專利名稱：將細菌固化至地質(zhì)材料的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于將材料中的，尤其是地質(zhì)體中的細菌固化的方法。
背景技術：
眾所周知，特定的自然存在的細菌在自然環(huán)境中可引發(fā)生物礦
化?；谶@種認識，Nemati和Voordauw在Enzyme and Microbial Technology 33(2003) ， 635-642頁中已經(jīng)描述了利用纟田菌脲酶 (bacterial urease )修飾多孑L介質(zhì)。
已經(jīng)考慮到可以使用細菌而不需要將脲酶從細菌中分離出。
美國專利5,143,155涉及通過礦物沉降而降低地下地質(zhì)形成物 (geological formation )的;參透'1"生的一種方》去，包4舌向it形成4勿4是供 在該形成物的環(huán)境內(nèi)具有維持代謝活性能力的^f效生物培養(yǎng)物、向該 形成物中注入含 K的石/M匕介質(zhì)(mineralisation medium )、并4尋,/物 質(zhì)乂人該礦4b介質(zhì)中沉淀。
其沒有教導通過絮凝作用固化該組成中的細菌，也沒有教導在 細菌固化作用后應用加入礦化介質(zhì)的附加的步驟。 本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，僅通過使例如細菌微生物以及基質(zhì)
(substrate)流經(jīng)待處理的材料無法獲得令人滿意的結果。特別是， 由于形成于被處理材料(土壤)外側的顆粒趨向于發(fā)生堵塞。結果， 該材料失去了對于基質(zhì)及細菌的滲透性。
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，以 一種特定的方式將材料中的細菌固化是 可能的，從而可以-使用經(jīng)固化的細菌修飾(改性，modify)該材料， 尤其通過細菌可能形成礦物。
因此，本發(fā)明涉及用于固化在可滲透細菌的材料中，尤其是地 質(zhì)體中的細菌的一種方法，包;l舌
在材料中形成包括細菌的第一帶(區(qū)域，zone)并且使該第一 帶移動穿過至少部分的材料；形成包括有效量的絮凝劑的第二帶到 該材料并使該第二帶移動穿過至少部分的材料，
其中，使這些帶可以這才羊運動，即這些帶至少部分;也重疊，并 且至少部分的細菌絮凝，從而成為固化。
可以經(jīng)常重復以上步艱《一次或多次以增加^皮固^f匕的細菌的量 (從而增力o每體積、才才并牛的細菌活'〖生(bacterial activity ))。
人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過4艮據(jù)本發(fā)明的方法，通過允許細菌原位形 成礦物，在避免材料中的孔堵塞時，可以一種可控的方式增強材料。 因此，在該材料的較長距離上，可以有效地實現(xiàn)原位的礦物沉積。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，才艮據(jù)本發(fā)明的 一種方法有效地固化細菌從而增強它 們進4亍材^H修飾活性(modifying activity)的有效性。特別是，已
經(jīng)發(fā)現(xiàn)，相對于才才沖牛中細菌的生物礦化作用，固(immobilisation )
尤其有利。
才艮據(jù)本發(fā)明的一種方法可尤其用于土木工程或采礦。它可用于 修飾土壤或另外的地質(zhì)形成物，尤其用于穩(wěn)定和/或強化材料。已經(jīng) 發(fā)現(xiàn)在保持諸如地質(zhì)體的材料的滿意的孔隙率的同時，上述是可能 的，以允許在長距離上處理材料。


圖1示出了多種絮凝劑對于引起懸浮液中細菌絮凝的有效性。
圖2示出了通過移動穿過材料的兩個帶的分布圖。
圖3示出了在石少礫、(sand)材料中經(jīng)固化的細菌的位置。
圖4示出了在細菌固化后，材料中不同位置的脲酶活性。
圖5示出了碳酸鈣的形成物對于材料的孔隙率的影響，其中細 菌4皮固4匕。
圖6示出了由于所加入的4丐離子的功能對4丐的吸附的影響。
圖7示出了氯化鈣的濃度對于細菌絮凝物的尺寸的影響。
原則上，可以使用任何可滲透細菌的材料(即，任何具有足夠 大孔隙，以-使細菌至少在壓力下可以通過該孔隙的材并牛)。在需要 4吏用細菌用于原位活動(activity)諸如生物礦化時，該材沖+通常也 應該對于這樣的活性(離子)的基質(zhì)也是可滲透的。在本發(fā)明的方 法中所使用的材料通常是地質(zhì)形成物或礦物材料。地質(zhì)形成物可以 特別是一種個體，包括沉積物(粘土、粉粒、沙礫、和/或礫石)、沉 積巖、土壤材料和/或具有滲透性的巖石材料例如裂隙巖。優(yōu)選的材
泮牛包4舌選自由賴—立、粘土 、沙石樂以及石樂石體(gravel body )構成的 組的材料。用沙礫尤其取得了良好的結果。
原則上，該法適用于固化能夠與合適的絮凝劑尤其是與二價陽 離子絮凝的任何細菌。尤其地，根據(jù)本發(fā)明使用的術語"細菌"為 才直物性細菌(vegetative bacteria),而不是孑包子。與通常為4木目民態(tài)的 孢子相比，(植物性)細菌通常顯示了增加的代i射活性。應用(植 物性)細菌通常比(僅)應用孢子更有利是由于這樣一個事實，即 細菌已經(jīng)是活性的(active)(而孢子首先需要經(jīng)歷使孢子生長的條 件)和/或細菌可以更容易地絮凝。已經(jīng)考慮到由于尺寸差異、細胞 壁結構差異(例如，離子化基團的存在)和/或(植物性)細菌產(chǎn)生 一種或多種化合物，尤其是胞外多糖(exopolysaccharide )的能力， 其與絮凝劑接觸時能夠有助于絮凝，(植物性)細菌更易于絮凝， 或至少在不同條件下絮凝。因此，優(yōu)選地，將能夠產(chǎn)生胞外多糖的 (植物性)細菌應用于材料中。
該細菌優(yōu)選地選自能夠形成諸如CaC03的礦物質(zhì)的細菌。優(yōu)選 地，該細菌選自由產(chǎn)生脲酶的細菌構成的組，更優(yōu)選地，選自由芽 孑包八疊球菌屬(尤其是巴氏芽孑包八疊球菌屬5^omswc/"a/7as^e,7 ) 構成的組。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這沖羊的細菌尤其有效，因為它們的脲酶顯示了 良好的活性，在銨的存在下(在生物礦化過程中形成)也一樣。
通常以至少0.1 mS/min的濃度將細菌力口入材泮+中，優(yōu)選為0.1 mS/min至1.0 mS/min，更^尤選為0.5mS/min。對于高細菌活性(i者 ^口力口入基質(zhì)后的高生物石/M匕率(biominemlisation rate ) )， 4尤選以至 少0.3 mS/min的濃度加入細菌，(通過在20。C時(在水中)細菌加 入到1 M脲(尿素，urea)時所產(chǎn)生的電導率的相對變化來確定)。
在現(xiàn)有條件下能夠有效地引發(fā)細菌絮凝的任何試劑都可以用 作絮凝劑。特別適用的為多價陽離子，特別是二價陽離子。特別地，
這種陽離子可以用于固化產(chǎn)脲酶細菌，i者如芽^包/乂疊^求菌屬菌 (S/7orayflr">2" 6"cfe〃'")。應i玄注意到，與(才直凈勿寸生)纟田菌坤目比，在 存在這樣的陽離子的條件下，孢子通常不發(fā)生絮凝。
考慮到，根據(jù)本發(fā)明，絮凝物(flocs)的形成至少主要是細菌 與陽離子(諸如4丐)共同相互作用(離子表面相互作用)的結果， 而不是包括陽離子(諸如碳酸鈣鹽)的經(jīng)沉淀的礦物質(zhì)的結果。這 種》見點是以4吏用2MHC1處理絮凝物的多個試-瞼為基礎的。沒有氣 體(C02)析出(evolved )。
優(yōu)選地，該二價陽離子選自由鎳離子、鋅離子、鎂離子、以及 鈣離子構成的組。尤其優(yōu)選鎂離子及鈣離子，這是由于它們對于絮 凝的較大的效果(同樣參見圖1 )。
有效量的絮凝劑可通過經(jīng)驗確定。通常，尤其對于二價陽離子， 該濃度為至少3 mM， 4尤選至少5 mM。具有相對大尺寸的絮凝物只于 于獲得細菌的4交強(strong)的固定是有利的，尤其在處理相對粗 糙的材料，諸如粗砂或礫石的情況下。因此，對于較強的固化，優(yōu) 選的〗吏用至少10 mM的濃度，特別地/使用至少20 mM的濃度。
通常，絮凝劑的濃度達到大約1000mM?？紤]到相對于細菌的 表面的吸附的效率(efficiency),該濃度^尤選達到100 mM。
此外，該細菌絮凝物的尺寸可通過選擇絮凝劑的濃度(參見圖 7)來設定。為了產(chǎn)生相對小的絮凝物，絮凝劑的濃度(特別是鈣) 優(yōu)選為50mM或更小，更優(yōu)選為40mM或更小?？紤]到避免堵塞， 尤其當材料是較細的沙礫、粘土或粉粒(silt)時，這是有利的。
引入并使它們穿過材料移動的已知的方法。參見WO 00/31209。
可通過利用液壓抽吸和/或動電地使這些帶移動。對于相對相4造 的材料諸如沙礫或具有至少相同平均粒度的材料，液壓抽吸是尤其 優(yōu)選的。對于相對一交^氐滲透性的材料諸如粘土或粉粒，動電遷移 (electrokinetic migration )是尤其優(yōu)選的。
在一種優(yōu)選的方法中，第二帶在第一帶形成后立刻形成，并且 可以4吏兩個帶以相同的方向移動(同時;也)穿過至少部分的才才泮+。 這可以首先將包4舌細菌的液體加入(例如通過注射)材并+中，并且 其后是包括絮凝劑的液體來相應地實現(xiàn)。由于微粒的特性(nature) 和/或細菌的表面電荷，細菌通常以低于絮凝劑的速度穿過材料移 動。因此，隨著兩個帶穿過材料移動，這些帶將(部分地)重疊并 且絮凝劑與細菌接觸，從而使細菌產(chǎn)生絮凝。這些絮凝物通常過大 以至不能移動穿過材料，從而被固化。圖2示出了在包括沙礫的柱 (column)中，細菌與包含絮凝劑的液體的懸浮液的速度的實例。 它例示出細菌比絮凝劑移動的更慢，并且?guī)в行跄齽┑膸?通過左 峰顯現(xiàn))與帶有細菌的帶(通過右峰呈現(xiàn))相混合。
本發(fā)明人考慮，通過使(植物性)細菌及絮凝劑在部分重疊的 各自的帶中移動，可以一種可控制的方式完成細菌的固化，乂人而在 一方面避免或至少降低了堵塞的風險(例如，與一種其中細菌和礦 化基質(zhì)在同一個帶中移動穿過材料的方法相比)和/或減少了完成預 期效果所需的細菌的數(shù)量(例如，將細菌或孢子提供于材料時，不 需要絮凝細菌或孢子，乂人而細菌或孢子^皮固化)。
方便地，例如，相對于控制絮凝過程，細菌與絮凝劑以相同方 向移動。
原則上，細菌與絮凝劑可以基本相對的方向朝彼此移動(例如，
4壬選電泳;也或動電i也與4由吸(pumping)組合4吏用)。
同樣通過以一個角度移動包含細菌的帶與包含絮凝劑的帶產(chǎn) 生混合是可能的，例如，細菌可以基本上水平運動而絮凝劑基本上 垂直或在相對于該細菌0至90。之間的角度下運動，或者反之亦然。 在需要在材料的一個局部(在所述兩個帶移動所沿路徑的交點處) 固化的情況下，這可能是有利的。
優(yōu)選地，在待處理的材料的一端加入含有細菌的液體，至少直 到在該材一+的相對端可4全測該細菌。4企測可通過在相對端監(jiān)控光密 度來沖目應的完成，侈'B口，在600nm處，通過顯孩i"i正實(microscopic verification)通過目測或另 一種本領域已知的技術。
優(yōu)選地，向材料中加入包含絮凝劑的液體，至少直到相對端可 才企測到絮凝劑或這種液體的另 一種組分。這可以由用于該待;險測成 分的適合的任何;險測技術來完成。監(jiān)控電導率通常是一種合適的方 式。
在外界條件下，尤其在外界溫度下，可進行該固化。
通常以至少等于0.1至2.0的水力i皮度的流速(flow rate )將細 菌與絮凝劑引入材并牛中。由于實際的原因，該水力;皮度通常達到0.8 至1.2, 4尤選達到1.0。
在細菌被固化后，可以向材料中加入基質(zhì)以4吏細菌可以進行材 料修飾活動(material modifying activity )，諸如生成礦物質(zhì)。首先， 通過絮凝作用使細菌固化，并且其后加入基質(zhì)是有利的，這是因為 例如，與其中可同時施加礦^f匕基質(zhì)與固^匕劑的方法相比，該活性，
諸如礦化可以更好地被控制。特別地，可以一種更均質(zhì)方式和/或在
材料的較大容積(volume)中修飾該材料，(例如經(jīng)更長的距離)。
基質(zhì)的選擇取決于細菌及它們預期的活性。為形成諸如碳酸鹽 的礦物，可利用具有脲酶活性的細菌，力口入脲、以及諸如鈣的陽離 子以產(chǎn)生生物礦化?？梢曰诒绢I域已知的方法選擇基質(zhì)成份的濃 度。優(yōu)選地，卩日離子(4丐)的濃度為至少100 mM,更優(yōu)選地，在 800 mM至1500 mM的范圍內(nèi)。脲濃度優(yōu)選(約)等摩爾所力。入的 陽離子的濃度。
現(xiàn)將通過以下實施例示例本發(fā)明。
具體實施例方式
實施例1:細菌的絮凝
在20°C的溫度下，將不同的二價陽離子的鹽與巴氏芽孢八疊 3求菌屬(S/ orasarc/"apaWewh/)纟田菌白勺懸、浮液(在600nm的光密度 =1.0)混合以生成最終濃度20 mM的二價陽離子。這些鹽分別為 Ni(N03)2、 ZnCl2、 Mg(N03)2、 CaCl2。
經(jīng)5分鐘的混合后，確定600 nm處的光密度被并與對照標準 (control)(沒有加入二價陽離子的細菌懸浮液)進行比較。圖1 示出了結果。
根據(jù)光密度的增加，可以推斷出鎳、鋅、鎂以及4丐對于引發(fā)絮 凝是有效的。
實施例2:漏出點容量的確定 用Itterbeek沙石樂(d50=420 pm ) ^!夸^主(1.6 cm的圓內(nèi)徑(circular ID )， 1 m長)填充至1.7g/cm3的密度。
月永動注入10 ml 50 mM的氯化4丐。其后，柱抽吸(pump )氯化 鈣穿過充有離子水的該柱并且在該柱的末端監(jiān)控氯化物的水平。圖 3示出了氯化4丐穿過材料遷移同時基本上沒有^皮延遲(delayed ):在 大約一個柱體積(column volume )后，氯化鈣帶的前部(front)到 達該柱的端部，并且在1.5柱體積內(nèi)，基本上所有的氯化鈣遷移穿 過該材料。
在一個單獨的試—驗中，月永動(pulse)注入10 ml巴氏芽3包乂\ 疊球菌屬(5^omsarc/"a / a他鵬'0細菌的懸浮液(在600 nm的光 密度為4.2)。試驗顯示，在一個以上的柱體積穿過柱之后，包括細 菌的該帶的前部到達柱的端部，表明細菌正在比絮凝劑(氯化鈣) 更十曼的遷移穿過該柱。
實施例3:細菌的固化
用Itterbeek sand ( d50=420 pim )》真充^主(column ) ( 1.8 cm的圓 直徑，6.8 m長)并將其保持在飽和狀態(tài)下。注入細菌(濃度=0.5 mS/min)直到它們在該牙主的出口 (column outlet)出i見。jt匕后立刻 注入相同體積的50 mM的氯化4丐并4吏之靜置1小時。再用三倍孔 體積的去離子水沖洗該柱并將其分成多個部分用于脲酶活性分析。
脲酶活性由如下確定通過向容器中稱量已知體積的沙石樂并加 入脲至最終濃度1 M，再監(jiān)控電導率以得到該脲的水解率 (hydrolysis rate ) ( mS/min )。
沿該柱的6.8 m的長度的各個位置檢測脲酶活性(圖3 )。
實施例4:非原位力交結
用Itterbeek沙礫(d5o=420 |tim )填充柱(1.8 cm的圓直徑，6.8 m長)并將其保持在飽和狀態(tài)下。注入細菌(濃度=0.5 mS/min )直 到它們在該柱的出口出現(xiàn)。此后立刻注入相同體積的50 mM的氯 化釣并^f吏之靜置1小時。再用三4咅孔體積的去離子水沖洗該柱并將 其分成多個部分用于脲酶活性分析。按照實施例3確定脲酶活性。
除這種測試外，在對于這些部分進行脲酶活性分析之后，立即 去除這些柱的部分并將其放于含有1 M脲以及1M氯化鈣的封閉 的容器中以模擬原位膠結。這些容器慢慢地混合并且監(jiān)控銨的產(chǎn)生。
除距注入點(40cm)最近的部分之夕卜，該核(core)的所有部 分接近完全膠結。在該核中4企測的脲酶的活性以及初始的銨生產(chǎn)率 (在最初24個小時中)是一致的(圖4)。
實施例5: CaCO^含量對于孔隙率的作用
在更高層的柱(內(nèi)徑6.6 cm;長度5 m )中，用0.3的水力梯 度重復實施例4的試驗。注入1.1 M等摩爾的脲與氯化鈣溶液并以 一個梯度沿著該柱進4亍月交結，乂人而在材料中得到不同的CaC03含 量。將該柱分成多個部分并且確定對于孔隙率的影響。如圖5所示， 在用給定方法的細菌固化以及隨后的膠結后，隨著碳酸鈣含量的增 加，觀察到僅有較小的孔隙率的下降。這證明，本發(fā)明適合于在大 尺寸材料(bulky materials)中或在地質(zhì)形成物中的較長距離上，產(chǎn)
生生物》;N匕。
實施例6:絮凝劑濃度對于絮凝物尺寸的影響
將一定量的細菌(在600nm處的光密度=1.0)與各種濃度的 CaCl2進4亍混合。用激光書亍射(laser diffraction )測定對于絮凝物尺 寸的影響。如圖7所示。隨著絮凝劑濃度的增加，絮凝物尺寸增大。
權利要求
1. 一種用于在可滲透細菌的材料中，特別是在地質(zhì)體中固化細菌的方法，包括在所述材料中形成包含所述細菌的第一帶，并使所述第一帶移動穿過至少部分的所述材料；形成包括有效量的絮凝劑的第二帶到所述材料，并且使所述第二帶移動穿過至少部分的所述材料，其中，所述多個帶可以移動從而使所述多個帶變得至少部分地重疊，并且至少部分的所述細菌絮凝，從而成為固化的。
2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述第二帶在所述第一帶 形成之后立即形成，并且兩個帶可以相同的方向移動穿過至少 部分的所述材泮牛。
3. 才艮據(jù)4又利要求1所述的方法，其中所迷第一帶以第一方向移動 而所述第二帶與所述第一方向成角度，其中，所述方向是這樣 的，即所述多個帶朝向4皮此移動并JU皮此交叉。
4. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述材料為選自由多個地質(zhì)體構成的組的材料，所述多個地質(zhì)體包括沉淀物 (如粘土、粉粒、沙^樂和/或礫石)、沉積巖、土壤材料以及可 滲透細菌的巖石材料(如裂隙巖)。
5. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述絮凝劑選自由二價陽離子構成的組，優(yōu)選地，選自由4臬離子、鋅離子、 4美離子、以及鈣離子構成的組。
6. ^4居前述^L利要求中任一項所述的方法，其中，以3mmo/l至 100mmo/1液體的濃度向所述材料中加入所述絮凝劑。
7. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述細菌是選 自由產(chǎn)脲酶細菌構成的組，更優(yōu)選地，選自由芽孢八疊球菌屬， 尤其是巴氏芽孑包/\疊玉求菌屬(S/ orosorc/"" /7ay/ewn7 ) 4勾成的組。
8. 才艮據(jù)前述4又利要求中任一項所述的方法，其中，將所述細菌以 包含0.1至1.0 mS/min (通過在20°C時，細菌加入1 M脲 時所產(chǎn)生的電導率的相對變化來確定)的懸浮液的形式加入所 述材料。
9. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述第一和/ 或第二帶以范圍為0.1至2.0的水力梯度所限定的速度移動穿 過所述材料。
10. 才艮據(jù)前述4又利要求中任一項所述的方法，其中，在固化后，有 效量的基質(zhì)加入所述材沖+中，以4吏所述細菌形成礦物質(zhì)。
11. 根據(jù)權利要求10所述的方法，其中，有效量的脲及鈣離子與 所述經(jīng)固化的細菌接觸，以使所述細菌形成CaC03。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于在可滲透細菌的材料中，特別是地質(zhì)體中固化細菌的方法，包括在材料中形成包含該細菌的第一帶，并使該第一帶(zone)移動穿過至少部分的材料；形成包括有效量的絮凝劑的第二帶到所述材料，并且使所述第二帶移動穿過至少部分的材料，其中可以使多個帶移動從而使這些帶變得至少部分地重疊，并且至少部分的細菌絮凝，從而成為固化的。
文檔編號C12N11/14GK101365790SQ200680050889
公開日2009年2月11日 申請日期2006年12月15日 優(yōu)先權日2005年12月15日
發(fā)明者維多利亞·蘇珊·惠芬, 萊昂·安德烈亞斯·范帕森, 馬里納斯·彼得·哈爾克斯 申請人:三角洲研究基金會