專(zhuān)利名稱(chēng)：基于引物延伸的dna測(cè)序方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種DNA序列測(cè)定方法，尤其涉及一種基于引物延伸的DNA測(cè)序方法.
背景技術(shù)：
目前兩個(gè)最常用的DNA測(cè)序方法是Sanger的雙脫氧鏈終止法及Maxam和Gilbert的化學(xué)切割測(cè)序法，但二者都依賴(lài)于電泳分離大小不同的DNA片段。Sanger測(cè)序法應(yīng)用了雙脫氧核苷酸隨機(jī)終止聚合反應(yīng)，這樣產(chǎn)生了各種長(zhǎng)度的延伸鏈，通過(guò)電泳來(lái)分離。由于終止處的核苷酸可以被確認(rèn)，而每一處都有終止處，因此可以讀出序列。雖然電泳技術(shù)特別是毛細(xì)管電泳的應(yīng)用使得測(cè)序的自動(dòng)化程度得到了很大提高，但其通量仍受到一定程度的限制，因此對(duì)于需要高額費(fèi)用和高通量的大規(guī)?；蚪M計(jì)劃或診療測(cè)序來(lái)說(shuō)不是最適宜的方法。近年來(lái)隨著基因芯片在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展，其高通量檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)被引用到DNA測(cè)序中，并發(fā)展或提出了一些非電泳的測(cè)序方法，例如芯片雜交測(cè)序法，焦磷酸測(cè)序法，光切割熒光核苷酸法。
芯片雜交測(cè)序法利用芯片上高密度的寡核苷酸序列點(diǎn)陣和靶序列雜交，然后拼接出靶DNA的序列，需要合成非常高密度的點(diǎn)陣才能有效測(cè)出靶DNA序列，而高密度點(diǎn)陣的制作目前仍很困難。
焦磷酸測(cè)序法和光切割熒光核苷酸測(cè)序法的共同點(diǎn)是采用DNA聚合酶進(jìn)行逐步延伸引物鏈，屬于合成法測(cè)序(sequencing by synthesis)。因此先對(duì)合成法測(cè)序過(guò)程作一般概述首先制得單鏈模板DNA，引物和模板DNA鏈退火得到雜交的DNA分子，然后在DNA聚合酶存在下加入核苷酸底物，每次只加入一種核苷酸底物或四種帶標(biāo)記的雙脫氧核苷酸底物，如果加入的核苷酸和模板上對(duì)應(yīng)的堿基互補(bǔ)，則聚合酶會(huì)將之整合到引物鏈。核苷酸的整合事件可以通過(guò)各種方法檢測(cè)，例如焦磷酸測(cè)序是通過(guò)檢測(cè)焦磷酸的釋放；也可以將容易檢測(cè)的標(biāo)記物如發(fā)熒光的物質(zhì)連接到核苷酸上，然后檢測(cè)。
焦磷酸測(cè)序法(pyrosequencing)是通過(guò)生物催化發(fā)光來(lái)確定是否有核苷酸摻入，其原理是加入的核苷酸底物和模板堿基互補(bǔ)時(shí)，DNA聚合酶催化其聚合，同時(shí)會(huì)釋放出焦磷酸，焦磷酸被酶轉(zhuǎn)化為ATP，ATP在熒光素酶的作用下會(huì)產(chǎn)生光子而被高靈敏光電探測(cè)器檢測(cè)到。它通過(guò)底物加入順序來(lái)確定核苷酸種類(lèi)，是一種即時(shí)(real-time)測(cè)序法。該方法多個(gè)酶促反應(yīng)和生物芯片的高通量檢測(cè)結(jié)合起來(lái)對(duì)于基因組測(cè)序有一定的優(yōu)勢(shì)。但其存在測(cè)序長(zhǎng)度受限(50bp左右)和對(duì)多個(gè)連續(xù)同樣的核苷酸不能準(zhǔn)確測(cè)序，而且需要特定的儀器裝備。
一些研究者合成了許多光切基團(tuán)或化學(xué)試劑切割基團(tuán)用于DNA測(cè)序研究。采取的路線基本是用DNA合成酶摻入熒光標(biāo)記物后檢測(cè)，然后用激光或其他化學(xué)試劑去除熒光基團(tuán)。之后加入下一個(gè)標(biāo)記底物。也有研究將光切割和核苷酸3’-OH用化學(xué)基團(tuán)保護(hù)結(jié)合起來(lái)，這樣可以實(shí)現(xiàn)每次只摻入一個(gè)核苷酸進(jìn)入引物鏈。光切割熒光核苷酸法借鑒了DNA和多肽化學(xué)合成的思想，但采用的催化劑是高度特異性酶，由于3’-OH端被保護(hù)，每次只能摻入一個(gè)核苷酸，每次延伸的核苷酸的種類(lèi)由模板來(lái)決定，但我們可以通過(guò)其熒光顏色來(lái)得知每次摻入的是何種核苷酸，因此序列可以得知。但由于3’-OH涉及磷酸二酯鍵的形成，核苷酸的3’-OH非?？拷麯NA聚合酶的活性位點(diǎn)，因此對(duì)3’-OH的修飾非常敏感，很少DNA聚合酶能夠催化該底物的聚合。這些路線的缺點(diǎn)一是需要合成復(fù)雜的切割基團(tuán)；二是熒光基團(tuán)不一定會(huì)完全切掉和脫掉，當(dāng)延伸到一定長(zhǎng)度會(huì)產(chǎn)生背景干擾。光切割熒光核苷酸法是最近新發(fā)展起的新技術(shù)，還在起步階段，其光切割熒光核苷酸還沒(méi)有商品化，且其準(zhǔn)確度和長(zhǎng)度還待進(jìn)一步確定。
單堿基延伸反應(yīng)(single base extension，SBE)，又名微測(cè)序法(minisequencing)。根據(jù)待檢測(cè)樣品的SNP位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)引物(不包括SNP位點(diǎn))并將其直接固定在芯片上，以待測(cè)樣品的PCR產(chǎn)物作為模板，則寡核苷酸引物的3’端堿基緊挨于模板多態(tài)性堿基位點(diǎn)，當(dāng)模板和引物雜交后，加以用各色熒光或者其他標(biāo)記物標(biāo)記的4種ddNTP，在DNA多聚酶的催化下與模板配對(duì)的引物直接在芯片上進(jìn)行固相單堿基延伸反應(yīng)，通過(guò)檢測(cè)熒光的種類(lèi)得知摻入SNP位點(diǎn)的核苷酸底物的種類(lèi)。DNA多聚酶的特異性使該方法的敏感度和分辨率均較高，但其缺點(diǎn)是必須使用多色熒光系統(tǒng)以及相應(yīng)的檢測(cè)系統(tǒng)，而且多種染料的激發(fā)光和發(fā)射熒光的光譜往往會(huì)有較大部分的重疊，從而干擾對(duì)熒光強(qiáng)度的測(cè)量精度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述所提到的核酸測(cè)序方法中的不足，提出一種基于生物芯片的高通量基于引物延伸的DNA測(cè)序方法，具有測(cè)序價(jià)格低、準(zhǔn)確性高和可操作性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種用于確定未知核酸序列的核酸序列測(cè)定方法A)在被測(cè)的DNA模板中引入一段已知的通用DNA序列，并使之固定于固相基質(zhì)上；B)設(shè)計(jì)1-15個(gè)寡核苷酸DNA引物組合，使其含有一段與上述加入的通用DNA序列互補(bǔ)的序列，并使該1-15個(gè)寡核苷酸DNA引物的3’端分別含有0、1、2、……、14個(gè)簡(jiǎn)并性核苷酸；C)根據(jù)待測(cè)核苷酸位點(diǎn)的位置，從上述引物組合中選擇一種引物，并將其與A中所述的固定DNA模板雜交，使待測(cè)核苷酸位點(diǎn)緊接著引物3’末端；D)用DNA聚合酶及用四種可分辨的標(biāo)記物標(biāo)記的雙脫氧核苷酸底物或分別用一種或幾種標(biāo)記物標(biāo)記的四種脫氧核苷酸或雙脫氧核苷酸，在雜交到模板上的引物上進(jìn)行一種核苷酸延伸；E)檢測(cè)D中被延伸核苷酸種類(lèi)，A中DNA模板被測(cè)堿基的種類(lèi)與延伸核苷酸種類(lèi)互補(bǔ)。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1、高通量。本發(fā)明將DNA測(cè)序技術(shù)和生物芯片相結(jié)合，可以同時(shí)在芯片上固定數(shù)千到數(shù)十萬(wàn)個(gè)樣品，可以對(duì)數(shù)千個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)序。
2、便宜。本發(fā)明只需要數(shù)套測(cè)序引物組合，引物組合的套數(shù)與測(cè)序長(zhǎng)度相同，可以對(duì)大量的樣品進(jìn)行測(cè)序。
3、方便。本發(fā)明采取簡(jiǎn)并性引物延伸法測(cè)序，可以方便地測(cè)出引物一側(cè)8-9個(gè)堿基的序列。如果和特異性限制內(nèi)切酶結(jié)合使用可以測(cè)得更長(zhǎng)的序列。
4、準(zhǔn)確性高。


圖1是本發(fā)明的用含0個(gè)簡(jiǎn)并性核苷酸的引物延伸示意圖。X行代表引物鏈，和引物結(jié)合的區(qū)域?yàn)橐锝Y(jié)合區(qū)(在模板鏈中)；Y行代表模板鏈，？代表待測(cè)得序列，B*代表?yè)饺氲臉?biāo)記核苷酸。
圖2是本發(fā)明的用含1個(gè)簡(jiǎn)并性核苷酸的引物延伸示意圖。引物鏈中3’端有1個(gè)兼并性核苷酸(N)；經(jīng)過(guò)DNA聚合酶的聚合，和模板中第二位置的堿基(待測(cè)的堿基)互補(bǔ)的標(biāo)記核苷酸B*被共價(jià)摻入引物鏈。與B*互補(bǔ)的核苷酸即為模板中第二位置？的核苷酸。
圖3是本發(fā)明的用含2個(gè)簡(jiǎn)并性核苷酸的引物延伸示意圖。物鏈中3’端有2個(gè)兼并性核苷酸(NN)；經(jīng)過(guò)DNA聚合酶的聚合，和模板中第三位置的堿基(待測(cè)的堿基)互補(bǔ)的標(biāo)記核苷酸B*被共價(jià)摻入引物鏈。與B*互補(bǔ)的核苷酸即為模板中第三位置？的核苷酸。
圖4是本發(fā)明的用含7個(gè)簡(jiǎn)并性核苷酸的引物延伸示意圖。引物鏈中3’端有7個(gè)兼并性核苷酸(NNNNNNN)；經(jīng)過(guò)DNA聚合酶的聚合，和模板中第八位置的堿基(待測(cè)的堿基)互補(bǔ)的標(biāo)記核苷酸B*被共價(jià)摻入引物鏈。與B*互補(bǔ)的核苷酸即為模板中第八位置？的核苷酸。
圖5是本發(fā)明實(shí)施例2的芯片掃描結(jié)果圖。每個(gè)方陣有4行，從上至下分別為seq1，seq2，seq3和seq4。每個(gè)序列重復(fù)4次。A，C，G，T分別代表所加的標(biāo)記核苷酸，P1-P7代表seq5-seq11引物(和seq1-seq4雜交后延伸)。
圖6是本發(fā)明實(shí)施例2的熒光強(qiáng)度柱狀圖。圖中seq1、seq2、seq3和seq4分別為4個(gè)合成的模板，與材料方法中所列序列相對(duì)應(yīng)。X軸的數(shù)字1-7分別和所加入的測(cè)序引物seq5-seq11相對(duì)應(yīng)；Y軸為掃描后所得到的熒光強(qiáng)度。通過(guò)比較熒光強(qiáng)度可以在seq1中讀出序列CTACCTG；在seq2中讀出序列為GACGCAC；在seq3中讀出序列為T(mén)CGTCTG；在seq4中讀出AGGACTA。
圖7是本發(fā)明實(shí)施例3的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖。
圖8是本發(fā)明實(shí)施例3的芯片掃描結(jié)果圖。
圖9是本發(fā)明實(shí)施例3用Sanger法測(cè)序測(cè)序部分結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1一種用于確定未知核酸序列的核酸序列測(cè)定方法
A)在被測(cè)的DNA模板中引入一段已知的通用DNA序列，并使之固定于固相基質(zhì)上；B)設(shè)計(jì)1-15個(gè)寡核苷酸DNA引物組合，使其含有一段與上述加入的通用DNA序列互補(bǔ)的序列，并使該1-15個(gè)寡核苷酸DNA引物的3’端分別含有0、1、2、……、14個(gè)簡(jiǎn)并性核苷酸；C)根據(jù)待測(cè)核苷酸位點(diǎn)的位置，從上述引物組合中選擇一種引物，并將其與A中所述的固定DNA模板雜交，使待測(cè)核苷酸位點(diǎn)緊接著引物3’末端；D)用DNA聚合酶及用四種可分辨的標(biāo)記物標(biāo)記的雙脫氧核苷酸底物或分別用一種或幾種標(biāo)記物標(biāo)記的四種脫氧核苷酸或雙脫氧核苷酸，在雜交到模板上的引物上進(jìn)行一種核苷酸延伸；E)檢測(cè)D中被延伸核苷酸種類(lèi)，A中DNA模板被測(cè)堿基的種類(lèi)與延伸核苷酸種類(lèi)互補(bǔ)。
本實(shí)施例可以依次用含不同個(gè)數(shù)的簡(jiǎn)并性核苷酸的引物重復(fù)A-E操作，檢測(cè)不同位置核苷酸。
上述步驟D)所述的標(biāo)記的核苷酸為用于聚合酶延伸的標(biāo)記有熒光化學(xué)基團(tuán)的核苷酸。
標(biāo)記核苷酸的方法是通過(guò)生物素、地高辛連接，用于顯色反應(yīng)的酶或納米金顆粒標(biāo)記的抗體或親和素來(lái)標(biāo)記核苷酸。
上述步驟A)所述的固體基質(zhì)是指平板基質(zhì)、微孔板或微球。
上述步驟A)所述的被測(cè)的DNA模板為PCR產(chǎn)物，滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物，DNA質(zhì)?；蛎讣庸ず蟮腄NA片斷。
上述步驟A)所述的引入一段已知的通用DNA序列的方法可以是下列之一(1)通過(guò)DNA連接酶在待測(cè)的序列兩端加入接頭，該接頭為和引物雜交的已知序列；(2)將待測(cè)的DNA連接到載體中，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到單菌落克隆后進(jìn)行以插入DNA序列兩端的載體序列作為引物進(jìn)行PCR，從而使載體的一部分已知序列引入待測(cè)DNA序列；(3)對(duì)已知部分序列信息的待測(cè)DNA進(jìn)行測(cè)序，可直接以已知序列部分作為引物結(jié)合區(qū)，待測(cè)部分緊接著引物結(jié)合區(qū)。
下面結(jié)合圖1-圖4，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作出更為詳細(xì)的描述首先將待測(cè)的DNA樣品固定在生物芯片基片上，通過(guò)變性產(chǎn)生DNA單鏈模板。模板上有已知序列的引物結(jié)合區(qū)。待測(cè)的DNA序列為緊接著引物結(jié)合區(qū)5’方向一側(cè)的序列，如圖1中所示的標(biāo)有“？”的區(qū)域。
為了測(cè)得模板中緊接著引物結(jié)合區(qū)5’方向后第一個(gè)位置的堿基的種類(lèi)，用3’端緊接著待測(cè)位點(diǎn)的引物和模板雜交，然后用DNA聚合酶、標(biāo)記的雙脫氧核苷酸或脫氧核苷酸及反應(yīng)緩沖液延伸(見(jiàn)圖1)。延伸時(shí)可用四種不同標(biāo)記信號(hào)的雙脫氧核苷酸底物同時(shí)延伸；也可用一種標(biāo)記信號(hào)標(biāo)記的四種雙脫氧核苷酸或脫氧核苷酸分別進(jìn)行四次延伸。延伸后檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)記信號(hào)及堿基互補(bǔ)配對(duì)原則(即A和T，C和G互補(bǔ)配對(duì))，則第一個(gè)位置的堿基種類(lèi)可以確定。
為了測(cè)得模板中緊接著引物結(jié)合區(qū)5’方向后第二個(gè)位置的堿基的種類(lèi)，所用的引物包括兩個(gè)部分，一部分為和引物結(jié)合區(qū)的已知序列，一部分為和未知序列結(jié)合的區(qū)。因?yàn)橐锝Y(jié)合區(qū)5’方向后第一個(gè)位置的為未知序列，其種類(lèi)的可能性有四種。因此引物中和其對(duì)應(yīng)的堿基也有四種。在合成引物時(shí)該位置為簡(jiǎn)并性核苷酸，即該位置為含核苷酸A，G，C和T的混合物，如圖2所示用N來(lái)表示。當(dāng)該引物和待測(cè)模板雜交后，用標(biāo)記的核苷酸及DNA聚合酶延伸，由于DNA聚合酶的特異性選擇，當(dāng)標(biāo)記底物核苷酸和第二個(gè)位點(diǎn)的堿基互補(bǔ)時(shí)，標(biāo)記底物會(huì)摻入引物鏈(在圖2中用B*表示)，之后用檢測(cè)儀器檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)記物性質(zhì)或標(biāo)記核苷酸加入順序，就可以確定是何種堿基摻入引物鏈。
為了測(cè)得模板中緊接著引物結(jié)合區(qū)5’方向后第三個(gè)位置的堿基的種類(lèi)，用3’端有兩個(gè)簡(jiǎn)并性核苷酸的引物雜交，即有兩個(gè)N的引物和模板雜交。見(jiàn)圖3。之后用DNA聚合酶及標(biāo)記底物延伸，然后檢測(cè)。
如此類(lèi)推，當(dāng)測(cè)第四個(gè)堿基是用用3’端有三個(gè)簡(jiǎn)并性核苷酸的引物雜交，測(cè)第八個(gè)堿基時(shí)用3’端有七個(gè)簡(jiǎn)并性核苷酸的引物雜交(見(jiàn)圖4)。
由以上方法可知，本發(fā)明可以測(cè)得引物結(jié)合區(qū)一側(cè)特定位置堿基的種類(lèi)。為了測(cè)得待測(cè)位點(diǎn)的堿基種類(lèi)，可用方案一將待測(cè)模板分成若干份，固定在芯片的不同位置上，或幾張重復(fù)制作的芯片上。每個(gè)位置分別用含有不同個(gè)數(shù)的簡(jiǎn)并性引物雜交后延伸，可以同時(shí)獲得待測(cè)的不同位置的堿基種類(lèi)的信息。也可以用方案二先用其中的一種引物和固定的模板雜交后延伸，待檢測(cè)后通過(guò)變性處理使引物鏈和模板鏈分離，然后加入第二種引物雜交后延伸，如此反復(fù)進(jìn)行多次。以上提供的方法可以非常方便的測(cè)出引物結(jié)合區(qū)一側(cè)10個(gè)左右的堿基序列的信息。為了測(cè)出更長(zhǎng)的堿基序列，可以結(jié)合限制性?xún)?nèi)切酶的酶切位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序。也就是測(cè)定特定酶切位點(diǎn)一側(cè)的序列，酶切位點(diǎn)一般具有4-6個(gè)特定堿基組成的序列，因此可以有效地增加測(cè)序的長(zhǎng)度。
本發(fā)明提供的測(cè)序方法是將待測(cè)的雙鏈DNA樣品共價(jià)固定到生物芯片基質(zhì)上。生物芯片基質(zhì)是指平板基質(zhì)(如玻璃片、硅片、凝膠層、塑料、橡膠、陶瓷、硝酸纖維素膜、尼龍膜等)、微孔板(如塑料板、金屬板、橡膠板、玻璃板等)、和微球(如親和素包被的磁珠)。有多種方法可以將DNA樣品固定至生物芯片的片基表面。首先，將生物芯片基片進(jìn)行修飾，使其表面帶有醛基、氨基、巰基、羧基、環(huán)氧基等或其他活性基團(tuán)，或用鏈霉親和素、親和素等包被，然后將用氨基、生物素、磷酸基或巰基等修飾DNA分子點(diǎn)至基片上，將其連接到修飾過(guò)的芯片基片上；如醛基修飾的基片可以和氨基修飾的DNA反應(yīng)，羧基修飾的基片在催化劑如EDC存在下和氨基修飾得DNA反應(yīng)；對(duì)于微球來(lái)說(shuō)常用的為鏈霉親和素包被的磁珠，將修飾有生物素的DNA和微球在小離心管中混合，放置一段時(shí)間后DNA會(huì)結(jié)合到磁珠表面。
被測(cè)得DNA序列含有一段已知序列用于和測(cè)序引物雜交。該序列的引入有多種方法例如通過(guò)DNA連接酶在待測(cè)的序列兩端加入接頭，接頭可作為和引物雜交的序列；將待測(cè)的DNA連接到載體中，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到單菌落克隆后進(jìn)行以插入DNA序列兩端的載體序列作為引物進(jìn)行PCR，從而使載體的一部分已知序列引入待測(cè)DNA序列。對(duì)已知序列信息的待測(cè)DNA進(jìn)行再測(cè)序，可直接以已知序列部分作為引物結(jié)合區(qū)，待測(cè)部分緊接著引物結(jié)合區(qū)。
被測(cè)的DNA模板為PCR產(chǎn)物，如PCR產(chǎn)物固定至芯片基質(zhì)后，通過(guò)高溫或加入變性劑如NaOH，甲酰胺，尿素等變性DNA雙連，使沒(méi)有連接到基質(zhì)的鏈分離。被測(cè)的DNA模板也可為滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物，如將DNA模板用DNA連接酶成環(huán)，然后用5’端修飾的引物和模板環(huán)雜交，雜交后通過(guò)引物將雜交產(chǎn)物固定在芯片基質(zhì)上，然后加入持續(xù)合成能力很強(qiáng)的DNA合成酶如phi29 DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶及dNTP底物進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，也可以先將引物固定后再和模板形成的環(huán)雜交，然后延伸或?qū)L環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物直接固定在基質(zhì)上。被測(cè)的DNA模板也可以為DNA質(zhì)粒，酶加工后的DNA片斷等。
本測(cè)序過(guò)程涉及到引物和模板的退火、聚合酶延伸反應(yīng)來(lái)檢測(cè)核苷酸是否摻入。在本發(fā)明中待測(cè)的DNA樣品作為引物、聚合酶延伸的模板。任何已知的或適用的DNA聚合酶可以被用；在模板為RNA時(shí)，聚合酶為反轉(zhuǎn)錄聚合酶。底物核苷酸為任何可以用于聚合酶延伸的核苷酸，例如脫氧核苷酸dATP，dCTP，dGTP，dTTP，雙脫氧核苷酸；雙脫氧核苷酸是指3’-OH不存在或被修飾，它可以被聚合酶摻入到引物鏈中但不能繼續(xù)延長(zhǎng)，如ddATP，ddCTP，ddGTP，ddTTP。核苷酸被標(biāo)記以方便核苷酸摻入的檢測(cè)；一種或多種核苷酸被用，如Cy3，Cy5，TexasRed，F(xiàn)RET，F(xiàn)ITC等標(biāo)記的核苷酸。核苷酸的標(biāo)記及檢測(cè)方法如一些文獻(xiàn)所示，主要是一些熒光染料，如熒光素、花青素、羅丹明等，也可以通過(guò)生物素、地高辛等連接納米金顆粒標(biāo)記的抗體或親和素等來(lái)標(biāo)記核苷酸。因?yàn)闊晒鈽?biāo)記和熒光檢測(cè)是研究最為成熟的方法，為了方便起見(jiàn)，熒光為本發(fā)明主要標(biāo)記及檢測(cè)方法，但不排除其他標(biāo)記和檢測(cè)方法。將引物和固定在基質(zhì)的模板雜交是將引物溶解在溶液如2XSSC或TE溶液中，使終濃度為1微摩爾到100微摩爾都可。溶有引物的溶液加到已固定有模板的基質(zhì)上，在濕盒或微量離心管中孵育5分鐘至數(shù)小時(shí)，孵育溫度一般在37℃或其它溫度。之后用洗滌液洗滌，以洗掉未雜交上的引物。延伸反應(yīng)體系包括DNA聚合酶及酶緩沖液如klenow DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶等，標(biāo)記的核苷酸，有時(shí)還加入BSA，單鏈結(jié)合蛋白等。延伸溫度在37℃-72℃都可，延伸時(shí)間可以為半分鐘至數(shù)分鐘。延伸反應(yīng)可通過(guò)將芯片放入洗滌液或加入50mM EDTA溶液終止，洗滌后用芯片掃描儀或其它檢測(cè)儀器檢測(cè)。
實(shí)施例2對(duì)人工合成的DNA模板進(jìn)行測(cè)序以下DNA序列由invitrogen公司合成Seq15’NH2-(T)25 TT CTC AGG TAGAGT TGG AGC TCA GGA CAT GGC ATSeq25’NH2-(T)25 TT ACG TGC GTCAGT TGG AGC TCA GGA CTG GGC TGSeq35’NH2-(T)25 TT GTC AGA CGAAGT TGG AGC TCA GGA ATA CTT ATSeq45’NH2-(T)25 TT AGT CCTAGT TGG AGC TCA GGA TCC TTG GASeq55’-CTGAGCTCCAACT 3’Seq65’-TGAGCTCCAACTN 3’Seq75’-GAGCTCCAACTNN 3’Seq85’-GAGCTCCAACTNNN3’Seq95’-AGCTCCAACTNNNN3’
Seq105’-GCTCCAACTNNNNN 3’Sequ115’-CTCCAACTNNNNNN 3’Seq1-seq4作為DNA模板，seq5-seq11為測(cè)序引物。模板序列中傾斜加粗的部分為引物結(jié)合區(qū)，下劃線部分為待測(cè)序列，NH2表示為氨基修飾。N為簡(jiǎn)并性核苷酸，在化學(xué)合成DNA模板時(shí)該位置同時(shí)加入四種合成DNA的底物。Cy5-dATP，Cy5-dCTP，Cy5-dGTP and Cy5-dUTP購(gòu)自Perkin Elmer公司。Therminator DNA聚合酶購(gòu)自NEB公司。聚丙烯酸(Poly(acrylic acid，sodiumsalt))購(gòu)自Sigma公司。
1、基片的制備(1)玻片的清潔用1M的NaOH浸泡玻片1小時(shí)，雙蒸水沖洗干凈，再用重鉻酸(重鉻酸鉀+濃硫酸)浸泡12小時(shí)，雙蒸水多次沖洗去凈殘酸。
(2)氨基片的處理先用95％乙醇洗滌玻片，吹干；用3％的硅烷乙醇溶液(3ml氨基硅烷加95％乙醇至終體積100ml)浸泡玻片30分鐘或超聲波浸泡15分鐘；用95％乙醇洗凈，再用雙蒸水洗凈，吹干，110℃烘30分鐘。
(3)羧基片的處理氨基硅烷化的玻片用Poly(acrylic acid，sodium salt)2mg/ml水溶液(配制Poly(acrylic acid，sodium salt)35wt％solutionin water 572ul加雙蒸水至100ml)浸泡20分鐘，雙蒸水洗滌三次，吹干。
2、模板的固定5’端氨基修飾的模板溶解在0.1M Mes緩沖液(2-(N-嗎啉代)乙磺酸)，pH5.1，溶液中含有5mM EDC(1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺)，使模板的終濃度為5微摩爾。通過(guò)點(diǎn)樣儀將氨基修飾的模板點(diǎn)至羧基處理的玻片上，每個(gè)模板重復(fù)點(diǎn)四次，四個(gè)模板為一方陣，共點(diǎn)28個(gè)方陣。在室溫下放置于封閉的濕盒中三個(gè)小時(shí)。然后用去離子水洗滌5分鐘，然后用2×SSC/0.2％SDS溶液洗滌5分鐘，再用0.2×SSC洗滌5分鐘，最后用蒸餾水洗滌5分鐘后用氮?dú)獯蹈伞?br> 3、聚合酶介導(dǎo)的引物延伸反應(yīng)終濃度為50uM的引物(溶于2×SSC/0.2％SDS)加到含有測(cè)序模板的點(diǎn)陣上，每4個(gè)方陣加一種引物，分別加入seq5-seq11和模板退火。退火反應(yīng)在42℃反應(yīng)30分鐘。然后用2×SSC/0.2％SDS洗液洗滌后吹干。四個(gè)加有相同引物的方陣分別加入含有0.4uM Cy5-dATP，Cy5-dCTP，Cy5-dGTP and Cy5-dUTP延伸反應(yīng)液。延伸反應(yīng)液包括Cy5修飾的核苷酸底物，0.5U Therminator DNA聚合酶，聚合酶緩沖液。反應(yīng)在60℃反應(yīng)2分鐘。用50mM EDTA終止反應(yīng)，洗滌后吹干。然后用芯片掃描儀掃描。
結(jié)果以Seq1-seq4作為DNA模板，當(dāng)用seq5作為測(cè)序引物和它們雜交后，用DNA聚合酶延伸標(biāo)記的核苷酸，在seq1中可以被聚合酶摻入的堿基為C；seq2為G；seq3為T(mén)；seq4為A；從掃描后結(jié)果如圖6可以看出，在seq1中X軸為1的A、C、G、T四個(gè)熒光強(qiáng)度中C的強(qiáng)度最高。在seq2中X軸為1的A、C、G、T四個(gè)熒光強(qiáng)度中G的強(qiáng)度最高。在seq3中X軸為1的A、C、G、T四個(gè)熒光強(qiáng)度中T的強(qiáng)度最高。在seq4中X軸為1的A、C、G、T四個(gè)熒光強(qiáng)度中A的強(qiáng)度最高。
當(dāng)seq6作為測(cè)序引物和Seq1-seq4雜交后，X軸為2中熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的分別為seq1T；seq2A；seq3C；seq4G。
當(dāng)seq7作為測(cè)序引物和Seq1-seq4雜交后，X軸為3中熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的分別為seq1A；seq2C；seq3G；seq4G。
當(dāng)seq8作為測(cè)序引物和Seq1-seq4雜交后，X軸為4中熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的分別為seq1C；seq2G；seq3T；seq4A。
當(dāng)seq9作為測(cè)序引物和Seq1-seq4雜交后，X軸為5中熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的分別為seq1C；seq2C；seq3C；seq4C。
當(dāng)seq10作為測(cè)序引物和Seq1-seq4雜交后，X軸為6中熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的分別為seq1T；seq2A；seq3T；seq4T。
當(dāng)seq11作為測(cè)序引物和Seq1-seq4雜交后，X軸為7中熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的分別為seq1G；seq2C；seq3G；seq4A。
由結(jié)果可知本方法可以準(zhǔn)確地測(cè)出引物一側(cè)數(shù)個(gè)堿基的種類(lèi)。
實(shí)施例3對(duì)T7噬菌體DNA文庫(kù)克隆進(jìn)行測(cè)序材料T7噬菌體DNA購(gòu)自上海生物工程公司；Tsp509 I購(gòu)自NEB公司；pUC118載體、感受態(tài)細(xì)菌及轉(zhuǎn)化試劑盒、T4DNA連接酶購(gòu)自大連寶生物公司；klenow DNA聚合酶購(gòu)自fermentas公司；以下序列訂購(gòu)自invitrogen公司M13前引物NH-CAGGAAACAGCTATGAC(seq12)；M13后引物GTAAAACGACGGCCAGT(seq13)；測(cè)序引物GCATGCCTGCAGGTCAATT(seq14)；CATGCCTGCAGGTCAATTN(seq15)；ATGCCTGCAGGTCAATTNN(seq16)；ATGCCTGCAGGTCAATTNNN(seq17)；TGCCTGCAGGTCAATTNNNN(seq18)；實(shí)驗(yàn)步驟1、將T7噬菌體DNA用Tsp509 I進(jìn)行酶切，反應(yīng)體系為T(mén)7噬菌體DNA 2μgTsp509 I(10U/μl)0.5μlTsp509 I反應(yīng)緩沖液(10×)2μlH2O 17.5μl65℃，2小時(shí)；酶切產(chǎn)物用天為公司的PCR純化試劑盒純化。
2、用klenow DNA聚合酶補(bǔ)齊粘性末端為平端，反應(yīng)體系為純化的T7噬菌體DNA酶切片斷 20μlklenow DNA聚合酶(10U/μl) 0.5μldNTP(10mM)0.5μl37℃，2小時(shí)；然后70℃，15分鐘失活。
DNA聚合酶補(bǔ)齊的產(chǎn)物用天為公司的PCR純化試劑盒純化。
3、將T7 DNA平端片斷和pUC118連接純化的T7噬菌體DNA酶切片斷20μlT4 DNA連接酶 1μlT4 DNA連接酶反應(yīng)緩沖液(10×) 2μl16℃，2小時(shí)；然后70℃，15分鐘失活。
(4)將連接的載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌方法按大連寶生物轉(zhuǎn)化試劑盒提供的步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
(5)將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌進(jìn)行平板培養(yǎng)將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌涂布在LB固體培養(yǎng)基(含50μg/ml氨芐青霉素)過(guò)夜培養(yǎng)。
(6)挑一單菌落進(jìn)行菌液PCR挑單個(gè)菌落在LB液體培養(yǎng)基(含50μg/ml氨芐青霉素)培養(yǎng)4個(gè)小時(shí)，取0.5μl加入PCR反應(yīng)液中菌液0.5μldNTP(10mM)1μlTaq DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液(10×) 5μlTaq DNA聚合酶(5U/μl) 1μlM13前引物(10μM) 2μlM13后引物(10μM) 2μlH2O38.5μl反應(yīng)條件94℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完畢用天為公司的PCR純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物。在純化的最后一步中用去離子水代替洗脫液。用1％的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳進(jìn)行檢測(cè)。
(7)模板的固定5’端氨基修飾的模板溶解在0.1M Mes緩沖液(2-(N-嗎啉代)乙磺酸)，pH5.1，溶液中含有5mM EDC(1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺)。將模板點(diǎn)至羧基處理的玻片上，每個(gè)模板重復(fù)點(diǎn)4次，四個(gè)模板為一方陣，共點(diǎn)28個(gè)方陣。在室溫下放置于封閉的濕盒中三個(gè)小時(shí)。然后用去離子水洗滌5分鐘，然后用2×SSC/0.2％SDS溶液洗滌5分鐘，再用0.2×SSC洗滌5分鐘，最后用蒸餾水洗滌5分鐘后用氮?dú)獯蹈?。將固定有PCR產(chǎn)物的基片浸入沸水中10分鐘，變性DNA雙鏈，從而單鏈模板。
(8)聚合酶介導(dǎo)的引物延伸反應(yīng)終濃度為50uM的引物(溶于2×SSC/0.2％SDS)加到含有測(cè)序模板的點(diǎn)陣上，每4個(gè)方陣加一種引物，分別加入測(cè)序模板seq14-seq18和模板退火。退火反應(yīng)在42℃反應(yīng)30分鐘。然后用2×SSC/0.2％SDS洗液洗滌后吹干。四個(gè)加有相同引物的方陣分別加入含有0.4uM Cy5-dATP，Cy5-dCTP，Cy5-dGTP和Cy5-dUTP延伸反應(yīng)液。延伸反應(yīng)液包括Cy5修飾的核苷酸底物，0.5U Therminator DNA聚合酶，聚合酶緩沖液。反應(yīng)在60℃反應(yīng)2分鐘。用50mM EDTA終止反應(yīng)，洗滌后吹干。然后用芯片掃描儀掃描。
結(jié)果
1、PCR反應(yīng)產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果T7噬菌體DNA用Tsp509 I進(jìn)行酶切，產(chǎn)生AATT的粘性末端；然后插入pUC118載體中后轉(zhuǎn)化并挑取克隆，然后用M13引物擴(kuò)增插入載體中的序列。T7DNA插入的部位及插入兩側(cè)序列如下NH2-CAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTC↓AATTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN AAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTAC劃線部分為M13引物；箭頭為T(mén)7DNA在載體中插入部位位；劃框的部分為測(cè)序引物結(jié)合區(qū)；↓AATTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAATT↓為插入序列。
參照?qǐng)D7，1-8道為PCR產(chǎn)物，分子量為330bp，第9道為分子量marker從下至上依次為100，250，500，750，1000，2000bp。
2、用含簡(jiǎn)并性引物延伸測(cè)序結(jié)果用測(cè)序引物seq14-seq18分別和模板雜交后分別用Cy5-dATP，Cy5-dCTP，Cy5-dGTPand Cy5-dUTP延伸，結(jié)果見(jiàn)圖9。可以從圖中讀出序列AACAC；加上已知的AATT酶切位點(diǎn)則序列為AATTAACAC；模板鏈則為GTGTTAATT。
參照?qǐng)D8，PCR產(chǎn)物被固定在基片上，每個(gè)點(diǎn)陣中重復(fù)點(diǎn)4次。P1-P5分別為測(cè)序引物，分別與seq14-seq18相對(duì)應(yīng)。A，C，G，T分別代表所加的標(biāo)記核苷酸。
3、用sanger法測(cè)序驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果。
將PCR產(chǎn)物純化后送至invitrogen公司用sanger法測(cè)序。該P(yáng)CR產(chǎn)物序列如下CCGGGGATCCTCTAGAGTCAATTGGACAAAATGCCAGCACTTCCGGCTAAAGGTAACTTGAACCTCCGTGACATCTTAGAGTCGGACTTCGCGTTCGCGTAACGCCAAATCAATACGACTCACTATAGAGGGACAAACTCAAGGTCATTCGCAAGAGTGGCCTTTATGATTGACCTTCTTCCGGTTAATACGACTCACTATAGGAGAACCTTAAGGTTTAACTTTAAGACCCTTAAGTGTTAATTGACC(seq19)可以查出末端部分序列為GTGTTAATT。與用含簡(jiǎn)并性引物延伸測(cè)序結(jié)果一致。
由圖10可以讀出靠近末端的序列為GTGTTAATTGACC。
權(quán)利要求
1.一種用于確定未知核酸序列的核酸序列測(cè)定方法，其特征在于A)在被測(cè)的DNA模板中引入一段已知的通用DNA序列，并使之固定于固相基質(zhì)上；B)設(shè)計(jì)1-15個(gè)寡核苷酸DNA引物組合，使其含有一段與上述加入的通用DNA序列互補(bǔ)的序列，并使該1-15個(gè)寡核苷酸DNA引物的3’端分別含有0、1、2、……、14個(gè)簡(jiǎn)并性核苷酸；C)根據(jù)待測(cè)核苷酸位點(diǎn)的位置，從上述引物組合中選擇一種引物，并將其與A中所述的固定DNA模板雜交，使待測(cè)核苷酸位點(diǎn)緊接著引物3’末端；D)用DNA聚合酶及用四種可分辨的標(biāo)記物標(biāo)記的雙脫氧核苷酸底物或分別用一種或幾種標(biāo)記物標(biāo)記的四種脫氧核苷酸或雙脫氧核苷酸，在雜交到模板上的引物上進(jìn)行一種核苷酸延伸；E)檢測(cè)D中被延伸核苷酸種類(lèi)，A中DNA模板被測(cè)堿基的種類(lèi)與延伸核苷酸種類(lèi)互補(bǔ)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸序列測(cè)定方法，其特征在于依次用含不同個(gè)數(shù)的簡(jiǎn)并性核苷酸的引物重復(fù)A-E操作，檢測(cè)不同位置核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的核酸序列測(cè)定方法，其特征在于步驟D)所述的標(biāo)記的核苷酸為用于聚合酶延伸的標(biāo)記有熒光化學(xué)基團(tuán)的核苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸序列測(cè)定方法，其特征在于通過(guò)生物素、地高辛連接，用于顯色反應(yīng)的酶或納米金顆粒標(biāo)記的抗體或親和素來(lái)標(biāo)記核苷酸。
5.如權(quán)利要求1所述的核酸序列測(cè)定方法，其特征在于步驟A)所述的固體基質(zhì)是指平板基質(zhì)、微孔板或微球。
6.如權(quán)利要求1的核酸序列測(cè)定方法，其特征在于步驟A)所述的被測(cè)的DNA模板為PCR產(chǎn)物，滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物，DNA質(zhì)?；蛎讣庸ず蟮腄NA片斷。
7.如權(quán)利要求1的核酸序列測(cè)定方法，其特征在于步驟A)所述的引入一段已知的通用DNA序列的方法是通過(guò)DNA連接酶在待測(cè)的序列兩端加入接頭，該接頭為和引物雜交的已知序列。
8.如權(quán)利要求1的核酸序列測(cè)定方法，其特征在于步驟A)所述的引入一段已知的通用DNA序列的方法是將待測(cè)的DNA連接到載體中，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到單菌落克隆后進(jìn)行以插入DNA序列兩端的載體序列作為引物進(jìn)行PCR，從而使載體的一部分已知序列引入待測(cè)DNA序列；
9.如權(quán)利要求1的核酸序列測(cè)定方法，其特征在于步驟A)所述的引入一段已知的通用DNA序列的方法是對(duì)已知部分序列信息的待測(cè)DNA進(jìn)行測(cè)序，可直接以已知序列部分作為引物結(jié)合區(qū)，待測(cè)部分緊接著引物結(jié)合區(qū)。
全文摘要
核酸序列測(cè)定方法在被測(cè)的DNA模板中引入一段已知的DNA序列，使之固定于固相基質(zhì)上；設(shè)計(jì)1－15個(gè)寡核苷酸DNA引物組合，使其含有一段與上述加入的DNA序列互補(bǔ)的序列，使該1－15個(gè)寡核苷酸DNA引物的3’端分別含有0、1、2、……、14個(gè)簡(jiǎn)并性核苷酸；根據(jù)待測(cè)核苷酸位點(diǎn)的位置，從上述引物組合中選擇一種引物，將其與固定DNA模板雜交，使待測(cè)核苷酸位點(diǎn)挨著引物3’末端；用DNA聚合酶及用四種可分辨的標(biāo)記物標(biāo)記的雙脫氧核苷酸底物或分別用一種或幾種標(biāo)記物標(biāo)記的四種脫氧核苷酸或雙脫氧核苷酸，在雜交到模板上的引物上進(jìn)行核苷酸延伸；檢測(cè)被延伸核苷酸種類(lèi)，DNA模板被測(cè)堿基的種類(lèi)與延伸核苷酸種類(lèi)互補(bǔ)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1940088SQ20061009670
公開(kāi)日2007年4月4日 申請(qǐng)日期2006年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月10日
發(fā)明者施小龍, 唐超, 陸祖宏 申請(qǐng)人:東南大學(xué)