huán)，72 。C 7 min。
實施例3EseB抗原蛋白的新型細菌表面展示系統(tǒng)的構建、展示與檢測
遲鈍愛德華氏菌是一種在淡水魚類和海洋魚類中可以引起出血性敗血病的病原 菌，它在水環(huán)境中有一個很廣泛的感染宿主范圍，而且對于許多動物甚至人都有一定 的感染性。EseB蛋白來自于致病性的遲鈍愛德華氏菌，為細菌III型分泌系統(tǒng)中的膜元 件蛋白，有報道稱EseB蛋白的缺失可以使遲鈍愛德華氏菌的毒性降低，證明其與細菌 致病性相關(Srinivasa Rao P. S.， Yamada Y., Tan Y.P., Leung K.Y. 2004. Use of proteomics to identify novel virulence determinants that are required for五d而油/e〃fl pathogenesis. Mol Microbiol 53 (2), 573-586 )。
根據所需要展示的目標蛋白和其它所需的核苷酸序列設計引物，并在引物兩端引 入合適的酶切位點。以鰻弧菌MVM425基因組為模板，利用引物omporf 1 F和omporf 1R 擴增得到所需要的Omporfl蛋白的一段編碼序列，利用實施例2方法得到所需的Lpp蛋 白的一段編碼序列，再通過overlap PCR的方法將&; 片段和ow/ w/7片段融合到一起， Sac I和5awH I位點被用來將此融合片段連到pCU18AE的相應位點內，得到重組質粒 pLorfl(圖2);根據實施例l的方法獲得重組質粒pLU和pL26La;以克隆有遲鈍愛德 華氏菌EseB蛋白編碼基因eseB的質粒pPRoD為模板，利用引物eseBF和eseBR進行PCR 擴增w^的基因，獲得符合預期大小(600 bp)的特異性擴增產物，回收該產物，利 用其兩端的五coR I和5flwH I位點直接分別克隆到也經過相同酶切的pLorfl， pLU或 pL26La質粒上，得到含有融合基因// /Vo/n; (^/7/e^5， // / /owp[7/ew5或 /p/7/ow;^6丄a/e^B的重組質粒pLorflB, pLUB或pL26LaB (如圖4所示)。將pLorflB, pLUB或pL26LaB分另'J轉入Top10和鰻弧菌MVAV6203中。通過對表達的 ToplO/pLorflB , Topl0/pLUB ， ToplO/pL26LaB以及AV/pLorflB , AV/pLUB , AV/pL26LaB菌抽提外膜蛋白組分并分別做ELISA (圖8a，圖9a)和Western-blot (圖 8b,圖9b)驗證知EseB蛋白不管是在大腸桿菌T叩10宿主中還是鰻弧菌MVAV6203宿 主中都被成功展示到外膜上，證明了Lpp-Omporfl系統(tǒng)在大腸桿菌或者鰻弧菌宿主中 都可以將外源蛋白展示到外膜上，同時證明了Lpp-OmpU和Lpp-Omp26La系統(tǒng)還可以 在鰻弧菌宿主中將外源胞內蛋白展示到外膜上，本研究將EseB作為一個潛在的具有保 護力的抗原蛋白，將其與Lpp-Omporf 1/OmpU/Omp26La展示系統(tǒng)相融合，并展示于鰻 弧菌減毒林的細胞表面，有望研制并開發(fā)出同時針對鰻弧菌和遲鈍爰德華氏菌感染的 的多效價載體活疫苗，為構建鰻弧菌多效價減毒活疫苗打下了基礎。
設計合成的引物
omporflF: 5'-CAGCGGGGTACCCCGATCGCACTATTAGCATCTT-3，；
omporflR: 5，國CGGGATCCAGCCATGAATTCCGGATGCAT TGCCGTTACTG TACCTACT-3，；
反應條件為94。C30s, 51。C30s, 72 。C 20 s,共30個循環(huán)，72 。C 7 min。
eseBF: 5 ，-CCGGAATTCATGACTGTCAATAC-3 ，；
eseBR: 5，-CGGGATCCTTAGCGGATATTCTGGG-3';
反應條件為94 。C 30 s, 57 。C 30 s， 72 。C 45 s,共30個循環(huán)，72 。C 7 min。
所以，利用Lpp-Omporf 1 、 Lpp-OmpU或Lpp-Omp26La的融合子作為載體，可以 將目標蛋白定位表達于細菌表面，既可增強和優(yōu)化目標蛋白的生物學功能，也可增加 所用宿主菌抹的生物學功能，在活疫苗發(fā)展，抗體制備，多肽文庫篩選，環(huán)境生物吸 附劑的發(fā)展和全細胞生物催化的發(fā)展等眾多領域都具有潛在的應用價值。
綜上所述，本發(fā)明的新型細菌表面展示系統(tǒng)能在細菌細胞表面成功展示目標蛋 白，可用于活疫苗開發(fā)，抗體制備，多肽文庫篩選，環(huán)境生物吸附劑開發(fā)和全細胞生 物催化方面，特別用于在鰻弧菌減毒林的基礎上構建安全高效的鰻弧菌多效價載體疫 苗。
需要說明的是，在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每 一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，以上所述的是本發(fā)明的具體實施例 及所運用的技術原理，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對 本發(fā)明作各種改動或修改而不背離本發(fā)明的精神與范圍，這些等價形式同樣落在本發(fā)
明的范圍內。
序列表
<110> 華東理工大學
<120> 新型細菌表面展示系統(tǒng)、方法及應用
<160> 4
<210> 1 <211> 42 <212> PRT
<213> 大腸桿菌(五sc/zer/c/n-fl co//) <220>
<221> SIGNAL <222> (1)..(33)
<223> 外膜脂蛋白Lpp蛋白的信號肽和N端前9個氨基酸序列 <400> 1
Met Thr Met lie Thr Asn Ser Ser Ser Met Lys Ala Thr Lys Leu Val 15 10 15
Leu Gly Ala Val lie Leu Gly Ser Thr Leu Leu Ala Gly Cys Ser Ser 20 25 30
Asn Ala Lys lie Asp Gin Arg Gly Thr Pro 35 40
<210> 2 <211> 45 <212> PRT
<213> 綬弧菌(附Wo awgwz'〃ar扁) <220>
<221> TRANSMEM <222> (1)..(45)
<223> 外膜蛋白Omporfl蛋白的6-50位氨基酸序列 <400> 2
lie Ala Leu Leu Ala Ser Phe Ala Phe Gly Gly Val Ala Met Ala Ala 15 10 15
Val Glu Glu Thr Thr Thr Ala Ser Thr Thr Gly Gly Ala Ala Gly Gly 20 25 30
Thr Ala Ala Thr Thr Ala Ala Val Gly Thr Val Thr Ala 35 40 45
<210> 3
<211> 59
<212〉 PRT
<213> 縵弧菌(附〃'o朋gw/〃07"謹) <220>
<221> TRANSMEM
<222> (1)..(59)
<223> 外膜蛋白OmpU蛋白的180-238位氨基酸序列
<400> 3
Asn Ala Asp Gly Tyr 1 5
Gly Val Lys Leu Gly 20
Ala Ser Ser Asp Gin 35
Phe Tyr Phe Ala Gly 50
<210> 4
<211> 79
<212> PRT
<213> 緩弧菌(附"'o朋gw!'〃ar畫)
<220>
<221> TRANSMEM <222> (1)..(79)
<223> 外膜蛋白Omp26La蛋白的80-158位氨基酸序列 <400> 4
Phe Phe Gly Asn Thr Gly Asp Val Val Asn Leu Gly Thr Tyr Uu Thr 15 10 15
Gly Ser Gly Val Thr Tyr Asp Gin Asp Ser Ala Asn Ser Val Lys Gly 20 25 30
Ser Leu Ser Ala lie Tyr Ala lie Gly Asp Thr
10 15
Ala Gly Tyr Ala Asp Gin Asp Thr Ala Ala Asn 25 30
Tyr Met Leu Ala Ala Ser Tyr Ala lie Ser Asp 40 45
Thr Phe Val Asp Gly Gin 55
Met Asp Lys Arg Lys Ala Thr lie Asp Leu Gly Leu Asn Ala Asp lie 35 40 45
Ala Leu Gly Asp Gly Thr Val Ser Thr Tyr Phe Gin His Asp lie Leu 50 55 60
Asn Glu Asn Lys Gly Tyr Lys Thr Gly Val Asn Tyr Phe His Val 65 70 7權利要求
1.一種新型細菌表面展示系統(tǒng)，包括細菌跨膜定位轉運序列和編碼目標蛋白的基因序列，所述細菌跨膜定位轉運序列包括大腸桿菌外膜脂蛋白信號肽的核苷酸序列，其特征在于，所述細菌跨膜定位轉運序列還包括鰻弧菌核苷酸序列，所述鰻弧菌核苷酸序列連接所述大腸桿菌外膜脂蛋白信號肽的核苷酸序列和所述編碼目標蛋白的基因序列，所述鰻弧菌核苷酸序列編碼的蛋白包括鰻弧菌外膜蛋白的跨膜錨定序列。
2. 如權利要求l所述的新型細菌表面展示系統(tǒng)，其特征在于，所述大腸桿菌外膜脂蛋 白為Lpp蛋白，所述鰻弧菌外膜蛋白為Omporfl蛋白，OmpU蛋白或Omp26La蛋白。
3. 如權利要求2所述的新型細菌表面展示系統(tǒng)，其特征在于，所述細菌跨膜定位轉運 序列是編碼所述Lpp蛋白的信號肽及N端的前9個氨基酸的核苷酸序列和編碼所述 Omporfl蛋白的6-50位氨基酸的核苷酸片段、編碼OmpU蛋白的180-238位氨基酸的 核苷酸片段X編碼Omp26La蛋白的80-158位氨基酸的核苷酸片段。
4. 如權利要求3所述的新型細菌表面展示系統(tǒng)，其特征在于，所述目標蛋白是遲鈍愛 德華氏菌的EseB抗原蛋白。
5. —種利用如權利要求l所述的新型細菌表面展示系統(tǒng)在細菌的細胞表面展示目標 蛋白的方法，其特征在于，包括以下步驟a. 將所述新型細菌表面展示系統(tǒng)構建入表達載體上，獲得重組表達載體；b. 將所述重組表達載體導入宿主菌中進行表達，獲得融合蛋白，所述融合蛋白 包括所述信號肽、所述跨膜錨定序列和所述目標蛋白。
6. 如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述大腸桿菌外膜脂蛋白為Lpp蛋白，所 述鰻弧菌外膜蛋白為Omporf 1蛋白，OmpU蛋白或Omp26La蛋白。
7. 如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述細菌跨膜定位轉運序列是編碼所述Lpp 蛋白的信號肽及N端的前9個氨基酸的核苷酸序列和編碼所述Omporf 1蛋白的6-50 位氨基酸的核苷酸片段\編碼OmpU蛋白的180-238位氨基酸的核苷酸片段\編碼 Omp26La蛋白的80-158位氨基酸的核苷酸片段，所述宿主菌為大腸桿菌或鰻弧菌。
8. 如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述表達載體是pUC18,所述宿主菌為大 腸桿菌ToplO或鰻弧菌減毒抹MVAV6203,所述目標蛋白是遲鈍愛德華氏菌的EseB抗原蛋白。
9. 如權利要求l所述的新型細菌表面展示系統(tǒng)在活疫苗開發(fā)，抗體制備，多肽文庫篩 選，環(huán)境生物吸附劑開發(fā)和全細胞生物催化方面的應用。
10. 如權利要求9所述的應用，其特征在于，所述活疫苗是鰻弧菌多效價載體疫苗。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新型細菌表面展示系統(tǒng)，包括細菌跨膜定位轉運序列和編碼目標蛋白的基因序列，所述細菌跨膜定位轉運序列包括大腸桿菌外膜脂蛋白信號肽的核苷酸序列，還包括鰻弧菌核苷酸序列，其連接大腸桿菌外膜脂蛋白信號肽的核苷酸序列和編碼目標蛋白的基因序列，其編碼的蛋白包括鰻弧菌外膜蛋白的跨膜錨定序列，大腸桿菌外膜脂蛋白為Lpp蛋白，鰻弧菌外膜蛋白為Omporf1蛋白，OmpU蛋白或Omp26La蛋白，本發(fā)明的新型細菌表面展示系統(tǒng)能在細胞表面成功展示目標蛋白，可用于活疫苗開發(fā)，抗體制備，多肽文庫篩選，環(huán)境生物吸附劑開發(fā)和全細胞生物催化方面，特別用于在鰻弧菌減毒株的基礎上構建安全高效的鰻弧菌多效價載體疫苗。
文檔編號C12N15/09GK101195823SQ20071017063
公開日2008年6月11日 申請日期2007年11月20日 優(yōu)先權日2007年11月20日
發(fā)明者琴 劉, 張元興, 朝 楊, 王啟要 申請人:華東理工大學