專利名稱：：用于肝祖細(xì)胞擴(kuò)增或分化的細(xì)胞外基質(zhì)組分的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般涉及肝祖細(xì)胞的體外增殖或分化。更具體地說，本發(fā)明涉及能使包括肝干細(xì)胞在內(nèi)的肝祖細(xì)胞在體外增殖和/或分化的細(xì)胞外基質(zhì)組分的鑒定和選擇。
背景技術(shù)：
：肝干細(xì)胞及其子代(如成肝細(xì)胞和定向祖細(xì)胞)有相當(dāng)大的擴(kuò)增潛能。所以，這些細(xì)胞是用于細(xì)胞治療(包括生物人造肝臟或細(xì)胞移植)的理想的候選群體。盡管前景看好，但是，肝細(xì)胞治療的全部潛能還仍停留在認(rèn)識階段。在某種程度上，肝干細(xì)胞及其子代的體外增殖已證實(shí)很有挑戰(zhàn)性。雖然肝干細(xì)胞及其子代能在體內(nèi)成功地增殖，但是其培養(yǎng)條件并非從實(shí)驗(yàn)室臺面轉(zhuǎn)向臨床實(shí)踐的最佳條件。例如，一些培養(yǎng)條件極大阻礙了細(xì)胞分裂或者任意促進(jìn)細(xì)胞分化，從而降低了增殖效能。而且，一些培養(yǎng)條件中需要添加多種因子(如血清或飼養(yǎng)細(xì)胞)，而這些因子能引入污染物，從而限制了它們在人類治療中的應(yīng)用。所以，需要有能促進(jìn)肝干細(xì)胞及其子代在體外增殖的培養(yǎng)條件和能對干細(xì)胞進(jìn)行世系限制，使其向合適的命運(yùn)分化的條件。另外，還需要有能消除對詞養(yǎng)細(xì)胞的需求的培養(yǎng)條件。
發(fā)明內(nèi)容在本發(fā)明的一實(shí)施例中，提供了一種使肝祖細(xì)胞在體外增殖的方法，其包括(a)提供分離出的肝祖細(xì)胞，和(b)在包含從肝臟干細(xì)胞區(qū)室中發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞外基質(zhì)組分或多種細(xì)胞外基質(zhì)組分組合的層上培養(yǎng)分離出的肝祖細(xì)胞。所述細(xì)胞外基質(zhì)組分可以是III型膠原、IV型膠原、層粘連蛋白、透明質(zhì)素、其他糖胺聚糖、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、硫酸軟骨素蛋白聚糖或其組合。在一些實(shí)施例中，所述層可以包含其他細(xì)胞外基質(zhì)組分，它們可以是蛋白聚糖如聚集素(agrin)、串珠素(perlecan)、整合素、巢蛋白、肌營養(yǎng)不良聚糖等，或基粘附分子(basaladhesionmolecule)如纖連蛋白，或其他蛋白如彈性蛋白及其組合。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，第一細(xì)胞外基質(zhì)組分是III型膠原，第二細(xì)胞外基質(zhì)蛋白是層粘連蛋白。根據(jù)本發(fā)明的方法，分離出的肝祖細(xì)胞可以是分離出的肝干細(xì)胞、分離出的成肝細(xì)胞、定向肝祖細(xì)胞，或其組合。另外，該方法可以進(jìn)一步包括在飼養(yǎng)細(xì)胞存在條件下，培養(yǎng)肝祖細(xì)胞，所述飼養(yǎng)細(xì)胞可以是胚胎細(xì)胞、胎兒細(xì)胞、新生兒細(xì)胞和/或鼠源細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞優(yōu)選為成血管細(xì)胞。該方法還可以包括在不含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)肝祖細(xì)胞的步驟。優(yōu)選地，所述不含血清的培養(yǎng)基包含胰島素(5嗎/ml)、轉(zhuǎn)鐵蛋白/Fe(5嗎/ml)和脂混合物(游離脂肪酸、高密度脂蛋白)、低含量鈣(<0.5mM)以及很少量或不含銅。所述肝祖細(xì)胞可以從胎兒、新生兒、幼體或成體肝臟中獲得。所述層粘連蛋白的濃度可以約為0.1-10jig/cm2，優(yōu)選為約0.5-5嗎/cm2，更優(yōu)選為0.5嗎/cm2或ljig/cm2。III型或IV膠原的濃度各為約0.1-15|ig/cm2，優(yōu)選為約0.5-8嗎/cm2，更優(yōu)選為約l-7)ig/cm2。在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，提供了一種使肝祖細(xì)胞增殖的方法，其包括(a)提供含有從肝臟的干細(xì)胞區(qū)室中發(fā)現(xiàn)的一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)組分的第一層；(b)提供含有從肝臟的干細(xì)胞區(qū)室中發(fā)現(xiàn)的一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)組分的第二層；以及(c)在第一層和第二層之間培養(yǎng)分離出的肝祖細(xì)胞。所述細(xì)胞外基質(zhì)組分可以是m型膠原、IV型膠原、層粘連蛋白、透明質(zhì)素、蛋白聚糖(如硫酸乙酰肝素和/或硫酸軟骨素蛋白聚糖)或其組合。在一些實(shí)施例中，所述層可以包含其他細(xì)胞外基質(zhì)組分，它們可以是其他蛋白聚糖(如聚集素(agrin)、串珠素(perlecan)、巢蛋白、肌營養(yǎng)不良聚糖)，其他基粘附分子(如纖連蛋白)和其他細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(如彈性蛋白)及其組合。在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施例中，所述第一細(xì)胞外基質(zhì)組分是m型膠原，所述第二細(xì)胞外基質(zhì)組分是層粘連蛋白。根據(jù)本發(fā)明的方法，分離出的肝袓細(xì)胞可以是分離出的肝干細(xì)胞、分離出的成肝細(xì)胞、定向肝祖細(xì)胞，或其組合。另外，該方法可以進(jìn)一步包括在提供間充質(zhì)祖細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下，培養(yǎng)肝祖細(xì)胞，所述間充質(zhì)祖細(xì)胞可以來源于胚胎、胎兒、新生兒、幼體或成體組織，而且可以取自任何哺乳類動(dòng)物。該飼養(yǎng)細(xì)胞優(yōu)選為成血管細(xì)胞。該成血管細(xì)胞優(yōu)選來自肝臟。成血管細(xì)胞優(yōu)選來自與肝祖細(xì)胞相同的細(xì)胞類群。該方法還可以進(jìn)一步包括在不含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)肝祖細(xì)胞的步驟。所述肝祖細(xì)胞可以從胎兒、新生兒、幼體或成體肝臟中獲得。所述層粘連蛋白的濃度可以約為0.1-10pg/cm2，優(yōu)選為約0.5-5昭/cm2，更優(yōu)選為0.5或ljig/cm2。III型或IV膠原各自的濃度約為0.1-15|ig/cm2，優(yōu)選為約0.5-8|ig/cm2，更優(yōu)選為約l-7|ig/cm2。在本發(fā)明的再一實(shí)施例中，提供了一種用于肝祖細(xì)胞增殖的器皿，其包括(a)器皿(如組織培養(yǎng)板、實(shí)驗(yàn)室芯片、生物反應(yīng)器)和(b)含有在肝臟小生境的干細(xì)胞區(qū)室中發(fā)現(xiàn)的至少一種細(xì)胞外基質(zhì)組分的非可溶性層，其中，該非可溶性材料基本上覆蓋在器皿內(nèi)的或器皿的表面上。同樣，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會理解，本文公開內(nèi)容所依據(jù)的思想可以很容易地用作實(shí)現(xiàn)本發(fā)明幾個(gè)目的的其他結(jié)構(gòu)、方法和系統(tǒng)的設(shè)計(jì)基礎(chǔ)。因此，很重要的一點(diǎn)是，權(quán)利要求應(yīng)視為包括那些未脫離本圖1是培養(yǎng)設(shè)計(jì)系統(tǒng)和膠原基質(zhì)基層的示意圖。i.)成肝細(xì)胞接種在由營養(yǎng)培養(yǎng)基支持的組織培養(yǎng)塑料(TCP)表面上的對照培養(yǎng)；ii.)用來構(gòu)建膠原基質(zhì)基層(matrixsubstrate)的各成分的一種比例；iii.)接種了成肝細(xì)胞的膠原平板(FlatPlate)設(shè)計(jì)；iv.)膠原和成肝細(xì)胞的"三明治"式設(shè)計(jì)。圖2是往TCP表面上涂布單層基質(zhì)的技術(shù)示意圖。v.)TCP表面上進(jìn)行預(yù)涂布的起始步驟?；|(zhì)分子在設(shè)定的時(shí)間段內(nèi)不均勻地分布到該表面上。vi.)滅菌過程；vii.)1XPBS洗滌3次，中和膠原凝膠或纖維構(gòu)建程序中產(chǎn)生的乙酸pH。viii.)含有以單層形式接種到基質(zhì)上并由營養(yǎng)培養(yǎng)基支持的肝細(xì)胞的終產(chǎn)品。圖3提供了用于STO5培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)的基質(zhì)組分的免疫組織化學(xué)結(jié)果的圖片。圖4是培養(yǎng)第0、5、15和31天時(shí)肝細(xì)胞特征的定時(shí)20X顯微照片。圖4A:第0天顯現(xiàn)出較大團(tuán)塊的成肝細(xì)胞以及分散的單個(gè)細(xì)胞。圖4B:第5天顯現(xiàn)出匯集成片的肝細(xì)胞和相關(guān)的間充質(zhì)細(xì)胞。圖4C:第15天成肝細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞數(shù)量相同。圖4D:第31天富含間充質(zhì)細(xì)胞。圖5所示為在對照TCP、平板和三明治式設(shè)計(jì)系統(tǒng)內(nèi)培養(yǎng)的人胎兒肝細(xì)胞在第10天的IOX顯微圖片。A)對照培養(yǎng)反應(yīng)情況一一成肝細(xì)胞(h)被間充質(zhì)細(xì)胞(np)被淹沒。B)平板培養(yǎng)反應(yīng)情況一—成肝細(xì)胞集落，有少許間充質(zhì)細(xì)胞。C)三明治式培養(yǎng)反應(yīng)情況一一被免疫染色的表達(dá)白蛋白(紅色)和CK19(綠色)的成肝細(xì)胞(h)。圖6顯示了在各種不同基質(zhì)上生長的細(xì)胞所產(chǎn)生的尿素產(chǎn)量。A)對膠原III(■)、膠原IV(*)、層粘連蛋白()和膠原IV-層粘連蛋白混合物(▽)上培養(yǎng)的成肝細(xì)胞進(jìn)行分析并與塑料對照(▼)培養(yǎng)進(jìn)行比較。B)在TCP(*)、膠原I平板()和膠原I三明治(▽)上培養(yǎng)的成肝細(xì)胞的尿素功能。圖7顯示了在各種不同基質(zhì)上生長的細(xì)胞所產(chǎn)生的葡萄糖和尿素產(chǎn)量。A)在對照TCP(■)、平板(□)和三明治(i)系統(tǒng)設(shè)計(jì)上培養(yǎng)的成肝細(xì)胞的葡萄糖肝功能。B)在對照TCP(■)、平板(□)和三明治。)系統(tǒng)設(shè)計(jì)上培養(yǎng)的成肝細(xì)胞的肝臟氨水平圖8顯示了在肝細(xì)胞小生境的基質(zhì)組分上生長的肝祖細(xì)胞的體外生長特征。圖中所示為接種到A1)膠原III、Bl)層粘連蛋白和C1)膠原III和層粘連蛋白的混合物上的成肝細(xì)胞培養(yǎng)到第10天，從其所在整個(gè)平皿表面上方攝取的圖像。在IOX放大倍數(shù)下，對同一培養(yǎng)物進(jìn)行觀察(A2、B2禾卩C2)以便闡明細(xì)胞水平的反應(yīng)情況。圖9顯現(xiàn)出在胚胎基質(zhì)基層(膠原III和膠原IV)上接種人胎兒肝細(xì)胞之后肝干細(xì)胞集落的過度生長。第3天在所有基質(zhì)基層上顯現(xiàn)出成肝細(xì)胞。所有條件下還顯現(xiàn)出非實(shí)質(zhì)細(xì)胞(np)，并在顯微圖片中被予以標(biāo)記。膠原III上的培養(yǎng)物中最初在第3天發(fā)現(xiàn)肝干細(xì)胞，但在TCP、膠原III和膠原IV上培養(yǎng)到第10天肝干細(xì)胞也顯現(xiàn)出來。圖IO所示為根據(jù)本發(fā)明選擇出的肝干細(xì)胞。第12天，長時(shí)間培養(yǎng)中伴隨不同類型細(xì)胞的爆發(fā)(確定為成肝細(xì)胞)的分化動(dòng)力學(xué)從HSC集落邊緣出現(xiàn)。A)中突出標(biāo)識的區(qū)域表示從第3-11天開始進(jìn)化的HSC集落，B)展現(xiàn)出8小時(shí)時(shí)段內(nèi)的爆發(fā)。圖11為將肝細(xì)胞母液純化成HSC細(xì)胞母液的示意圖。圖12為傳代方案的示意圖最初將HSCs接種到對照TCP皿上，如A所示；再將HSCs轉(zhuǎn)移到6孔培養(yǎng)皿中的0.4nm多孔培養(yǎng)池上，如B所示；C是未處理培養(yǎng)池的俯視圖。D是預(yù)先涂覆在培養(yǎng)池上的膠原ni的俯視圖。E是轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)池表面上的細(xì)胞的終產(chǎn)品。圖13:A)被接種在TCP的成肝細(xì)胞包圍的聚集在一起的HSC。A2)Al中HSC聚集體的放大圖。Bl)接種在TCP上的經(jīng)ficol分離法純化的HSC聚集體。B2)Bl中HSC聚集體的放大圖。顯微圖片下方的信息表顯示的是免疫熒光反應(yīng)情況。高活性(++)、活性(+)、可變(+/-)和陰性(-)。圖14顯示的是用于標(biāo)記EpCAM、CK19禾BNCAM的免疫熒光圖。EpCAM是顯著陽性(Al相)對(A2熒光)。CK19顯現(xiàn)出可變性(B1&C1相)對(B2陰性HSC熒光&C2陽性熒光)。NCAM也顯現(xiàn)出可變性(D1&E1相)對(D2陽性&陰性HSC熒光&E2陽性熒光)圖15是接種在TCP或Bornstcin和Traub(BoTr)膠原I片段基層(SigmaIII型膠原)上時(shí)，對所形成的HSC集落數(shù)進(jìn)行的比較圖。另夕卜，更詳細(xì)的圖表示在其他成體(膠原I型)和胎兒(BD膠原III&IV)基質(zhì)上的集落形成圖16所示為接種在TCP或Bornstcin和Traub(BoTr)膠原I型片段基層(Sigmam型膠原)上HSC集落擴(kuò)增的反應(yīng)情況。箭頭指的是第7天新看到的集落。第18天，在4X顯微圖片中的BoTr表面上顯現(xiàn)出較大的集落聚集體，第30天，在兩個(gè)接種平面上均顯現(xiàn)出散開的聚集體。圖中顯示了塑料、BoTr和胎兒膠原III&IV基質(zhì)上的20X形態(tài)細(xì)節(jié)。圖17所示為接種在TCP(黑色)或Bornstcin和Traub(BoTr)膠原I型片段基層(SigmaIII型膠原)(灰色)上的HSCs的整個(gè)聚集體增殖圖樣。為進(jìn)行圖樣標(biāo)準(zhǔn)化，用較大的帶有波紋線的圓圈表示整個(gè)接種面(35mmD平皿)。接種在BoTr上的HSCs最早開始增殖(第5天)，得到較大的表面覆蓋率(第20天)，從表面散開時(shí)(第30天)比對照慢。當(dāng)接種到含購自BD的膠原III&IV和購自Vitrogen的膠原I的不同基質(zhì)基層上時(shí)，用更詳細(xì)的圖像對集落生長進(jìn)行了比較。圖18給出第5-30天的標(biāo)準(zhǔn)化后的細(xì)胞數(shù)量，圖中表示出從對數(shù)生長期(第5-10天)到飽和密度動(dòng)力學(xué)時(shí)期(第10-20天)再到后期匯集期(第20-30天)的變化情況。HSC的BoTr接種培養(yǎng)物顯示出，整個(gè)培養(yǎng)期間的增殖數(shù)增加。圖19所示為對數(shù)生長期(第5-10天)、飽和密度動(dòng)力學(xué)時(shí)期(第10-20天)和后期匯集期(第20-30天)的變化情況，展示出細(xì)胞增殖的"增倍"和"減弱"方面。圖20顯示出HSC向4個(gè)獨(dú)特表面的轉(zhuǎn)移。最初轉(zhuǎn)移了17個(gè)集落。轉(zhuǎn)移后的14天內(nèi)對HSC集落特性進(jìn)行了比較。Bomstdn和Traub(BoTr)膠原I型片段基層(SigmaIII型膠原，6jig/cm2)上轉(zhuǎn)移的HSCs提供了最有效的環(huán)境。圖21所示為標(biāo)準(zhǔn)化后的比較成肝細(xì)胞(第5-ll天)、HSCs和成肝細(xì)胞(第9-17天)，以及僅HSCs(第12-30天)的白蛋白函數(shù)圖。圖22所示為在TCP(黑框)與Bornstcin和Tmub(BoTr)膠原I型片段基層(SigmaIII型膠原)(淺灰色框)上培養(yǎng)的肝干細(xì)胞在第10和20天的端粒酶活性水平一一HeLa細(xì)胞(黑灰框)作為"基準(zhǔn)比較"。A)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化換算為蛋白質(zhì)水平的樣品活性。B)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化換算為細(xì)胞數(shù)的樣品活性。顯微圖片是相同的相中人HSCs、陰性對照，以及具有端粒酶表達(dá)的人HSCs。具體實(shí)施例方式在本發(fā)明的一實(shí)施例中，細(xì)胞外基質(zhì)組分被鑒定出，它們能促進(jìn)肝干細(xì)胞及其子代的附著、生存和體外增殖。本文中"肝祖細(xì)胞"用來泛指包括肝干細(xì)胞及其子代。"子代"可以包括自我復(fù)制的肝干細(xì)胞、成肝細(xì)胞、其多能祖細(xì)胞，以及定向分化成特定細(xì)胞類型(如肝細(xì)胞)的祖細(xì)胞。"克隆源細(xì)胞擴(kuò)增"(donogenicexpansion)是指能從一個(gè)細(xì)胞開始擴(kuò)增，經(jīng)傳代培養(yǎng)和反復(fù)擴(kuò)增，仍保持母細(xì)胞表型的細(xì)胞生長特性。"集落形成"是指能在一周或兩周內(nèi)進(jìn)行有限次細(xì)胞分裂(通常5-7次細(xì)胞分裂)的二倍體實(shí)質(zhì)細(xì)胞的特性，其包括具有能進(jìn)行傳代培養(yǎng)的有限能力的細(xì)胞。"多能"表示細(xì)胞能形成一種以上命運(yùn)的子細(xì)胞。"專能"或"定向祖細(xì)胞"是指具有一種成體命運(yùn)的細(xì)胞。肝干細(xì)胞(HSCs)是在胎兒和新生兒肝臟的管板(ductalplate)(又稱界板)以及幼體和成體肝臟的赫令管(CanalsofHering)中發(fā)現(xiàn)的多能細(xì)胞，端粒酶的表達(dá)，證明這些細(xì)胞能自我復(fù)制(ref)，而且移植時(shí)(refs)能形成成熟的肝臟細(xì)胞。這些細(xì)胞是EpCAM+、NCAM+、ALB+、CK8/18+、CK19+、CD133/l+，對所試驗(yàn)的所有造血標(biāo)志物(如CD34、CD38、CD45、CD14)、間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(CD146、VEGFr、CD31),以及P450s或a-甲胎蛋白的表達(dá)呈陰性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HSCs是成肝細(xì)胞和定向(單能)膽囊祖細(xì)胞的源頭。成肝細(xì)胞(HBs)是在胎兒和新生兒肝臟的整個(gè)實(shí)質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的多能細(xì)胞，以單細(xì)胞或細(xì)胞小集落形式束縛在赫令管的端部。成肝細(xì)胞來源于肝干細(xì)胞。成肝細(xì)胞共用肝干細(xì)胞上存在的許多抗原，但有重要區(qū)別。例如，成肝細(xì)胞不表達(dá)NCAM，而是表達(dá)ICAMI，而且成肝細(xì)胞表達(dá)大量的oi-甲胎蛋白和P450s胎兒形式。這些HBs產(chǎn)生單能祖細(xì)胞、定向肝祖細(xì)胞和膽囊祖細(xì)胞。肝定向祖細(xì)胞是肝系和膽囊系的單能祖細(xì)胞。它們的抗原特性與成肝細(xì)胞重疊，但是，膽囊定向祖細(xì)胞表達(dá)CK19，但不表達(dá)AFP或ALB;而肝定向祖細(xì)胞表達(dá)AFP禾卩ALB，但不表達(dá)CK19。定向膽囊祖細(xì)胞既直接來源于肝干細(xì)胞，也來源于成肝細(xì)胞。間充質(zhì)細(xì)胞(MCs)包括許多不同類型(按成熟細(xì)胞列舉，括號中為它們的前體)的間充質(zhì)細(xì)胞的各種不同世系階段中的細(xì)胞包括基質(zhì)(間充質(zhì)干細(xì)胞)、內(nèi)皮(成血管細(xì)胞)、星狀細(xì)胞(星狀細(xì)胞前體)和各種造血細(xì)胞(造血干細(xì)胞)。雖然本文討論和舉例的肝祖細(xì)胞中大部分(如果不是全部的話)涉及人源細(xì)胞群，但本文的教導(dǎo)不應(yīng)局限于人。事實(shí)上，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常應(yīng)該可以將本文的教導(dǎo)應(yīng)用到哺乳動(dòng)物(如小鼠、大鼠、狗等)肝祖細(xì)胞的擴(kuò)增中。所以，本發(fā)明的范圍欲包括任一及所有哺乳動(dòng)物的肝祖細(xì)胞。還應(yīng)注意，適于根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行體外增殖的肝祖細(xì)胞并不局限于根據(jù)任一特定方法分離或鑒定出的那些肝袓細(xì)胞。作為示例，肝祖細(xì)胞的分離和鑒定方法已有文獻(xiàn)記載，如美國專利6,069,005;美國專利申請09/487,318、10/135,700禾口10/387,547，其公開內(nèi)容通過引用整體并入本申請。肝干細(xì)胞和成肝細(xì)胞具有獨(dú)特的抗原性，能通過前面敘述的方案進(jìn)行分離。例如，肝干細(xì)胞和成肝細(xì)胞共用多種抗原(如細(xì)胞角蛋白8、18和19、清蛋白、CD133/1和上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM))，對造血標(biāo)志物(如血型糖蛋白A、CD34、CD38、CD45、CD14)和間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(如CD146、CD31、VEGFr或KDR)呈陰性。另夕卜，肝干細(xì)胞和成肝細(xì)胞能通過大小(肝細(xì)胞7-9pm;成肝細(xì)胞10-12pm)、培養(yǎng)形態(tài)學(xué)(肝細(xì)胞形成濃密的、形態(tài)一致的集落，而成肝細(xì)胞形成索狀結(jié)構(gòu)，其中散布有清晰的溝槽_—假定性小管)、某些抗原表達(dá)模式中的差異(EpCAM在整個(gè)肝干細(xì)胞中都有表達(dá)，但只在成肝細(xì)胞的細(xì)胞表面表達(dá))，或者通過不同的抗原特性(肝干細(xì)胞中存在N-CAM，而成肝細(xì)胞表達(dá)a-甲胎蛋白(AFP)和ICAM1)加以區(qū)分。胎兒和新生兒肝臟中，肝干細(xì)胞存在于管板(又稱"界板")內(nèi)，而成肝細(xì)胞是主要的實(shí)質(zhì)細(xì)胞群(>80%)。幼體和成體組織中，肝干細(xì)胞存在于赫令管內(nèi)，而成肝細(xì)胞是束縛在赫令管端部的細(xì)胞。正常組織中成肝細(xì)胞由少量細(xì)胞組成，但卻大量(如結(jié)節(jié))見于病變肝臟中(如肝硬化)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在肝臟的肝細(xì)胞小生境內(nèi)或附近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞外基質(zhì)組分能用于肝祖細(xì)胞擴(kuò)增而不誘導(dǎo)分化，優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)。下面會詳細(xì)介紹，在基質(zhì)組分上培養(yǎng)的細(xì)胞(在肝臟肝細(xì)胞小生境內(nèi)或附近發(fā)現(xiàn)的高豐度細(xì)胞)在某些基質(zhì)組分上(如層粘連蛋白)聚集形成橢球狀結(jié)構(gòu)，而在另一些組分(如ni型膠原)上鋪展開形成單層。在肝細(xì)胞小生境中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞外基質(zhì)組分的具體類型屬于肝祖細(xì)胞按自我復(fù)制模式擴(kuò)增的信號必需物，自我復(fù)制模式是指對稱的細(xì)胞分裂(子細(xì)胞與母細(xì)胞相同或近乎相同)。我們進(jìn)一步認(rèn)為，肝干細(xì)胞的成熟依存于指導(dǎo)(至少一定程度上)肝干細(xì)胞分化的基質(zhì)組分的獨(dú)特組合。某些細(xì)胞外基質(zhì)組分允許肝祖細(xì)胞發(fā)生由不對稱分裂引起的擴(kuò)增，這類擴(kuò)增與某些分化一起發(fā)生。但另一些位于發(fā)現(xiàn)有完全成熟肝細(xì)胞的肝臟組織區(qū)域中的細(xì)胞外基質(zhì)會引起細(xì)胞生長停滯和完全分化。所以，用胚胎組織(或肝細(xì)胞小生境)中發(fā)現(xiàn)或富含的基質(zhì)組分進(jìn)行體外培養(yǎng)，有助于維持成熟形式的肝干細(xì)胞。同樣，用從成熟組織中發(fā)現(xiàn)的或成熟組織中富含的基質(zhì)組分培養(yǎng)，也可以影響這些細(xì)胞的分化。的確，將位于肝腺泡中心靜脈附近狄氏間隙內(nèi)的肝祖細(xì)胞平鋪到與成熟實(shí)質(zhì)細(xì)胞有關(guān)的基質(zhì)組分如I型膠原和某些形式的纖連蛋白上，其分裂緩慢，之后停止增殖，該過程同時(shí)伴隨著對肝細(xì)胞命運(yùn)的世系限制。肝祖細(xì)胞不能附著到纖連蛋白上或者不能在纖連蛋白上生存，那些確實(shí)附著的肝祖細(xì)胞則快速凋亡和死亡。但是，肝祖細(xì)胞產(chǎn)生后代的附著、生存和功能發(fā)揮需要有纖連蛋白存在。所以對細(xì)胞外基質(zhì)組分的具體類型或化學(xué)特性的要求具有世系依賴性，也就是說，這些需求與細(xì)胞的具體成熟階段相關(guān)。本發(fā)明的范圍不應(yīng)局限于任何一種基質(zhì)組分或其組合。與本文的教導(dǎo)一致，本發(fā)明描述和講解了任一種和所有細(xì)胞外基質(zhì)組分及其組合在形成能被用于維持體外細(xì)胞擴(kuò)增或分化的基質(zhì)方面的應(yīng)用。雖然這些組分中有許多會在下面討論，但為了闡述清楚，將以層粘連蛋白、IV型膠原和/或III型膠原作為從胚胎組織或肝細(xì)胞小生境中發(fā)現(xiàn)或高豐度存在于其中的一類細(xì)胞外基質(zhì)組分的代表例予以討論。胚胎基質(zhì)組分的非限制例包括特定類型的膠原，包括膠原IV型(進(jìn)一步包括al、a2、a3、a4、a5、a6)和膠原III型；層粘連蛋白(包括l、y1、(32、a3、a5);透明質(zhì)素；多種形式的硫酸軟骨素蛋白聚糖或其糖胺聚糖鏈；多種形式的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖或其糖胺聚糖鏈(如某些多配體蛋白聚糖)。從成熟組織中發(fā)現(xiàn)的基質(zhì)組分的非限制例包括穩(wěn)定形式的膠原(如i和n型)，多種形式的纖連蛋白；硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(如聚集素、串珠素)，肝素蛋白聚糖；皮膚素蛋白聚糖(如軟骨相關(guān)性硫酸皮膚素蛋白聚糖)和彈性蛋白。各種不同的細(xì)胞培養(yǎng)基都可以適用本發(fā)明。通過向培養(yǎng)基中添加或去除生長因子和/或分化因子，可以影響細(xì)胞的增殖和/或分化率。例如，添加血清，能減慢肝祖細(xì)胞的生長，引起對肝細(xì)胞命運(yùn)的世系限制，以及引起間充質(zhì)細(xì)胞群(基質(zhì)和內(nèi)皮)的快速擴(kuò)增。添加表皮生長因子會導(dǎo)致對肝細(xì)胞命運(yùn)的世系限制。優(yōu)選地，在有些實(shí)施例中，本文所述基質(zhì)組分與不含血清的培養(yǎng)基聯(lián)合使用?，F(xiàn)已研發(fā)出成肝細(xì)胞用的不含血清的培養(yǎng)基，見美國專利申請09/678,953所述，該申請公開內(nèi)容整體并入本文。目前認(rèn)為但不受理論限制，本發(fā)明的基質(zhì)組分提供了許多通常由詞養(yǎng)細(xì)胞提供的生存、生長和/或增殖信號。所以，本發(fā)明在相當(dāng)大程度上可以替代為維持肝祖細(xì)胞的活力和擴(kuò)增潛能而使用胚胎基質(zhì)飼養(yǎng)細(xì)胞的需求。下面通過非限制性例子對本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例進(jìn)行描述。實(shí)施例培養(yǎng)基與緩沖液除非另外說明，處理肝臟組織和維持細(xì)胞培養(yǎng)的過程中均使用不含血清的培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基含有500ml添加了0.1%牛血清白蛋白(第五組分)的RPMI1640、10ng/ml牛holo-轉(zhuǎn)鐵蛋白(飽和鐵)、5|ig/ml胰島素、500^1硒、5mlL-谷氨酰胺、270mg煙酰胺、5mlAAS抗生素、500^1氫化可的松、1.75^12-巰基乙醇和38^1按已公布的美國專利申請09/678,953所述制備的游離脂肪酸混合物。將此培養(yǎng)基滅菌，使用前調(diào)節(jié)pH至7.4。"細(xì)胞洗滌緩沖液"含有添加了1%牛血清白蛋白的500mlRPM11640、50(Hd硒和5mlAAS抗生素。"酶消化緩沖液"含有100ml添加了60mgIV型膠原酶和30mgDNA酶(37。C溶解)的細(xì)胞洗滌緩沖液。組織獲取與制備從認(rèn)證機(jī)構(gòu)如美國加利福尼亞州阿拉米達(dá)高等生物科學(xué)資源所(AdvancedBiosciencesResourcesofAlameda)獲取16-22周孕齡之間的人胚胎的肝臟組織。理想的是，組織在被分離后18小時(shí)內(nèi)被接收并抵達(dá)，用作多個(gè)組織部分或者偶爾用作適度完整的肝臟。一般來說，整個(gè)組織的體積約為4-12ml，含有大量紅血細(xì)胞(RBCs)。用機(jī)械法將肝臟解離，再用酶消化緩沖液對組織進(jìn)行部分消化，產(chǎn)生實(shí)質(zhì)細(xì)胞團(tuán)。洗滌這些細(xì)胞團(tuán)、低速離心，以便基本上去除游離漂浮的造血細(xì)胞，但保留肝實(shí)質(zhì)。然后將解離后的肝分割成每份3ml，每份中加入25ml酶消化緩沖液。32°C，溫和攪拌30分鐘后，倒掉上清液，存放在4"C。再用新鮮的酶消化緩沖液對剩余的沒有變成碎片的團(tuán)塊另外消化30分鐘。對組織碎片進(jìn)行的酶消化過程結(jié)束后，在250旋轉(zhuǎn)離心力(RCF)下將細(xì)胞懸浮液離心；倒掉上清液；將離心團(tuán)塊重懸在等量的細(xì)胞洗滌緩沖液中。分離技術(shù)取自胎兒肝臟的肝細(xì)胞懸浮液中充滿造血細(xì)胞，尤其是紅系細(xì)胞。事實(shí)上，人胎兒肝臟的初始細(xì)胞懸浮液平均由僅6-9%的實(shí)質(zhì)細(xì)胞和其余為各種不同的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞尤其是紅系細(xì)胞組成。由于去除紅系細(xì)胞的常規(guī)方法如使用裂解緩沖液可能對肝祖細(xì)胞有毒性，所以最好選用其他方法。例如，使用已經(jīng)公布的方法(Lilja等人，1997;Lilja等人，1998)經(jīng)過反復(fù)低速離心，可以將紅系細(xì)胞和實(shí)質(zhì)細(xì)胞分開?？梢允褂昧硗庖环N更有效的方法一一補(bǔ)體介導(dǎo)細(xì)胞毒性法，使候選干細(xì)胞的損失降低到最小程度。用膠原酶消化后，將抗人紅血細(xì)胞(RBC)抗體用所述細(xì)胞懸浮液(1:5000稀釋)在37。C溫育15分鐘。為了刺穿并裂解抗體標(biāo)記的紅細(xì)胞，加入補(bǔ)體(如LowTox豚鼠補(bǔ)體)(1:3000稀釋)，在37'C溫育10分鐘。由于紅細(xì)胞釋放出血紅蛋白，所以細(xì)胞上清液會變成淡粉紅色。造血細(xì)胞被去除后，懸浮液由至少80-90%的實(shí)質(zhì)細(xì)胞組成。將除去造血細(xì)胞后得到的懸浮液再用新鮮膠原酶溶液進(jìn)行30分鐘的第二輪酶消化，以最大程度的減小細(xì)胞團(tuán)塊，之后用75iim尼龍篩過篩。用臺盼藍(lán)排除法估測細(xì)胞活力，其活力常規(guī)在95%以上。過濾后，肉眼觀察到，大多數(shù)成肝細(xì)胞呈細(xì)胞團(tuán)塊，每個(gè)聚集團(tuán)含4-8個(gè)細(xì)胞。這些技術(shù)組合有助于形成基本上不含紅血細(xì)胞但富含實(shí)質(zhì)肝細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液。進(jìn)一步的富集方案包括Ficoll分離法(FicollFractionation),用于分離成肝細(xì)胞。簡單來說就是，將細(xì)胞懸浮在10ml不含苯酚紅的基本培養(yǎng)基中，然后覆蓋在50ml離心管內(nèi)等體積的分離介質(zhì)Ficoll-Paque(AmershamPharmacia)上方。1000Xg離心25分鐘。收集分界面細(xì)胞和成團(tuán)細(xì)胞。Ficoll分離法得到的團(tuán)塊中實(shí)質(zhì)細(xì)胞一般占80%以上，這些細(xì)胞基本上都是成肝細(xì)胞，界面中含13-14%的初始細(xì)胞群，其抗原特性各異，說明存在實(shí)質(zhì)細(xì)胞、造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。Fico11分界面細(xì)胞得到0.1%的管板細(xì)胞集落，其數(shù)量比初始細(xì)胞懸浮液中的管板細(xì)胞增加10倍。雖然用Ficoll分離法分離成肝細(xì)胞時(shí)每次得到的結(jié)果可能是一致的，但是用該方法分離干細(xì)胞時(shí)每次制備得到的結(jié)果往往變化較大。免疫選擇技術(shù)是另一種富集和/或分離肝干細(xì)胞(管板細(xì)胞)或其他亞群的技術(shù)。免疫選擇方案中使用在細(xì)胞上強(qiáng)表達(dá)的抗原(如所有肝祖細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的EpCAM)和一個(gè)肝祖細(xì)胞亞群上的其他抗原(如管板細(xì)胞上的NCAM)是比較理想的。免疫選擇技術(shù)可以采用這些程序所適用的各種不同方法中的任一方法進(jìn)行，可以采用細(xì)胞儀、親合板粘附或磁珠。磁性免疫選擇法包括細(xì)胞表達(dá)的分離，例如使用與磁性微珠結(jié)合的單克隆抗體HEA125禾nMiltenyiBiotec公司(德國BergischGladbach)的autoMACSTM或CliniMACS⑧磁性柱分離系統(tǒng)，按照生產(chǎn)商推薦的操作方案，從人肝細(xì)胞懸浮液中分離EpCAM。NCAM、CD146、KDR(VEGFr)和CD133/1細(xì)胞的免疫選擇方法與之類似。試驗(yàn)所有進(jìn)行的試驗(yàn)中，均使用6孔平皿，每個(gè)孔接種0.8X106個(gè)實(shí)質(zhì)細(xì)胞。在接種開始后的第一個(gè)IO小時(shí)，向培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清。一般認(rèn)為，在起始鋪板期間添加血清，會促使組織消化所用的酶失活，而且對初始的附著有幫助。之后，只使用不含血清的培養(yǎng)基。通常每隔24小時(shí)更換一次培養(yǎng)基，有些情況下，隔3天更換一次培養(yǎng)基。除非另外說明，實(shí)驗(yàn)值均通過標(biāo)準(zhǔn)化換算為營養(yǎng)培養(yǎng)基體積和細(xì)胞數(shù)。基于尿素能與二乙酰一肟直接相互作用的原理進(jìn)行試驗(yàn)，以確定所收集的培養(yǎng)基樣品的尿素濃度。診斷試劑盒用的標(biāo)準(zhǔn)和試劑從Sigma公司購買。對這些試劑盒進(jìn)行調(diào)整以適應(yīng)96孔微板的使用。首先制備稀釋后的濃度標(biāo)準(zhǔn)。使用系列稀釋，減小標(biāo)準(zhǔn)濃度，使標(biāo)準(zhǔn)范圍在0-30.76mg/dL之間。然后將血-尿素-氮(bun)酸性試劑和bun顯色劑按1.3:1.0混合，制成混合試劑。本試驗(yàn)方案包括先往各微板孔內(nèi)加9ml合適的樣品(如空白、標(biāo)準(zhǔn)或樣品)，再加100ml混合試劑。50°C，溫育大約25分鐘或者溫育到在濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)看到明顯的標(biāo)準(zhǔn)顏色變化為止。然后將微板底物置于冰上冷卻3分鐘。冷卻之后立即使用CytoFluor多孔細(xì)胞計(jì)數(shù)儀在535nm測定光密度變化。氨-叫根據(jù)NH3能與溴酚藍(lán)(氨指示劑)發(fā)生反應(yīng)的原理進(jìn)行比色試驗(yàn)，使用VITROSDT60II化學(xué)系統(tǒng)(Ortho-ClinicalDiagnostics,RochesterNY)進(jìn)行試驗(yàn)分析。該自動(dòng)過程需要10|il樣品、5分鐘溫育時(shí)間、37'C環(huán)境室和605nm吸收測定管。置于該化學(xué)分析儀內(nèi)部后，玻片上標(biāo)示出光密度變化，并且相對預(yù)先校準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)示出所在位置。VITROSDT60II化學(xué)系統(tǒng)使用的是雙反應(yīng)序列。首先，葡萄糖氧化酶催化樣品葡萄糖氧化形成H202。然后過氧化氫酶在染料前體存在條件下催化氧化偶聯(lián)，其中，用反射光測定染料濃度。各個(gè)試驗(yàn)包括先在各化學(xué)玻片上滴加10pl合適的樣品(如空白、標(biāo)準(zhǔn)或樣品)。置于該化學(xué)分析儀內(nèi)部后，玻片上標(biāo)示出光密度變化，并且相對預(yù)先校準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)示出所在位置。免疫染色用乙酮/甲醇(50/50)混合物將培養(yǎng)物固定，持續(xù)2分鐘，再用1XPBS洗滌，10%山羊血清封閉45分鐘。之后進(jìn)行細(xì)胞免疫染色。加入標(biāo)記熒光探針的人第一抗體，室溫下處理l-8小時(shí)。使用未標(biāo)記的第一抗體時(shí)，則用標(biāo)記熒光探針的第二抗體進(jìn)行細(xì)胞染色。增殖使用放大倍數(shù)為4X、10X和20X的相差顯微術(shù)，通過集落生長大小變化成像來評估肝袓細(xì)胞的增殖情況；使用低倍物鏡，可以觀察到全部集落。對集落重復(fù)成像，并相對預(yù)先在統(tǒng)計(jì)比較分析所用MetaMorph圖像處理軟件上校準(zhǔn)的已知尺寸對顯微圖片進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，獲得生長曲線。組織培養(yǎng)基質(zhì)的制備對照研究包括將人胎兒肝細(xì)胞直接接種到組織培養(yǎng)塑料(TCP)上(圖1A)。制備3個(gè)不同濃度(0.5、1.0或2嗎/cm2)的纖連蛋白平板，將pH調(diào)節(jié)到7.5。制備膠原I型平板，濃度l-1.5mg/ml。制備過程中，按特定比例加入10XDMEM禾B0.1MNaOH，將高密度Vitrogen100(CohesionTechnologies,PaloAlto,CA)變成液態(tài)膠原I型。更具體點(diǎn)說，圖IB所示為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，該實(shí)施例中，將0.25ml0.1MNaOH、0.25ml10XDMEM或PBS、1.5mg/mlVitrogen100加到一起，在4'C輕輕地混合成均質(zhì)溶液?；旌线^程中，最好避免將氣泡混入新形成的膠原I型懸浮液內(nèi)，因?yàn)榭諝忾g隙能破壞膠原的穩(wěn)定性。將該膠原I懸浮液預(yù)先鋪在平皿孔表面，分別制備圖IC和1D所示的平板(FP)和"三明治"式設(shè)計(jì)。平板制備中，向6孔板的每個(gè)孔內(nèi)加入0.4ml膠原I懸浮液。在37'C和5。/。C02條件下靜置1小時(shí)，讓膠原I懸浮液形成凝膠。然后準(zhǔn)備接收肝祖細(xì)胞。三明治板的制備可以和平板相同。但是，為了將細(xì)胞制成"三明治"，將第二層膠原懸浮液倒在表面上附著細(xì)胞的平板上。如平板一樣，在37"C和5%(:02條件下溫育1小時(shí)，以凝固成新的頂部膠原層。之后，加入0.5ml不含血清的培養(yǎng)基，用作營養(yǎng)支持。制備2個(gè)不同濃度(0.52或1.0|ig/cm2)的層粘連蛋白平板，pH調(diào)節(jié)到7.5。使用5個(gè)不同蛋白濃度(2.1、4.2、6.3、8.3或10.4嗎/cm2)中的1個(gè)濃度制備鋪在平皿上的膠原覆蓋層。鋪皿后，在37。C和5%C02下靜置10小時(shí)，使該基質(zhì)附著。鋪皿過程如圖2所示，其中基質(zhì)分子在醋酸緩沖液中和平皿內(nèi)不均勻地隨機(jī)分布。約10小時(shí)內(nèi)，這些基質(zhì)分子穩(wěn)定下來并以單一均勻陣列附著在孔表面上。UV滅菌2小時(shí)，1XPBS漂洗，使酸性pH中和。用pH3乙酸制備膠原III板，用0.5M乙酸制備膠原IV板，制備方法與上面類似。制備組合板時(shí)，將III型膠原和層粘連蛋白共同鋪在TCP表面上，它們各自的濃度分別為6.25嗎/cn^和0.52昭/cm2。將IV型膠原和層粘連蛋白共同鋪在TCP表面上，它們各自的濃度分別為4.2嗎/cm2和1.0嗎/cm2。肝干細(xì)胞區(qū)室中基質(zhì)組分的鑒定通過免疫組織化學(xué)技術(shù)對胎兒肝部分的肝細(xì)胞區(qū)室內(nèi)基質(zhì)組分進(jìn)行體內(nèi)鑒定，通過胚胎間充質(zhì)詞養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的基質(zhì)組分試驗(yàn)對肝細(xì)胞區(qū)室內(nèi)基質(zhì)組分進(jìn)行體外鑒定。使用成血管細(xì)胞(肝干細(xì)胞的自身間充質(zhì)搭檔)和鼠胚胎基質(zhì)飼養(yǎng)細(xì)胞(如STO細(xì)胞)作為這些實(shí)驗(yàn)的代表性細(xì)胞。如表I所示，該研究確定飼養(yǎng)細(xì)胞(如成血管細(xì)胞和STO飼養(yǎng)細(xì)胞)產(chǎn)生層粘連細(xì)胞、in型膠原和iv型膠原、透明質(zhì)素和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。注意，肝干細(xì)胞具有透明質(zhì)素(圖3)和己鑒定出的膠原的受體。表I<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>更詳細(xì)的比較研究見表II。表II<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表II中開展的調(diào)査描述了人肝干細(xì)胞的反應(yīng)情況，包括細(xì)胞附著、細(xì)胞生存、形成幾何形狀培養(yǎng)物、形成獨(dú)特集落、分裂率、免疫組織化學(xué)應(yīng)答，以及功能性葡萄糖和尿素產(chǎn)物。對于附著來說，當(dāng)在層粘連蛋白或III型或IV型膠原或成體基質(zhì)I型膠原上培養(yǎng)時(shí)，人肝干細(xì)胞引起細(xì)胞基質(zhì)間的相互作用。在所研究的基質(zhì)中，僅層粘連蛋白上的附著力最小。另外，層粘連蛋白促進(jìn)少量附著細(xì)胞快速凋亡，所以除層粘連蛋白外，其他所有基質(zhì)底層上培養(yǎng)的細(xì)胞生存時(shí)間超過10天。值得注意的是，成熟實(shí)質(zhì)細(xì)胞的附著、生存和發(fā)揮功能需要有纖連蛋白存在。接著觀察形成的培養(yǎng)物幾何形狀。層粘連蛋白和纖連蛋白誘導(dǎo)形成3D橢球狀聚集體，而其他基層誘導(dǎo)形成單層細(xì)胞。另外觀察到覆在層粘連蛋白、in型膠原和iv型膠原上的細(xì)胞出現(xiàn)克隆原擴(kuò)增，而在I型膠原和纖連蛋白上分別觀察到形成集落或無生長。III型膠原使分裂率約小于24小時(shí)，而接種在I型膠原上的細(xì)胞生長緩慢，然后進(jìn)入生長停滯期，之后保持細(xì)胞活力和功能。還對白蛋白(ALB)、細(xì)胞角蛋白(CK19)、a-胎蛋白(AFP)、E-鈣粘著蛋白(E-CAD)、上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)、神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(NCAM)和細(xì)胞角蛋白8和18(CK8禾tl18)的免疫組織化學(xué)應(yīng)答做了比較。最主要和活躍的應(yīng)答表現(xiàn)為NCAM(+)、EpCAM(++)、ALB(+)禾卩CK8和CK18(+)。有趣的是，CK19由層粘連蛋白、III型膠原和IV型膠原上培養(yǎng)的肝細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)，但覆蓋在I型膠原和纖連蛋白上的細(xì)胞則不表達(dá)，表現(xiàn)為陰性。這一發(fā)現(xiàn)暗示，早期的雙潛能(bipotent)活性受到成熟組織中富含的基質(zhì)組分的世系限制。而且，膠原I上培養(yǎng)的細(xì)胞的高AFP和ALB活動(dòng)說明實(shí)質(zhì)細(xì)胞對定向肝祖細(xì)胞進(jìn)行世系限制，葡萄糖和尿素產(chǎn)物的強(qiáng)表達(dá)數(shù)據(jù)證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)。接著通過一項(xiàng)為期31天的定時(shí)研究，從直接覆蓋在TCP表面的肝祖細(xì)胞轉(zhuǎn)向人成肝細(xì)胞和肝干細(xì)胞及相關(guān)間充質(zhì)細(xì)胞搭檔的形態(tài)學(xué)特征。第0天，肝細(xì)胞均勻分布在TCP表面上。最初的成肝細(xì)胞(h)群以橢球狀團(tuán)塊形式存在，含有3-8個(gè)成肝細(xì)胞(i)，但也發(fā)現(xiàn)存在單個(gè)細(xì)胞(T)，如圖4A中20X顯微圖片所示。這張圖中，成肝細(xì)胞的平均直徑確定為約10-12|im，而直徑小于約10iam的小一些的細(xì)胞被認(rèn)為是間充質(zhì)細(xì)胞、殘余的RBCs或肝干細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)物沒有匯集到一起，而是形成多個(gè)各不相同的橢球狀聚集體，附著在表面上。培養(yǎng)到第5天，殘余的RBCs脫離TCP表面，發(fā)生死亡。剩下的細(xì)胞群中大多數(shù)為成肝細(xì)胞和各種不同的間充質(zhì)細(xì)胞(mes)，它們穩(wěn)定下來，形成各自如圖4B所示的形態(tài)。這一穩(wěn)定過程促使成肝細(xì)胞(h)培養(yǎng)物匯集到一起，證明成肝細(xì)胞群被鋪展開，開始發(fā)生細(xì)胞-細(xì)胞接觸。而且，成肝細(xì)胞保留了良好的細(xì)胞差異，具有清晰的膜輪廓和平滑的細(xì)胞質(zhì)特征。另外，成肝細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞類型之間的共培養(yǎng)相互作用有限，它們之間的共同邊界較少而且離散。培養(yǎng)到第15天(圖4C)，成肝細(xì)胞具有"顆粒"狀細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)特征，符合衰退細(xì)胞的特征。另外，成肝細(xì)胞與間充質(zhì)細(xì)胞之間的比例達(dá)到相等，這暗示隨著成肝細(xì)胞的消除，非實(shí)質(zhì)細(xì)胞正占據(jù)著更大的表面區(qū)域。這一發(fā)現(xiàn)與"成纖細(xì)胞過生長"的典型現(xiàn)象類似，甚至培養(yǎng)基中未添加血清亦是如此。這些變化說明TCP培養(yǎng)條件有利于間充質(zhì)細(xì)胞擴(kuò)增，而對成肝細(xì)胞增殖和生存不利。的確，第31天，由于間充質(zhì)細(xì)胞完全覆蓋了培養(yǎng)表面，所以成肝細(xì)胞要么死亡，要么重新組織，形成腳手架(scaffolding),如圖4D中20X顯微圖片所示。接下來比較僅在TCP上培養(yǎng)和在FP或三明治式I型膠原凝膠上培養(yǎng)的人肝祖細(xì)胞。第10天的培養(yǎng)狀況如圖5所示。就圖4A所示的"TCP上細(xì)胞"的培養(yǎng)對照來說，成肝細(xì)胞(h)顯現(xiàn)出顆粒狀細(xì)胞質(zhì)特征，沒有明顯的細(xì)胞邊界。另外，間充質(zhì)細(xì)胞(mcs)(大多為內(nèi)皮和基質(zhì))環(huán)繞在成肝細(xì)胞集落周圍。成肝細(xì)胞在塑料上的外觀與同時(shí)在膠原I型(FP)上培養(yǎng)(圖5B)的成肝細(xì)胞的外觀截然不同。后一成肝細(xì)胞顯現(xiàn)出確定的細(xì)胞邊界和顆粒狀細(xì)胞質(zhì)——穩(wěn)定成肝細(xì)胞的特征。另外，間充質(zhì)細(xì)胞顯現(xiàn)出有限的增殖，但也保留了明顯的細(xì)胞邊界特征。使用圖4C所示三明治式設(shè)計(jì)培養(yǎng)的成肝細(xì)胞證實(shí)了所引起的細(xì)胞-細(xì)胞接觸、確定的細(xì)胞邊界，以及肝細(xì)胞和膽囊功能的雙表達(dá)(從對白蛋白(紅色)和CK19(綠色)表達(dá)進(jìn)行的免疫染色中得到證實(shí))。這些結(jié)果說明該祖細(xì)胞群中雙潛能的穩(wěn)定性(stabilizationofbipotency)。尿素由成熟肝細(xì)胞特異產(chǎn)生。所以，可以用尿素表達(dá)來指示組織特異性基因表達(dá)和分化的顯著程度。因此，為了研究未成熟肝細(xì)胞的分化程度與體外基質(zhì)蛋白質(zhì)的函數(shù)關(guān)系，在培養(yǎng)若干小時(shí)后，確定培養(yǎng)基中的尿素濃度。圖6顯示了在胚胎和胎兒肝組織中主要的細(xì)胞外基質(zhì)上培養(yǎng)的成肝細(xì)胞。這些體內(nèi)基質(zhì)的一部分包括III型膠原(■)、IV型膠原(參)、層粘連蛋白(〇)和膠原IV-層粘連蛋白混合物(▽)，相對于TCP對照(▼)，對這些基質(zhì)進(jìn)行分析和比較。為進(jìn)行尿素分析，對成肝細(xì)胞監(jiān)控l-5天，其標(biāo)準(zhǔn)化的尿素結(jié)果標(biāo)于縱軸上?？傮w上，TCP上的對照細(xì)胞(▼)在整個(gè)研究期間的活力較差——最大和最小尿素濃度為5.5X10—6禾卩1.5X10—6mg/dL。更具體一點(diǎn)說，第1天，接種到"膠原IV"或"膠原IV和層粘連蛋白"上的成肝細(xì)胞達(dá)到9.5Xl(^mg/dL的尿素水平時(shí)，立刻觀察到區(qū)別；所有試驗(yàn)的其他培養(yǎng)產(chǎn)生的尿素水平接近5.3Xl(T6mg/dL——或在高度活躍的和固定附著的成肝細(xì)胞之間有56%的偏差。除了接種在"膠原IV和層粘連蛋白"上的成肝細(xì)胞顯現(xiàn)出尿素功能有輕微下降的跡象外，第1天和第2天的結(jié)果之間沒有注意到有變化。但到了第3天，IV型膠原(參)培養(yǎng)物顯露出最佳的尿素功能活性，其達(dá)到1.2X10—5mg/dL，而其他培養(yǎng)物表達(dá)的尿素水平量低33%。到第5天，所有尿素水平并入2X10—6mg/dL的最小尿素表達(dá)水平，這暗示培養(yǎng)基中氨被耗盡，因?yàn)槟蛩乇磉_(dá)需要氨因子的參與。尿素產(chǎn)量用尿素濃度/細(xì)胞表示(圖6B)。這些圖表示經(jīng)過24小時(shí)以后的尿素濃度，在所做的標(biāo)記中，實(shí)心黑圈()數(shù)據(jù)點(diǎn)表示TCP上的成肝細(xì)胞(對照)，實(shí)心白圈(〇)數(shù)據(jù)點(diǎn)表示來自接種在I型膠原(平板，F(xiàn)P)上的培養(yǎng)物中的成肝細(xì)胞，灰色三角形(A)數(shù)據(jù)點(diǎn)分別表示在I型膠原層間(三明治式設(shè)計(jì))培養(yǎng)的成肝細(xì)胞。這樣，在第3-6天對培養(yǎng)物進(jìn)行定時(shí)評估。如各系統(tǒng)所示，第3天尿素濃度水平較高，但在整個(gè)研究期間其水平卻在連續(xù)下降。還注意到，整個(gè)研究期間，對照中的尿素水平相對較低。在FP和三明治結(jié)構(gòu)中培養(yǎng)的成肝細(xì)胞的活性類似，在第3天和第4天，分別為8.0Xl(T5mg/dL和5.0X10-6mg/dL。與培養(yǎng)塑料上的對照培養(yǎng)相比，這些值相當(dāng)于活性提高了約80%。同樣，平板系統(tǒng)顯示，在第5、6天，成肝細(xì)胞活性較高。根據(jù)顯示結(jié)果，成肝細(xì)胞FP活性比三明治式活性高出約8%，比TCP培養(yǎng)高出約115%。使用另外兩項(xiàng)試驗(yàn)比較接種在各種不同基質(zhì)上的細(xì)胞的功能活性。圖7分別繪出了第3天的葡萄糖和氨產(chǎn)量，該圖表示的是尿素日活性最高(圖6)的時(shí)間。圖7A中葡萄糖比較結(jié)果顯示，TCP培養(yǎng)對照所產(chǎn)生的葡萄糖水平為1.5X10—3mg/dL，用黑色實(shí)心框(■)表示，膠原I型FP培養(yǎng)產(chǎn)生的葡萄糖水平為1.63Xl(T3mg/dL，用白色實(shí)心框(□)表示，三明治式膠原I型培養(yǎng)產(chǎn)生的葡萄糖水平為2.6X10—3mg/dL，用實(shí)心灰色框表示。三明治式和TCP或FP培養(yǎng)之間的比較結(jié)果顯示，三明治式培養(yǎng)中的葡萄糖水平比其他細(xì)胞系統(tǒng)反應(yīng)高出約64%。圖7B顯示，TCP培養(yǎng)中積聚的氨濃度為4.5Xl(T3mmol/L，F(xiàn)P系統(tǒng)中為2.8X10-3mmol/L，三明治式膠原系統(tǒng)為2.6X10—3mmol/L。FP和三明治式培養(yǎng)中氨水平下降，對照中氨水平約多出60%。如圖8所示，成肝細(xì)胞展現(xiàn)出形態(tài)變化，其變化是由其基質(zhì)的幾何學(xué)控制的。圖8A1、8B1和8C1顯示的是培養(yǎng)到第10天的低倍圖像和整個(gè)表面特征。圖8A2、8B2禾Q8C2通過相同培養(yǎng)物的高倍圖像顯現(xiàn)出詳細(xì)的形態(tài)學(xué)差異。圖8A1中，平皿表面先鋪上6.25mg/cn^膠原III，然后接種胎兒肝細(xì)胞。第10天，大量相互連接的組織塊和粘著的凝膠狀基質(zhì)形成。另外，這一培養(yǎng)顯現(xiàn)出新近形成但隨機(jī)散布的脫細(xì)胞圓形亞群(subdivision)。為進(jìn)行更詳細(xì)的圖像分析，圖8A2的顯微圖片顯示了一部分圖8A1的放大圖。這一放大顯現(xiàn)出密集圖樣中的人成肝細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。為比較這種細(xì)胞環(huán)境作用，將肝細(xì)胞母液接種到覆蓋有0.52mg/cmS層粘連蛋白的平皿表面上培養(yǎng)，如8B1和8B2所示。圖8B1中，大量分段的"白色斑點(diǎn)"散布在整個(gè)接種表面。這些聚集體在圖8B2中確認(rèn)為緊密的橢球狀聚集體，其中橢球體伸長至與表面接觸。由于橢球體生長以及移動(dòng)培養(yǎng)基的力引起大的橢球體擺動(dòng)，所以許多表面附著鍵斷裂，細(xì)胞從培養(yǎng)物中被洗脫。但是，橢球體有可能移植到膠原I和膠原in基質(zhì)上，再次使細(xì)胞附著和進(jìn)一步鋪展開。為進(jìn)行細(xì)胞-基質(zhì)作用的第三次比較，將同樣的肝細(xì)胞置于預(yù)先分別鋪有6.25和0.52mg/cm1交原III-層粘連蛋白的平皿表面上培養(yǎng)。如圖8C1所示，使用白色背景，整個(gè)培養(yǎng)結(jié)果顯現(xiàn)出大量相互連接的組織團(tuán)。另外，還顯現(xiàn)出了不含組織和基質(zhì)組分的非均質(zhì)脫細(xì)胞區(qū)域。同樣，圖8C2顯現(xiàn)出有活性并且穩(wěn)定的共同培養(yǎng)的成肝細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞。大多數(shù)細(xì)胞是成肝細(xì)胞，它們呈"圓石塊"狀排列。另外觀察到實(shí)質(zhì)細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞搭檔之間的一些邊界的相互作用。使用由胚胎組織中富含的基質(zhì)(如層粘連蛋白和膠原ni和IV)制備的培養(yǎng)基，誘導(dǎo)成肝細(xì)胞的特定形態(tài)和功能變化，同時(shí)還進(jìn)行肝干細(xì)胞(HSC)的選擇(前體到成肝細(xì)胞)。圖9顯示了分別接種在TCP、層粘連蛋白、膠原III和膠原IV表面上、培養(yǎng)了3-10天的胎兒肝細(xì)胞的形態(tài)。將第3天的IOX圖像分別稱為TCP3、層粘連蛋白3、膠原III3和膠原IV3，而將第10天的4X圖像分別稱為TCPIO、層粘連蛋白10、膠原III10和膠原IV10。第3天對照TCP3集落顯現(xiàn)出大量成肝細(xì)胞(h)和少量非實(shí)質(zhì)細(xì)胞(np)。相對來說，層粘連蛋白上的第3天培養(yǎng)物主要由成肝細(xì)胞組成，但附著的細(xì)胞減少，鋪展開的細(xì)胞增多。相比而言，膠原III上的細(xì)胞選擇出肝干細(xì)胞?？梢钥吹礁胃杉?xì)胞集落是緊密聚集在一起的細(xì)胞，形態(tài)均一，倍增時(shí)間是1.2天。這些細(xì)胞具有HSC特異性抗原(如EpCAM+、NCAM+、白蛋白+、AFP-、CK19+、CK8+禾卩18+)的特征表達(dá)。另外，HSC集落細(xì)胞的特征直徑為7-9mm，其中細(xì)胞核占據(jù)了大部分細(xì)胞質(zhì)。集落細(xì)胞在大約第3天發(fā)生實(shí)質(zhì)化并且仍然被成肝細(xì)胞包圍。接種在膠原IV上的肝細(xì)胞也在整個(gè)培養(yǎng)面展現(xiàn)出許多成肝細(xì)胞，同時(shí)兩個(gè)小HSC集落開始形成。第10天拍攝第IO天結(jié)果的顯微照片，放大4X，以便使某些HSC集落整體被攝入照片內(nèi)。TCP10對照培養(yǎng)中，小HSC集落形成并且仍然被大量成肝細(xì)胞包圍。這一小集落獲得清晰的中間凸起、外部厚實(shí)的脊。層粘連蛋白IO培養(yǎng)中，成肝細(xì)胞聚集成小的緊密成團(tuán)的聚集體，在小直徑集落內(nèi)形成具有球形排列的三維結(jié)構(gòu)和厚的組織層。膠原III10培養(yǎng)物中含有大量"平坦并伸展開"的HSC集落，維持緊密聚集的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用，表面上排除其他類型細(xì)胞的存在。在所示顯微照片中，HSC增殖集落之間沒有見到成肝細(xì)胞。最后，膠原IVIO培養(yǎng)物同時(shí)含有成肝細(xì)胞和新出現(xiàn)的HSC集落，該集落具有明顯的集落邊界和高出來的邊界脊。對HSC集落進(jìn)一步詳細(xì)研究，如圖IO所示。這些圖中，附著基質(zhì)為膠原IV，鋪皿濃度為4.15嗎/cm2，在第12天給肝干細(xì)胞集落拍照。如圖所示，在這一集落附近或顯微照片的其他位置沒有觀察到其他細(xì)胞表型。所以，這一環(huán)境可以認(rèn)為是對特定類型細(xì)胞的選擇。在得到如圖10A所示的IOX顯微照片之前的第4-11天，用肉眼監(jiān)控HSC集落。這一時(shí)段中，緊密的HSCs從少于約IO個(gè)細(xì)胞的小聚集體開始，增殖成更大的集落，其中含有成百上千的細(xì)胞，見圖10A中標(biāo)出的突出圓形區(qū)域內(nèi)所示。但在第12天的8小時(shí)時(shí)段內(nèi)，增殖細(xì)胞在HSC集落邊緣發(fā)生兩個(gè)顯著的"爆發(fā)"或過度生長，導(dǎo)致細(xì)胞具有成肝細(xì)胞特有的抗原和形態(tài)特征。這些過度生長清楚可辨，是因?yàn)槠浞只?xì)胞松散聚集，具有較大直徑和明顯的溝(膽小管)。圖10B所示為20X顯微照片，聚焦中心在該過度生長的細(xì)胞上方。這張圖中，過度生長的肝袓細(xì)胞的直徑為15-21nm，細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核的比例增加，具有單一細(xì)胞核，發(fā)生細(xì)胞-細(xì)胞接觸，仍有確定的細(xì)胞邊界和細(xì)胞外基質(zhì)間隔。另外，從HSC集落發(fā)生的分化細(xì)胞的形態(tài)追蹤顯示，在擴(kuò)增開始的頭8小時(shí)期間，約有1200個(gè)新細(xì)胞。門靜脈周區(qū)內(nèi)和肝干細(xì)胞小生境中的基質(zhì)組分與所發(fā)現(xiàn)的成熟實(shí)質(zhì)細(xì)胞相關(guān)性基質(zhì)組分截然不同，并且引起人肝干/祖細(xì)胞的純化亞群發(fā)生不同的生物反應(yīng)。這些差異有可能提供改變細(xì)胞反應(yīng)和激活動(dòng)態(tài)表達(dá)的各種不同信號。明確不同種類的細(xì)胞外基質(zhì)組分在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)細(xì)胞活性的機(jī)理，可以在體外重現(xiàn)微環(huán)境以擴(kuò)增和分化HSC群，供病變組織的更換或再群體化(r印opulation)。這樣，通過移植細(xì)胞，可以避免將整個(gè)器官一起更換。而且，可以植入帶有包含在合適細(xì)胞外基質(zhì)和可溶性信號傳導(dǎo)環(huán)境中的肝祖細(xì)胞的體外裝置如生物反應(yīng)器，這些細(xì)胞生活在裝置亞區(qū)室中，具有活組織結(jié)構(gòu)。這樣，生物人工裝置可以被用于藥物學(xué)研究、疫苗開發(fā)，并且可用作器官衰竭和器官移植之間的橋梁。的確，這些研究所得結(jié)果暗示，使用這些細(xì)胞可以是一種改善細(xì)胞起源限制的方法，目前這些限制阻礙了細(xì)胞治療和生物反應(yīng)器裝置介導(dǎo)的治療選擇。雖然結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明加以描述，但應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明能夠被進(jìn)一步改動(dòng)，本申請欲涵蓋依照本發(fā)明原理作出的任何變化、用途或變更，其包括那些脫離本發(fā)明公開內(nèi)容，但屬于本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)的已知或公知常識，并且可以應(yīng)用于權(quán)利要求范圍所述的必要特征的內(nèi)容。權(quán)利要求1.一種使肝祖細(xì)胞在體外增殖的方法，其包括(a)提供分離出的肝祖細(xì)胞，以及(b)在從肝臟干細(xì)胞區(qū)室中發(fā)現(xiàn)的一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)組分上培養(yǎng)分離出的肝祖細(xì)胞。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述從肝臟干細(xì)胞區(qū)室中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞外基質(zhì)組分選自ni型膠原、iv型膠原、層粘連蛋白、透明質(zhì)素或其組合。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述從肝臟干細(xì)胞區(qū)室中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞外基質(zhì)組分是III型膠原或IV型膠原或其組合。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述肝祖細(xì)胞進(jìn)一步在選自m型膠原、基粘附分子、蛋白聚糖、糖胺聚糖硫酸乙酰肝素、彈性蛋白或其組合的細(xì)胞外基質(zhì)組分上培養(yǎng)。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述基粘附分子是纖連蛋白。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述蛋白聚糖是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、硫酸軟骨素蛋白聚糖或其組合。7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述糖胺聚糖是硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、透明質(zhì)素或其組合。8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述細(xì)胞外基質(zhì)組分是III型膠原和層粘連蛋白。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述分離出的肝祖細(xì)胞是分離出的肝干細(xì)胞、分離出的成肝細(xì)胞、定向肝祖細(xì)胞或其組合。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述分離出的肝祖細(xì)胞是分離出的肝干細(xì)胞。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在飼養(yǎng)細(xì)胞存在條件下進(jìn)一步培養(yǎng)所述肝祖細(xì)胞。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述飼養(yǎng)細(xì)胞是胚胎或胎兒的細(xì)胞。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述飼養(yǎng)細(xì)胞是成血管細(xì)胞或肝星狀前體細(xì)胞。14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述飼養(yǎng)細(xì)胞來自任何哺乳動(dòng)物的組織。15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述詞養(yǎng)細(xì)胞來自與所述肝祖細(xì)胞相同的細(xì)胞類群。16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述詞養(yǎng)細(xì)胞是鼠源細(xì)胞。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述飼養(yǎng)細(xì)胞是STO飼養(yǎng)細(xì)胞。18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包括不含血清的培養(yǎng)基。19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述肝祖細(xì)胞從成體肝臟中獲得。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述成體肝臟是成人的肝臟。21.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述層粘連蛋白的濃度約為0.1隱10jig/cm2。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述層粘連蛋白的濃度約為0.5-5嗎/cm2。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述層粘連蛋白的濃度約為0.5pg/cm2。24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述層粘連蛋白的濃度約為lpg/cm2。25.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述III型或IV型膠原的濃度各約為0.1-15fig/cm2。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述m型或IV型膠原的濃度各約為0.5-8嗎/cm2。27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述m型或IV型膠原的濃度約為l-7pg/cm2。28.—種使肝祖細(xì)胞增殖的方法，其包括(a)提供含有從肝臟的干細(xì)胞區(qū)室中發(fā)現(xiàn)的第一細(xì)胞外基質(zhì)組分的第一層；(b)提供含有從肝臟的干細(xì)胞區(qū)室中發(fā)現(xiàn)的第二細(xì)胞外基質(zhì)組分的第二層；以及(c)在上述第一層和第二層之間培養(yǎng)分離出的肝祖細(xì)胞。29.—種用于肝祖細(xì)胞增殖的器皿，其包括(a)器皿，以及(b)含有在肝臟的干細(xì)胞區(qū)室中發(fā)現(xiàn)的至少一種細(xì)胞外基質(zhì)組分的非可溶性材料，其中，該非可溶性材料基本上覆蓋上述器皿的至少一個(gè)表面。30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的器皿，其中，所述器皿是組織培養(yǎng)板、生物反應(yīng)器、實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)池或?qū)嶒?yàn)室芯片。全文摘要本發(fā)明提供了一種使肝祖細(xì)胞在從肝臟的干細(xì)胞區(qū)室或小生境中發(fā)現(xiàn)的一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)組分上或其內(nèi)部體外增殖的方法。本發(fā)明還提供了用于祖細(xì)胞增殖的器皿，其包括培養(yǎng)皿、生物反應(yīng)器或?qū)嶒?yàn)室芯片。文檔編號C12N5/074GK101384705SQ200680050921公開日2009年3月11日申請日期2006年11月15日優(yōu)先權(quán)日2005年11月16日發(fā)明者蘭德爾·E·麥克萊蘭,洛拉·M·里德申請人:北卡羅來納大學(xué)教堂山分校