專利名稱：一種檢測肺癌骨轉(zhuǎn)移試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測試劑盒，具體而言，涉及一種肺癌骨轉(zhuǎn)移熒光定量PCR檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
目前全世界范圍內(nèi)每年有超過100萬的患者被診斷為肺癌，惡性腫瘤可以轉(zhuǎn)移至體內(nèi)不同的器官，骨轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤常見并發(fā)癥之一。骨組織是惡性腫瘤遠處轉(zhuǎn)移最好發(fā)的器官，許多類型的惡性腫瘤都可以發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，引起骨轉(zhuǎn)移的常見腫瘤有乳腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌等。惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移多發(fā)生在50-80歲，40歲以下少見。骨轉(zhuǎn)移可累及全身骨骼，中軸骨(脊柱，骨盆等)及長骨近端是骨轉(zhuǎn)移的好發(fā)部位。骨轉(zhuǎn)移常為多發(fā)性，少數(shù)為單發(fā)病變。骨的破壞形式大多為溶骨型，少數(shù)為成骨型或兩者兼有(混合型)。原發(fā)性肺癌骨轉(zhuǎn)移的好發(fā)部位依次為胸部、脊柱、骨盆、肢體骨及顱骨，肺循環(huán)血·流豐富，癌細(xì)胞可循血運到達人全身骨骼系統(tǒng)造成骨轉(zhuǎn)移；肺癌中腺癌的骨轉(zhuǎn)移率高于其他類型原發(fā)性肺癌，可能和腺癌的生物學(xué)特性有關(guān)，腺癌周圍型肺癌較多見，容易直接侵犯到肋骨、脊柱又可以通過血路經(jīng)脊柱靜脈和肺靜脈達到全身骨骼；也可能和腺癌病人存活時間長有關(guān)。肺癌骨轉(zhuǎn)移最常見的類型為溶骨性骨轉(zhuǎn)移，雖然也有局部骨組織的反應(yīng)性增生，但其主要表現(xiàn)為骨組織的溶解破壞和吸收。成骨性轉(zhuǎn)移以大量病理性成骨為特點，這些新生骨組織呈編織樣，不具備正常骨的功能，反而破壞了骨的正常結(jié)構(gòu)，影響骨的正常功能，因此會造成病理性骨折等并發(fā)癥。病理性成骨的形成是腫瘤細(xì)胞與成骨細(xì)胞相互作用的結(jié)果，但也不能忽視破骨細(xì)胞的作用。腫瘤細(xì)胞在骨局部通過破骨細(xì)胞破壞骨組織的同時，可釋放出骨組織中貯存的生長因子如TGFp、IGF等，加上腫瘤細(xì)胞自身分泌的BMP，PSA，ET-I等，可刺激成骨細(xì)胞的增殖。當(dāng)成骨細(xì)胞活性增高，成骨大于破骨時，就出現(xiàn)了腫瘤性成骨，顯示成骨性轉(zhuǎn)移的特殊臨床病理表現(xiàn)?；旌闲赞D(zhuǎn)移一般說來，由于骨代謝的特點，成骨及溶骨過程二者相互關(guān)聯(lián)，成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞在功能上相互依存。因此，腫瘤的骨轉(zhuǎn)移往往都是二者共存，只不過某一過程占據(jù)主導(dǎo)地位而已。破骨細(xì)胞的激活是所有骨轉(zhuǎn)移發(fā)生的重要先決條件。以前列腺癌為例，盡管臨床表現(xiàn)以成骨性轉(zhuǎn)移為主，但在轉(zhuǎn)移發(fā)生的早期階段，腫瘤細(xì)胞對骨組織的破壞是重要的起始步驟，骨組織中貯存的生長因子如TGFp、IGF等的釋放啟動了前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的過程。隨著成骨細(xì)胞的激活，病理性成骨逐漸變得明顯，最后形成前列腺癌特有的成骨性轉(zhuǎn)移。一般來說，30% -40%的晚期肺癌會發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，骨轉(zhuǎn)移所致的骨損害將加重患者的病情，引起功能障礙，降低患者的生活質(zhì)量，甚至縮短生存期。因此，深入研究惡性腫瘤發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的機制，分析骨轉(zhuǎn)移患者的臨床特點，早期診斷骨轉(zhuǎn)移，預(yù)防相關(guān)并發(fā)癥，可以提高患者的生活質(zhì)量，為進一步的治療提供條件。
預(yù)測腫瘤骨轉(zhuǎn)移的手段有很多，如影像學(xué)診斷X線、CT，ECT，PET ;化學(xué)診斷主要包括血清學(xué)、生化、免疫學(xué)指標(biāo)的檢測；細(xì)胞學(xué)和病理組織學(xué)診斷僅對病人預(yù)后和臨床治療方案選擇有一定的幫助；基因診斷的敏感性高，但極容易出現(xiàn)假陽性，診斷特異性取決于對靶分子的選擇，發(fā)展高通量，自動化，集成化，標(biāo)準(zhǔn)化的基因診斷技術(shù)是今后的研究方向；骨髓穿刺活檢(bone marrow biopsy):骨髓中發(fā)現(xiàn)的腫瘤細(xì)胞,不僅可以預(yù)測骨轉(zhuǎn)移的情況，對預(yù)測其它器官如肺、肝的轉(zhuǎn)移也很有臨床價值。惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移的診斷方法目前主要依賴病理和影像學(xué)檢查如穿刺細(xì)胞學(xué)檢查，X線、CT，MR和ECT檢查等，尚無特異性實驗室診斷方法，目單純依賴ECT檢查來判斷骨轉(zhuǎn)移有無及其進展?fàn)顩r，已難以滿足臨床需求。惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移的診斷方法如能提前，可根據(jù)病人實際進行針對性治療，阻止骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生，降低其危害。骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生必定需要基因的調(diào)控，基因起作用亦需要上游RNA的調(diào)控，所以、以miRNA為診斷檢測骨轉(zhuǎn)移的指標(biāo)可將預(yù)測病變的時間大大提前，為阻止骨轉(zhuǎn)移創(chuàng)造更佳的時機并爭取更多的時間。
由于miRNA對引起骨轉(zhuǎn)移的基因具有重要調(diào)控作用，因此本發(fā)明針對可引起骨轉(zhuǎn)移病變的miRNA開發(fā)出一對特異性引物，并開發(fā)制作出試劑盒，并經(jīng)大群體人群實驗驗證，結(jié)果顯示本發(fā)明設(shè)計的可預(yù)測肺癌骨轉(zhuǎn)移的試劑盒能有效檢測可引起肺癌骨轉(zhuǎn)移miRNA的發(fā)生。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測小RNA表達水平的熒光定量PCR試劑盒及使用方法，該PCR試劑盒適合于目前存在市場上的所有類型熒光定量基因擴增儀，靈敏度高，定量快速準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好，具有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明的另一目的是在于提供一種熒光定量PCR試劑盒對肺癌是否發(fā)生骨轉(zhuǎn)移進行快速的檢測。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先分別提取了肺癌發(fā)生骨轉(zhuǎn)移患者腫瘤細(xì)胞和肺癌未發(fā)生骨轉(zhuǎn)移患者腫瘤細(xì)胞的總RNA,并從中純化miRNA,利用Single-end library建庫方法，共得到兩個肺癌骨轉(zhuǎn)移前后腫瘤細(xì)胞miRNA轉(zhuǎn)錄組文庫。對所得的miRNA轉(zhuǎn)錄組文庫進行高通量測序，對高通量測序序列過濾，去除低質(zhì)量序列，使用S0AP2方法跟人類基因組進行比對。并對測序結(jié)果進行分析，其中通過fold-change方法，對不同樣本的表達差異基因進行了比較，得到了表達差異顯著的miRNA novel_mir_89，其序列見序列表SEQ ID NO. 5。本發(fā)明根據(jù)noVel_mir_89的序列信息，設(shè)計了四條引物，第一條為莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物RT89，其序列見序列表SEQ NO. I ;第二條是上游的特異引物F89，其序列見序列表SEQ NO. 2 ;第三條為下游的通用引物R89，其序列見序列表SEQ NO. 3 ;第四條是在熒光定量PCR中需要的熒光探針引物Flu89，其序列見序列表SEQ NO. 4，在熒光探針Flu89的5’端標(biāo)有熒光基因FAM，在熒光探針Flu89的3’端標(biāo)有熒光淬滅基團TAMRA。本發(fā)明還制備了含有noVel_mir_89序列的標(biāo)準(zhǔn)DNA模板。制備步驟方法如下提取肺癌發(fā)生骨轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的總RNA，從中純化出miRNA，接著進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄體系為莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物RT89，SEQ ID NO. I (2 μ mol/L) I μ 1，miRNA4y tl, dNTP混合物(每種 2. Smmol /I,) 4 μ 1,0. lmol/L DTT2 μ I, SuperScript RNase H 逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/μ1)2μ1。反應(yīng)條件為37°C水浴60分鐘，95°C水浴3分鐘。將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到的cDNA進行常規(guī)PCR擴增，PCR產(chǎn)物檢測后切膠回收并純化，將純化產(chǎn)物連接到PGM-T克隆載體上，隨后轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)細(xì)胞中。通過序列為SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3的特異性引物篩選陽性克隆。陽性克隆擴增后提取質(zhì)粒DNA，質(zhì)粒DNA采用NanoDrop ND-1000核酸定量儀定量(NanoDrop Technologies, Wilmington, Delaware)并做10倍系列稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。本發(fā)明還制備了一種檢測novel_mir_89表達水平的突光定量PCR試劑盒，組分如下特異性引物、特異性探針、標(biāo)準(zhǔn)DNA模板、熒光定量PCR反應(yīng)液。其中所述的特異性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列為SEQ IDN0.2，下游引物序列為SEQ ID NO. 3，特異性探針的核苷酸序列見序列表SEQN0. 4，在熒光探針的5’端標(biāo)有熒光基因FAM，在熒光探針的3’端標(biāo)有熒光淬滅基團TAMRA。本發(fā)明還公開了一種檢測肺癌是否發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的熒光定量PCR試劑盒的使用方法，熒光定量 PCR 體系Hot-start Taq DNA 聚合酶(2. 5U/μ I) I μ l，Hot_startTaq DNA 聚合酶的10Xbuffer5 μ 1，dNTP混合物(每種IOmmoI/L) I μ 1，上游引物(10 μ mol/L)，下游 引物(10 μ mol/L) ,TaqMan 探針(5 μ mol/L)各 I μ 1，樣品 cDNA5 μ I 或標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒 DNA2 μ 1，加離子水至50 μ I。熒光定量PCR程序5°C IOmin預(yù)變性，接45個循環(huán)95°C 40s，60°C lmin。本發(fā)明還檢測了本試劑盒靈敏性，結(jié)果顯示本試劑盒檢測范圍為107-102COpieS/μ i，最小檢出濃度為IOOcopies/ μ I。通過對陽性樣品的檢測，發(fā)現(xiàn)本試劑盒檢測準(zhǔn)確率達91 %。連續(xù)3次重復(fù)實驗，實驗結(jié)果穩(wěn)定。


圖I小RNA長度在樣本A和B的分布。樣本A為肺癌未轉(zhuǎn)移病人的腫瘤細(xì)胞miRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，樣本B為肺癌骨轉(zhuǎn)移病人的腫瘤細(xì)胞的miRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。圖2各濃度下標(biāo)準(zhǔn)DNA模板的PCR擴增曲線。曲線從左到右依次為濃度為108、107U06U05U04U03U02個拷貝/ μ I的標(biāo)準(zhǔn)DNA模板的PCR擴增曲線。圖3標(biāo)準(zhǔn)DNA模板熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖4novel_mir_89在肺癌骨轉(zhuǎn)移病人和正常人中的表達量。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照廠商所建議的條件。實施例I肺癌骨轉(zhuǎn)移前后腫瘤細(xì)胞microRNA表達的變化一材料和方法I、材料腫瘤細(xì)胞均來自于附屬醫(yī)院2004年-2010年因肺癌住院病例，分別取30例肺癌骨轉(zhuǎn)移病人的腫瘤細(xì)胞和30例肺癌未轉(zhuǎn)移病人的腫瘤細(xì)胞。2、方法2. I肺癌骨轉(zhuǎn)移前后腫瘤細(xì)胞總RNA的提取
按Trizol試劑盒說明書提取肺癌骨轉(zhuǎn)移病人和肺癌未轉(zhuǎn)移病人腫瘤細(xì)胞的RNA，通過凝膠電泳證明RNA的完整性，用核酸蛋白儀測定RNA的濃度和純度。采用上海華舜生物工程有限公司總RNA抽提試劑盒子提取。主要操作步驟如下(I)用胞裂解液BL裂解組織細(xì)胞，離心取上層細(xì)胞。在上層細(xì)胞中加入Iml的Trizol，用帶針頭的一次性注射器抽打裂解物10次。(2)靜置5分鐘后，加入200 μ I的氯仿，用力顛倒離心管混勻后，室溫靜置使之分層，12000g離心5分鐘，小心移取水相至I. 5ml的離心管中。(3)加入等體積的異丙醇，徹底混勻后，取出750 μ I移入吸附柱，離心30秒，倒掉收集管中的液體，將吸附柱移入同一收集管中，將剩余的全部將入吸附柱中，離心30秒。倒掉收集管中的液體，將吸附柱移入同一個收集管中。(4)加入500 μ L RP液，離心30秒。倒掉收集管中的液體，將吸附柱移入同一收集 管中。(5)將500 μ I的W3液，靜置I分鐘，離心15秒。(6)將吸附柱移入一個干凈的收集管中，加入500 μ I W3液，離心15秒。(7)倒掉收集管中的液體，再將吸附柱移入同一收集管中，離心I分鐘。(8)將吸附柱放入另一個干凈的I. 5ml的離心管中，在吸附膜中央加入50 μ I純水，室溫靜置I分鐘后，離心I分鐘。將RNA貯存于-70°c。(9)總RNA完整性鑒定取2 μ I RNA樣品在I. 5%瓊脂糖凝膠電泳(80v，15min)，分出區(qū)帶后，EB染色，紫外燈下觀察電泳區(qū)帶。(10)用核酸蛋白儀測定RNA的濃度和純度2. 2、肺癌骨轉(zhuǎn)移前后腫瘤細(xì)胞miRNA轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建及測序利用QIAGEN公司的RNeasy MinElute Cleanup Kit從上述得到的總RNA中純化miRNA,具體步驟見說明書。利用Single-end library建庫方法,共得到兩個肺癌骨轉(zhuǎn)移前后腫瘤細(xì)胞miRNA轉(zhuǎn)錄組文庫。將上述miRNA轉(zhuǎn)錄組文庫進行高通量測序，對高通量測序序列過濾,去除低質(zhì)量序列，使用S0AP2方法跟人類基因組進行比對。2. 3、生物信息學(xué)分析生物信息學(xué)分析流程Illumina測序所得50nt序列，通過去接頭、去低質(zhì)量、去污染等過程完成數(shù)據(jù)處理得到干凈序列，對其進行序列長度分布的統(tǒng)計及樣品間公共序列統(tǒng)計。將清理后的干凈序列分類注釋，可以獲得樣品中包含的各組分及表達量信息。將所有小RNA片段注釋后，用預(yù)測軟件Mireap對未得到注釋片段進行新的miRNA預(yù)測。具體生物信息學(xué)內(nèi)容如下數(shù)據(jù)處理對原始數(shù)據(jù)進行去除接頭、污染序列及低質(zhì)量reads的處理，并統(tǒng)計sRNA的長度分布，標(biāo)準(zhǔn)信息分析(I)分析樣品間的公共序列及特有序列；(2)探索sRNA在選定的參考基因組上的分布；(3)通過與Rfam(9. I)數(shù)據(jù)庫以及Genbank的比對,鑒定rRNA、tRNA、snRNA等非編碼RNA ；(4)通過與miRNA數(shù)據(jù)庫(miRBasel6. O)中指定范圍的miRNA進行比對,鑒定樣品中的已知miRNA ；(5)分析已知miRNA的表達模式；(6)通過與重復(fù)序列的比對，鑒定與重復(fù)序列相關(guān)的sRNA ；(7)通過與外顯子、內(nèi)含子的比對鑒定mRNA降解片段；(8)按照優(yōu)先級對sRNA進行分類注釋；(9)利用Mireap對沒有注釋的sRNA進行預(yù)測預(yù)測新的miRNA,繪制新的miRNA 的二級結(jié)構(gòu)圖；(10)參照Audic S.等人發(fā)表在Genome Research上的基于測序的差異基因檢測方法，分析了肺癌骨轉(zhuǎn)移前后病人的腫瘤細(xì)胞miRNA的差異表達。二結(jié)果通過使用Illumina Solexa Hiseq2000,利用 Single-end library 建庫方法,共得到兩個miRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分別為A和B，A為肺癌未轉(zhuǎn)移病人的腫瘤細(xì)胞miRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，B為肺癌骨轉(zhuǎn)移病人的腫瘤細(xì)胞的miRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。I. small RNA測序結(jié)果概述對這些初步的35nt左右的原始reads做去接頭,去低質(zhì)量reads,去污染等處理，得到高質(zhì)量的測序reads，其中A有25 100 000個reads，B有24 600 000個reads，后續(xù)分析均以此為基礎(chǔ)。首先對小RNA做長度分布統(tǒng)計，一般來說，miRNA集中在21或22nt，siRNA集中在24nt，piRNA集中在30nt。2個樣本的small RNA均在22nt位置呈現(xiàn)出明顯的單峰結(jié)構(gòu)(如圖I)，說明其大多數(shù)為miRNA。A組中20— 24nt的sRNAs占細(xì)胞總sRNA的51. 61 %，B組中20—24nt的sRNAs占細(xì)胞總sRNA的52. 28%。樣品中reads做分類注釋，得到2個樣本中各種小RNA的比例(如圖2)。可以看到miRNA的含量最高，其次是未注釋的RNA(unarm)，其可能為siRNA和未發(fā)現(xiàn)的miRNA。2.新miRNA候選基因的預(yù)測將clean reads序列做分類注釋，我們獲得樣品中各類小RNA的表達信息，其包括miRNAs, rRNA, tRNA, scRNA, snRNA, snoRNA,重復(fù)序列相關(guān)小 RNA，mRNA 相關(guān) RNA 和未注釋的小RNA。除表達量最高的miRNAs之外，其次就是未注釋的小RNA。對新miRNA的生物信息學(xué)預(yù)測，是基于已知的miRNA加工成熟中的特點來實現(xiàn)的，長度為18-25nt，其對應(yīng)前體的位置能夠形成發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)，我們是利用miRNA預(yù)測軟件Mireap (https: //sourceforge. net/pro jects/mireap/)進行的，預(yù)測 miRNA 主要是根據(jù)miRNA的特殊結(jié)構(gòu)1、候選發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)的上游高度保守的模序的存在；2、sRNA必須在遠離發(fā)夾結(jié)構(gòu)環(huán)，位于發(fā)夾結(jié)構(gòu)兩臂上；3、酶切位點的保守性，一般的miRNA酶切位點不會偏移超過3個堿基；4、發(fā)夾前體要有較低的折疊自由能能量。分析發(fā)現(xiàn)了一些新的miRNA候選基因，共107條，其中在骨轉(zhuǎn)移前88條，骨轉(zhuǎn)移后76條。3.肺癌骨轉(zhuǎn)移前后病人的腫瘤細(xì)胞miRNA的差異表達分析為了分析肺癌骨轉(zhuǎn)移前后病人miRNA的差異表達，先將A、B兩個miRNA轉(zhuǎn)錄組的各個miRNAs標(biāo)準(zhǔn)化，某miRNA標(biāo)準(zhǔn)化表達=某miRNA實際數(shù)量X 1000000/轉(zhuǎn)錄組中reads的總數(shù)。如果某個miRNA在兩個轉(zhuǎn)錄組中的標(biāo)準(zhǔn)化reads之和小于1，則被剔除不再分析，如果某個miRNA在其中一個轉(zhuǎn)錄組中的表達值為O則其標(biāo)準(zhǔn)表達值為O. 01。倍數(shù)變化(fold-change)計算為Log2 (實驗組/對照組)。用下面方法計算P值

倍數(shù)變化值大于I則認(rèn)為miRNA表達上調(diào)，倍數(shù)變化值小于_1則認(rèn)為miRNA表達下調(diào)，特別是當(dāng)P值小于O. 05時，具體結(jié)果見表I :表I肺癌骨轉(zhuǎn)移前后病人的腫瘤細(xì)胞miRNA的差異表達
權(quán)利要求
1.一種miRNA novel_mir_89的特異性引物及特異性探針,其特征在于,所述的特異性引物包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分別為SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3，特異性探針的核苷酸序列為SEQ ID NO. 4。
2.一種檢測肺癌骨轉(zhuǎn)移的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含有權(quán)利要求I所述的特異性引物和特異性探針。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種檢測肺癌骨轉(zhuǎn)移的熒光定量PCR試劑盒，還包括標(biāo)準(zhǔn)DNA 模板、Hot-start Taq DNA 聚合酶,其濃度為 2. 5U/μ I, Hot-start TaqDNA 聚合酶的IOXbuffer, dNTP 混合物，每種 NTP 濃度為 10mmol/L。
4.權(quán)利要求I的引物和探針在制備檢測肺癌骨轉(zhuǎn)移試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測肺癌骨轉(zhuǎn)移熒光定量PCR的試劑盒。該試劑盒包括以下成分特異性引物、特異性探針、標(biāo)準(zhǔn)DNA模板、熒光定量PCR反應(yīng)液。本發(fā)明還公開了一種檢測肺癌骨轉(zhuǎn)移熒光定量PCR試劑盒的使用方法。利用該試劑盒可以快速定量檢測novel_mir_89的表達量，從而檢測肺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生情況。本發(fā)明操作簡便、快速、結(jié)果穩(wěn)定、靈敏度高且特異性強。
文檔編號C12N15/11GK102876789SQ201210347230
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月19日
發(fā)明者楊祚璋, 謝琳, 徐磊, 李國奇 申請人:楊祚璋