專利名稱：表面清潔程度及微生物污染快速檢測方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑組及裝置，尤其涉及一種對表面清潔程度及微生物污染進(jìn)行快速檢測的試劑組及利用試劑組進(jìn)行檢測的裝置，同時本發(fā)明也可以被應(yīng)用于消毒后的操作界面、食品生產(chǎn)企業(yè)的流水線和液體污染檢測，屬于生物化學(xué)及生物發(fā)光領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
食品衛(wèi)生認(rèn)證體系—危害因子關(guān)鍵控制點(diǎn)(HACCP)正被引入世界范圍的食品行業(yè)。許多國家，如歐盟各成員國已將其列為法定措施。目的是，讓可能影響食品安全的關(guān)鍵因素都列入監(jiān)測范圍，并采用快速方法進(jìn)行衛(wèi)生檢測以便留有時間采取改進(jìn)措施。我國衛(wèi)生部也曾頒發(fā)“食品企業(yè)實(shí)施HACCP體系”的指南[衛(wèi)法監(jiān)發(fā)(2000年)174號]。HACCP是Hazard Analysis Critical ControlPoint(危險(xiǎn)因素分析關(guān)鍵控制點(diǎn))的英文縮寫，也是發(fā)達(dá)國家普遍采用對食品、飲料企業(yè)的生產(chǎn)設(shè)備的細(xì)菌及食品殘?jiān)?細(xì)菌滋生條件)污染程度進(jìn)行產(chǎn)前監(jiān)控的認(rèn)證體系。隨著我國人民生活水平的提高，人們的健康衛(wèi)生意識逐漸提高，尤其是食品安全是當(dāng)前深受政府和人民普遍關(guān)注的問題。食品衛(wèi)生的不規(guī)范，給人們的生活和健康帶來了極大的危害。此后，衛(wèi)生部從2004年5月1日實(shí)施的“食品企業(yè)衛(wèi)生規(guī)范”中對蜜餞、乳制品、飲料、熟肉制品及定型包裝飲用水五類企業(yè)的環(huán)境衛(wèi)生、廠房設(shè)施衛(wèi)生、人員衛(wèi)生及清潔消毒、污水管理提出了明確要求。
如何實(shí)施HACCP體系，在開始新一批次生產(chǎn)前，或清潔消毒后，生產(chǎn)設(shè)施食品接觸表面的衛(wèi)生程度就屬關(guān)鍵控制點(diǎn)。以前，是通過目測觀察有無食品殘?jiān)图?xì)菌學(xué)檢測評估衛(wèi)生狀況。目測盡管很快，但多數(shù)情況下靈敏度不夠，而細(xì)菌學(xué)檢測方法，在取得結(jié)果前要經(jīng)過3-7天的樣品培育，完全不能適應(yīng)HACCP的要求。因此，ATP法就成了既能提供實(shí)時結(jié)果，又有足夠靈敏度的主要檢測手段。檢測總體ATP，即不區(qū)分其ATP來自食物殘?jiān)?，還是來自微生物細(xì)胞。多數(shù)情況下，微生物ATP只占總體ATP的小部分。食品殘?jiān)仁俏⑸锷L的培養(yǎng)基，又起抵消滅菌的作用。因此，要避免重新污染，如由空氣途徑引起的污染，就必須去除食品殘?jiān)?。ATP檢測的主要優(yōu)點(diǎn)，在起早期的警示作用，告訴你表面清潔度較差的部位將有細(xì)菌滋生。即使是無菌的表面，ATP值高表明有食物殘?jiān)?，在明天早上開始生產(chǎn)前就會有大量的細(xì)菌生長。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，如果，用ATP法檢測衛(wèi)生水平得到改善，那么，用常規(guī)培養(yǎng)法也同樣顯示得到改善的結(jié)果。
鑒于ATP存在于所有生物體中，所以通過檢測ATP，就可以間接地證明生物體的存在和表面清潔程度。20世紀(jì)80年代，英國人首先研制出ATP檢測儀(檢測系統(tǒng))，隨后發(fā)展到歐洲、美國和日本。應(yīng)用范圍涉及食品加工、超市和飲食行業(yè)，檢測內(nèi)容包括微生物和食品殘?jiān)?998年，日本國會頒布了《關(guān)于食品制造過程管理高度化臨時措施法》，其中即包含了應(yīng)用ATP檢測儀(檢測系統(tǒng))的內(nèi)容。1999年，日本還成立了ATP涂抹檢查研究會，專門研究該方法的使用效率和應(yīng)用領(lǐng)域，其內(nèi)容之一就是在食品衛(wèi)生監(jiān)測領(lǐng)域中，解決現(xiàn)場微生物的檢測問題。20世紀(jì)末，一些ATP檢測儀(檢測系統(tǒng))及技術(shù)被引進(jìn)我國，到目前為止，除個別省級衛(wèi)生監(jiān)督檢測單位裝備外，主要是在一些外資或合資企業(yè)中自行檢測使用。由于國內(nèi)目前還缺少能與HACCP認(rèn)證體系配套，對食品污染的微生物總量進(jìn)行準(zhǔn)確、快速檢測的科技手段，致使已經(jīng)頒布的“規(guī)范”“標(biāo)準(zhǔn)”或認(rèn)證體系難以發(fā)揮應(yīng)有的效果。因此，制成操作簡單、易于保存、集成程度高、靈敏度高的表面清潔程度及微生物污染快速檢測方法、試劑及裝置，是解決我國進(jìn)行快速衛(wèi)生監(jiān)測以滿足各行業(yè)微生物標(biāo)準(zhǔn)檢測以達(dá)到衛(wèi)生規(guī)范要求的重要技術(shù)保障。
螢火蟲的發(fā)光是由于其體內(nèi)能產(chǎn)生稱作螢火蟲熒光素酶的特殊蛋白質(zhì)，它是一種以ATP(三磷酸腺苷)為必需底物，能將化學(xué)能轉(zhuǎn)變成光能的生物催化劑，它能將有效的存在于所有生物(人、動植物、微生物)細(xì)胞中的能量物質(zhì)ATP以及熒光素轉(zhuǎn)變成熒光，反應(yīng)式如下
其中ATP三磷酸腺苷；Beetle Luciferin蟲熒光素；O2氧氣；Mg++二價鎂離子；Firefly Luciferase螢火蟲蟲光素酶；AMP一磷酸腺苷；Oxyluciferin氧化熒光素；PPi焦磷酸；CO2二氧化碳。
但是由于微生物處于自然的狀態(tài)和環(huán)境中，往往得不到足夠的營養(yǎng)或在一定的狀態(tài)下無法有效利用食品或一些表面上的營養(yǎng)物質(zhì)，這就必然照成細(xì)菌會消耗掉自身的ATP來維持自身的生存(ATP水解反應(yīng)或是其它的酶促反應(yīng)都會大量消耗ATP)，直到外界營養(yǎng)變得豐富或外界營養(yǎng)變得能被細(xì)菌或微生物充分利用。這就照成很多的時候?qū)嶋H測量微生物或一些界面的表面得到的ATP經(jīng)螢火蟲蟲熒光素酶催化發(fā)出的熒光值非常低，但是用傳統(tǒng)的平皿計(jì)數(shù)法卻得到了一個較高的污染值。
所以這就要求我們要把損失的ATP通過一些方法還原回去，才能更準(zhǔn)確的通過ATP熒光法計(jì)算出表面清潔程度和微生物污染情況。ATP硫酸化酶(ATPsulfurylase)在腺苷酰硫酸(adenosine-5’-phosphosulfate APS)存在的情況下可以催化焦磷酸(PPi)生成ATP，這樣就可以使水解成焦磷酸(PPi)的ATP得到了補(bǔ)償，極大的提高了靈敏度，使一些原本處于休眠或活力很低的微生物也能夠被檢測出來。而以往這個反應(yīng)只是被應(yīng)用到基因測序的工作上，但是應(yīng)用在表面清潔程度和微生物污染檢測上也可得到很好的效果。

發(fā)明內(nèi)容
1、發(fā)明目的本發(fā)明提供了可通過一步操作在十幾秒至一分種內(nèi)便可以檢測出表面清潔程度及微生物污染的快速檢測試劑組及其檢測裝置，其目的是解決傳統(tǒng)的“活細(xì)胞平皿計(jì)數(shù)法”對食品污染的微生物總量是否超標(biāo)檢測的速度慢、效率低，和已有的ATP熒光法細(xì)菌及表面清潔程度快速檢測試劑組操作繁瑣且不易在較高溫度下保存的弊病。本發(fā)明更使用了ATP硫酸化酶在腺苷酰硫酸存在的情況下可以催化焦磷酸(PPi)生成ATP，使損失的ATP得到了補(bǔ)償，從而極大的提高了靈敏度。同時本發(fā)明也是一種能與HACCP認(rèn)證體系配套，對食品污染的微生物總量進(jìn)行準(zhǔn)確、快速檢測的試劑組及裝置。
2、技術(shù)方案本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的表面清潔程度及微生物污染快速檢測試劑(QuickTest)以下簡稱(QT)，整個試劑系統(tǒng)是一個高度集成的試劑系統(tǒng)主要包括五部分
(1).細(xì)菌及其它微生物的三磷酸腺苷提取釋放系統(tǒng)(2).將焦磷酸(PPi)還原回ATP的反應(yīng)體系(3).三磷酸腺苷酶(ATPase)抑制劑(4).三磷酸腺苷被螢火蟲熒光素酶催化發(fā)光的反應(yīng)體統(tǒng)(5).使螢火蟲熒光素酶及整個反應(yīng)系統(tǒng)在4℃可長期穩(wěn)定保存的緩沖體系一體化試劑組分及各組分濃度及質(zhì)量比為螢火蟲熒光素酶 0.1μg/ml-15mg/mlD-蟲熒光素 0.03mM-2.0mMTriton X-100 0.1％-10％Tween-20 0.001％-0.3％緩沖液 0.005％-0.5％牛血清白蛋白(BSA) 0.2mg/ml-5mg/mlDTT0.1mM-10mM甘油 0.5％-20％寡霉素(oligomycin) 0.005mM-2.5mM輔酶A(CoA) 0.005mM-1.5mMATP硫酸化酶(ATP sulfurylase) 2×10-8U/ml-8×10-5U/ml腺苷酰硫酸(APS)0.002mM-1.0mM緩沖液主要組分和濃度及質(zhì)量比如下Tricine(三甲基甘氨酸)或Tris 1mM-50mM硫酸鎂或醋酸鎂或氯化鎂中的一種 0.5mM-100mMEDTA(乙二胺四乙酸)或CDTA(環(huán)乙烷二胺四醋酸)0.1mM-20mM用NaOH 調(diào)整pH值為7.8各體系構(gòu)成及作用機(jī)理如下a.細(xì)菌及其它微生物的三磷酸腺苷釋放提取系統(tǒng)由Triton X-100構(gòu)成，也可以替換成其它非離子去污劑Triton X-114，Triton X-305，TritonN101，同樣可取得令人滿意的效果，在多種陽離子、陰離子和非離子去污劑中，只有Triton系列的非離子去污劑才能與螢火蟲熒光素酶共存與一個試劑系統(tǒng)中。
b.三磷酸腺苷催化發(fā)光系統(tǒng)由螢火蟲熒光素酶、D-蟲熒光素、輔酶A及緩沖液構(gòu)成。輔酶A可以使螢火蟲熒光素酶催化發(fā)光的效率大大提高，提高瞬時的發(fā)光值，有助于提高整個發(fā)光發(fā)應(yīng)的靈敏度。
c.使螢火蟲熒光素酶及整個反應(yīng)系統(tǒng)在4℃可穩(wěn)定保存至少7個月的緩沖體系由牛血清白蛋白、DTT、甘油。牛血清白蛋白、DTT在合適的濃度下可以對螢火蟲熒光素酶的催化活性有促進(jìn)作用，但是超過一定的濃度將對酶的催化活性產(chǎn)生抑制作用。甘油作為穩(wěn)定劑對酶和整個體系在4℃下儲存有關(guān)鍵性的作用，當(dāng)甘油的量低于一個濃度的時候?qū)⑵鸩坏揭粋€保護(hù)性的作用，但當(dāng)甘油的濃度過高又將抑制酶的活性照成檢測的靈敏度下降。
d.三磷酸腺苷酶(ATPase)抑制劑。由于任何生命體內(nèi)除了含有ATP外還含有可以分解ATP釋放能量的三磷酸腺苷酶(ATPase)，在提取劑釋放出ATP的同時也釋放出了三磷酸腺苷酶，而且三磷酸腺苷酶對ATP的特異性作用不亞螢火蟲熒光素酶，在幾秒鐘內(nèi)便可把微生物內(nèi)釋放和食物殘?jiān)姷腁TP分解，照成螢火蟲熒光素酶催化發(fā)應(yīng)受到嚴(yán)重影響，所以必須在釋放ATP的同時使三磷酸腺苷酶受到抑制甚至滅活。本發(fā)明所采用的三磷酸腺苷酶抑制劑為寡霉素(oligomycin)和EDTA共同作用。
e.ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase)在腺苷酰硫酸(adenosine-5’-phosphosulfate APS)存在的情況下可以催化焦磷酸(PPi)生成ATP，這樣便能使菌體和ATP發(fā)光有一個真正可靠的對應(yīng)關(guān)系。由于ATP經(jīng)過螢火蟲熒光素酶的催化發(fā)光也會產(chǎn)生PPi，所以應(yīng)保證加入的ATP硫酸化酶不應(yīng)高于10-7U/ml。
f.本檢測裝置為筆形由透明材料制成的發(fā)光反應(yīng)倉，帶有無ATP棉簽的樣品采集棒，上端試劑儲存?zhèn)}三部分組成。透明的發(fā)光反應(yīng)倉采用玻璃或合成材料構(gòu)成，合成材料為透明的聚丙烯(PP)或透明的聚苯乙烯(PS)，合成材料更便于批量生產(chǎn)及質(zhì)量的控制。
3、優(yōu)點(diǎn)及效果通過本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)施，能夠很好地解決傳統(tǒng)的“活細(xì)胞平皿計(jì)數(shù)法”對食品污染的微生物總量進(jìn)行檢測的速度慢、效率低的問題?，F(xiàn)有的ATP熒光檢測法都沒有成功解決的蟲光素酶及蟲熒光素構(gòu)成的發(fā)光體系無法在非冷凍條件下長時間保存，且裂解劑和三磷酸腺苷酶(ATPase)抑制劑無法和整個發(fā)光體系共存在一個體系的問題，而本發(fā)明都能夠很好的解決。同時通過使用ATP硫酸化酶把PPi轉(zhuǎn)化為ATP的方法就可以不用考慮由于菌體所處的生長時期不同造成ATP含量的不同而影響ATP熒光法測量的準(zhǔn)確性。同時本發(fā)明的檢測裝置在無ATP棉簽把手上設(shè)計(jì)了一個特殊的試劑倉，可以配合不同特性的試劑完成一些較為復(fù)雜的檢測，像細(xì)菌的含量的測定，也可以有選擇性的測定某種細(xì)菌的含量等。
附圖的簡要說明附

圖1詳細(xì)的示意了筆型一步操作快速表面清潔程度及微生物污染裝置的剖面圖附圖2帶有特殊的試劑倉的無ATP棉簽中帶螺紋、密封橡膠墊及十字型刺針的活塞3局部放大1中整個裝置由帶有特殊的試劑倉的無ATP棉簽2；內(nèi)有鋁箔膜和十字型撞針的管狀連接裝置5；裝有表面清潔程度及微生物污染快速檢測試劑(QuickTest)的透明發(fā)光反應(yīng)倉10構(gòu)成。
1為帶有防滑條紋的旋轉(zhuǎn)把手，通過旋轉(zhuǎn)把手1可以使帶有密封橡膠墊的活塞3向下壓縮帶動連在3上的十字型刺針16向下運(yùn)動，刺破底端的鋁箔膜封口14。隨著活塞3的旋轉(zhuǎn)下降可使十字型刺針16在鋁箔膜封口14形成圓洞，便可使特殊用途的試劑15由于活塞3下降形成的壓力而順著圓洞留下，流入中空的硬質(zhì)導(dǎo)管中6，沿著硬質(zhì)導(dǎo)管中6流到硬質(zhì)導(dǎo)管的先端的多開口處7便與附著在7上的無ATP棉簽13上的檢測樣品先發(fā)生反應(yīng)。
特殊用途的試劑15與無ATP棉簽13上的檢測樣品的反應(yīng)液被鋁箔膜8截住，用力下壓帶有防滑條紋的旋轉(zhuǎn)把手1頂端使帶有特殊的試劑倉的無ATP棉簽2刺破鋁箔膜8，使帶有特殊的試劑倉的無ATP棉簽2繼續(xù)向下使十字型刺針12脫離支架9刺破鋁箔膜8，這樣才能使原本在上層鋁箔膜8上的特殊用途的試劑15與無ATP棉簽13上的檢測樣品的反應(yīng)液通過兩層鋁箔膜進(jìn)入透明發(fā)光反應(yīng)倉10，與里面的表面清潔程度及微生物污染快速檢測試劑(QuickTest)11接觸發(fā)生反應(yīng)放出熒光。
4為可以使帶有特殊的試劑倉的無ATP棉簽2與內(nèi)有鋁箔膜和十字型撞針的管狀連接裝置5相對固定的小突起，可以和帶有特殊的試劑倉的無ATP棉簽2外壁上的凹槽相互吻合，這樣才能旋轉(zhuǎn)帶有防滑條紋的旋轉(zhuǎn)把手1使帶有密封橡膠墊的活塞3向下運(yùn)動。17為與螺紋18互相咬合的螺紋槽。
圖2中3為帶有密封橡膠墊的活塞，1為帶有防滑條紋的旋轉(zhuǎn)把手，18為與17互相咬合的螺紋，19為帶有密封橡膠墊的活塞3下端的密封橡膠墊，16為十字型刺針。
具體實(shí)施例方式在實(shí)施本發(fā)明時，把無ATP的棉簽用無ATP的0.05％Tween20或含有10mM PBS和含有0.05％Tween20的混合溶液潤濕，這樣有助于把被檢測物體表面的微生物及食物殘?jiān)芡耆牟潦孟聛?。然后把棉簽在被檢測的表面適當(dāng)大小的區(qū)域進(jìn)行涂抹或擦拭，然后將棉簽插入筆式的檢測倉中，并用力下壓棉簽把手，使棉簽刺破下面的鋁箔復(fù)合膜，使之與下面的表面清潔程度及微生物污染快速檢測試劑(QT)接觸，并進(jìn)行振蕩使之充分混合。這時QT試劑中的裂解提取系統(tǒng)將裂解微生物細(xì)胞并釋放出來的ATP，同時三磷酸腺苷酶(ATPase)抑制劑將抑制微生物體內(nèi)釋放出的三磷酸腺苷酶的活性，ATP硫酸化酶催化腺苷酰硫酸(APS)和焦磷酸(PPi)反應(yīng)使水解的ATP進(jìn)行還原，之后含有螢火蟲蟲光素酶的發(fā)光體系將催化ATP熒光反應(yīng)發(fā)出熒光。這時通過熒光檢測儀測定從該筆式檢測裝置下端的透明發(fā)光倉發(fā)出的熒光量，便可推值實(shí)際樣品的表面清潔程度及微生物污染情況。如有特殊要求就可以利用檢測裝置上的特殊的試劑倉中的試劑對檢測樣品先進(jìn)行處理再利用以上方法檢測。
通過以上操作便可以實(shí)現(xiàn)對食品企業(yè)生產(chǎn)線界面或原材料表面清潔程度及微生物污染進(jìn)行快速評估。首先要對食品企業(yè)生產(chǎn)線界面或原材料標(biāo)準(zhǔn)化處理，然后運(yùn)用國家標(biāo)準(zhǔn)方法《GB/T 4789.2-2003食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》對處理的效果進(jìn)行檢驗(yàn)，如果這種標(biāo)準(zhǔn)化處理的結(jié)果符合國家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，便把這個處理后的食品企業(yè)生產(chǎn)線界面或原材料表面利用本發(fā)明測得一個發(fā)光值，則這個發(fā)光值就是一個標(biāo)準(zhǔn)值，當(dāng)發(fā)光值低于或近似等于此值的時候都是衛(wèi)生條件符合標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)發(fā)光值大于這個標(biāo)準(zhǔn)值時則是視為衛(wèi)生條件不合格。利用這種方法極大的縮短了檢測時間、提高了檢測效率，為切實(shí)貫徹和推行HACCP標(biāo)準(zhǔn)提供了一個有利的工具和技術(shù)保障。
表1 Triton X-100裂解劑的最佳濃度的選擇實(shí)驗(yàn)的細(xì)菌為等體積、等濃度的培養(yǎng)16小時的大腸桿菌。菌體經(jīng)過10000rpm離心1分鐘，用0.85％生理鹽水洗滌兩邊并用0.85％的生理鹽水懸垂起來。10μl菌液加入到100μl反應(yīng)試劑中。

從表1可知，在實(shí)驗(yàn)的菌液和其它試劑組成部分不變的情況下，含有1.00％濃度Triton X-100的QuickTest試劑的熒光值是最高的，所以證明1.00％濃度Triton X-100對細(xì)菌具有最佳的裂解效果。
表2為添加三磷酸腺苷酶(ATPase)抑制劑與不添加三磷酸腺苷酶(ATPase)抑制劑在同等條件下的對比實(shí)驗(yàn)的細(xì)菌為等體積、等濃度的培養(yǎng)16小時的大腸桿菌。菌體經(jīng)過10000rpm離心1分鐘，用0.85％生理鹽水洗滌兩邊并用0.85％的生理鹽水懸垂起來。10μl菌液加入到100μl反應(yīng)試劑中。

由上表可見添加1倍濃度寡霉素整個發(fā)光值提高了33％，而添加3倍濃度寡霉素時整個發(fā)光值提高了52％，當(dāng)寡霉素的濃度提高到5倍濃度時發(fā)光值提高了83％。所以添加三磷酸腺苷酶(ATPase)抑制劑對整個發(fā)光反應(yīng)的測定值有很大的影響，如要得到一個比較準(zhǔn)確而又真實(shí)的發(fā)光值就要添加三磷酸腺苷酶抑制劑。
表3為使用ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase)催化腺苷酰硫酸(APS)和焦磷酸(PPi)反應(yīng)對水解的ATP進(jìn)行還原與未進(jìn)行還原的各種試樣的發(fā)光值

通過表4可知，在使用ATP sulfurylase使水解的ATP還原后，能得到一個較高的發(fā)光值這樣就使一些處于休眠或由于環(huán)境不利而照成微生物ATP很低的情況也能被輕易的檢測出來。而傳統(tǒng)的ATP檢測法卻只能測得很低的值甚至是0，所以通過使水解ATP還原的方法能更可靠、更準(zhǔn)確的檢測出那些不易被傳統(tǒng)ATP法檢測到的污染。
表4 QuickTest試劑對不同種細(xì)菌及不同濃度測試得到的發(fā)光值及通過國家標(biāo)準(zhǔn)方法《GB/T 4789.2-2003食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》得到的對應(yīng)菌數(shù)

表5含有使螢火蟲熒光素酶在4℃可長期穩(wěn)定保存體系和未含該體系的表面清潔程度及微生物污染快速檢測試劑熒光值對比

權(quán)利要求
1.一種利用ATP經(jīng)催化發(fā)光可對表面清潔程度及微生物污染進(jìn)行快速檢測和評估的方法和裝置，其特征在于，使樣品的三磷酸腺苷提取釋放和催化發(fā)光可以一步完成；同時解決了螢火蟲熒光素酶高溫下不穩(wěn)定，可使非耐熱性螢火蟲熒光素酶在4℃保存七個月以上；同時可使ATP提取劑與熒光素酶共存于一個穩(wěn)定的試劑系統(tǒng)；并利用可催化焦磷酸(PPi)生成ATP的試劑來提高檢測的靈敏度和穩(wěn)定性；同時在試劑系統(tǒng)中加入ATP酶抑制劑以抑制細(xì)菌內(nèi)部ATP酶對發(fā)光值的影響。
2.權(quán)利要求1所述的方法，表面清潔程度及微生物污染快速檢測試劑系統(tǒng)由以下五個部分組成(1).細(xì)菌及其它微生物的三磷酸腺苷提取釋放系統(tǒng)；(2).將焦磷酸(PPi)還原回ATP的反應(yīng)體系；(3).三磷酸腺苷酶(ATPase)抑制劑；(4).三磷酸腺苷被螢火蟲熒光素酶催化發(fā)光的反應(yīng)體統(tǒng)；(5).使螢火蟲熒光素酶及整個反應(yīng)系統(tǒng)在4℃可穩(wěn)定長期保存的緩沖體系。
3.權(quán)利要求2所述的方法，可催化焦磷酸(PPi)生成ATP的試劑系統(tǒng)含有ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase)和腺苷酰硫酸(adenosine-5’-phosphosulfate APS)。
4.權(quán)利要求2所述的方法，使非耐熱性螢火蟲熒光素酶在4℃下長期保存試劑中應(yīng)加入牛血清白蛋白、DTT、甘油的混合液，甘油的含量應(yīng)該不高于20％。
5.權(quán)利要求2所述的方法，可與螢火蟲熒光素酶共存于一個穩(wěn)定的試劑系統(tǒng)的三磷酸腺苷釋放提取系統(tǒng)由Triton X-100構(gòu)成，也可以替換成其它非離子去污劑Triton X-114，Triton X-305，TritonN101。
6.權(quán)利要求2所述的方法，螢火蟲熒光素酶催化ATP發(fā)光體系中應(yīng)添加輔酶A，以得到一個較高的瞬時發(fā)光值來提高檢測的靈敏度。
7.權(quán)利要求2所述的方法，試劑系統(tǒng)中加入的ATP酶抑制劑為寡霉素(oligomycin)和EDTA的混合物，且濃度不能影響螢火蟲熒光素酶及蟲熒光素催化ATP發(fā)光。
8.權(quán)利要求2所述的方法，試劑系統(tǒng)組成為螢火蟲熒光素酶 0.1μg/ml-15mg/mlD-蟲熒光素 0.03mM-2.0mMTriton X-100 0.1％-10％Tween-20 0.001％-0.3％緩沖液 0.005％-0.5％牛血清白蛋白(BSA)0.2mg/ml-5mg/mlDTT(二硫蘇糖醇) 0.1mM-10mM甘油 0.5％-20％寡霉素(Oligomycin) 0.005mM-2.5mM輔酶A(CoA) 0.005mM-1.5mMATP硫酸化酶 2×10-8U/ml-8×10-5U/ml腺苷酰硫酸(APS) 0.002mM-1.0mM。
9.權(quán)利要求8所述的方法，緩沖液含有Tricine(三甲基甘氨酸)或Tris1mM-50mM硫酸鎂或醋酸鎂或氯化鎂中的一種 0.5mM-100mM乙二胺四乙酸或CDTA(環(huán)乙烷二胺四醋酸) 0.1mM-20mM用NaOH調(diào)整pH值為7.8。10.權(quán)利要求1所述的方法，取樣方法采取無ATP的棉簽在表面進(jìn)行涂抹，或樣品以液體形式滴加到棉簽上。
11.權(quán)利要求10所述的方法，固體樣品取樣前無ATP的棉簽用高純度的水或含有10mM PBS和含有0.05％Tween20的混合溶液潤濕。
12.權(quán)利要求1所述的方法，整個檢測裝置為筆型，上端無ATP棉簽的把手含有一個試劑儲存?zhèn)}，下端含有一個可以盛放整個試劑系統(tǒng)的透明發(fā)光反應(yīng)倉。
13.權(quán)利要求12所述的方法，無ATP棉簽把手上的試劑儲存?zhèn)}采用螺旋方式加壓釋放試劑，并配以可刺破試劑儲存?zhèn)}封膜的十字型刺針。
14.權(quán)利要求12所述的方法，無ATP棉簽把手上的試劑儲存?zhèn)}可以預(yù)置與下面發(fā)光發(fā)應(yīng)倉內(nèi)試劑配合使用的各種試劑。
全文摘要
一種用于表面清潔程度及微生物污染的快速檢測方法和裝置。通過高度集成的試劑和裝置，可以使復(fù)雜的操作在一個操作步驟內(nèi)完成并可在一分鐘內(nèi)得到檢測結(jié)果。利用ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase)在腺苷酰硫酸(adenosine－5’－phosphosulfate APS)存在的情況下可以催化焦磷酸(PPi)生成三磷酸腺苷(ATP)，使水解成焦磷酸的ATP得到還原，克服了微生物在營養(yǎng)條件不好水解自身ATP照成ATP熒光法檢測結(jié)果不準(zhǔn)確的問題。同時通過添加螢火蟲蟲熒光素酶穩(wěn)定劑來簡化保藏條件，添加三磷酸腺苷酶抑制劑提高檢測精度及靈敏度。
文檔編號G01N21/76GK1804602SQ20051013425
公開日2006年7月19日 申請日期2005年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月15日
發(fā)明者盧麟麟 申請人:盧麟麟