專利名稱：豬鏈球菌次黃嘌呤核苷酸脫氫酶基因的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及豬鏈球菌(Streptococcus suis，SS)次黃嘌呤核苷酸脫氫酶(IMPDH)基因的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬鏈球菌(Streptococcus suis，SS)病是分布范圍極廣的豬傳染病，可引起青年豬患腦膜腦炎、胸膜炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥及新生仔豬突然死亡，豬鏈球菌2型(SS2)還可感染人，是一種重要的人畜共患傳染病。豬鏈球菌目前分為35個血清型(1～34型及1/2型)，其中2型流行最廣，對豬的致病性亦最強(qiáng)。1998年江蘇南通和2005年四川資陽引起人豬死亡的病原即為SS2。
在SS2中，可區(qū)分為強(qiáng)毒株、弱毒株和無毒株，已發(fā)現(xiàn)的毒力因子主要包括溶菌酶釋放蛋白(MRP)、胞外蛋白因子(EF)、溶血素(SLY)、new orf2、纖粘蛋白(Fn)、莢膜多糖(CPS)、纖維蛋白原結(jié)合蛋白(FBP)、谷氨酸脫氫酶(GDH)、分泌型核酸(SSnA)和三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)。其中MRP和EF通常被認(rèn)為是豬鏈球菌2型的兩個毒力標(biāo)志因子，強(qiáng)毒株毒力因子表現(xiàn)型為MRP+EF+，弱毒株為MRP+EF*(EF類似物)，無毒株為MRP-EF-，但兩種毒力因子不能完全解釋強(qiáng)弱毒株的差異，在加拿大從發(fā)病豬身上分離到的菌株，大部分兩者都為陰性。而且試驗亦證明，強(qiáng)毒株人為缺失MRP和EF后，仍對仔豬致病。所以對SS2的毒力因子及致病機(jī)制的研究一直是熱門話題，是防制SS2的重點。
三、發(fā)現(xiàn)內(nèi)容技術(shù)問題 本發(fā)明的目的在于豬鏈球菌(Streptococcus suis，SS)次黃嘌呤核苷酸脫氫酶(IMPDH)基因的應(yīng)用，通過設(shè)計引物，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化獲得重組菌，并獲得體外高效表達(dá)IMPDH蛋白。
技術(shù)方案豬鏈球菌次黃嘌呤核苷酸脫氫酶基因的應(yīng)用，該豬鏈球菌次黃嘌呤核苷酸脫氫酶基因為在GenBank登陸的IMPDH序列，序列號為DQ097893。上述重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建過程如下1)獲取IMPDH目的基因并克隆入pMD18-T載體根據(jù)GenBank登陸的IMPDH序列，序列號為DQ097893，利用DNAStar軟件分析，選取IMPDH基因3’端2238-3194bp，設(shè)計一對特異性引物P15′-ctggaattctgtttgagtcttgctccc-3′ (EcoR I)P25′-ttcctcgagctgttgcttgaactggt-3′ (Xho I)引物兩端分別加限制性酶切位點EcoR I和Xho I及保護(hù)性堿基，下劃線部分為酶切位點；PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min，94℃30s，60℃30s，72℃60s共30個循環(huán)，最后72℃延伸10min，以雙蒸水為陰性對照；該引物在豬鏈球菌血清中擴(kuò)增，獲取IMPDH目的基因，將回收PCR產(chǎn)物4.5μl，與pMD18-T 0.5μl和Solution I 5.0μl，混勻后，4℃連接過夜，用于轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個菌落進(jìn)行過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用EcoR I、Xho I雙酶切，37℃水浴2小時，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可以看到一條792bp的條帶出現(xiàn)，將雙酶切鑒定陽性的細(xì)菌測序，獲得pMD18-T載體質(zhì)粒。
2)重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-IMPDH的構(gòu)建和鑒定將已測序鑒定的載體質(zhì)粒pMD18-T和載體pET32a(+)，用EcoR I和Xho I雙酶切，電泳后，回收目的片段和pET32a(+)，然后用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，用氨芐青霉素板篩選，挑取細(xì)菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和PCR鑒定，將見到792bp目的條帶，陽性重組質(zhì)粒命名為pET32a-IMPDH，即為所獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-IMPDH。
將重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-IMPDH基因轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)，獲得重組菌。所獲得的重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得體外表達(dá)IMPDH蛋白。
有益效果 本發(fā)明的特點和優(yōu)點如下1、本發(fā)明基于GenBank豬鏈球菌2型5個主要毒力因子MRP、EF、SLY、New ORF2和FBP報道序列，分別在其上下游500bp左右設(shè)計引物，應(yīng)用不同引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序，對毒力因子進(jìn)行基因定位，并且在這些毒力因子基因中找到了一新的完整閱讀框IMPDH基因。該基因登陸號為DQ097893。
2、本發(fā)明對IMPDH基因進(jìn)行克隆表達(dá)，驗證了其生物學(xué)活性。利用PCR技術(shù)，設(shè)計一對特異性引物，獲取目的基因克隆入pMD18-T載體，目的片段再經(jīng)酶切后克隆入pET32a載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-IMPDH，轉(zhuǎn)化獲得重組菌。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得體外高效表達(dá)IMPDH蛋白。體外表達(dá)蛋白經(jīng)鎳柱親合層析純化后活性染色，證實了該蛋白具有IMPDH生物學(xué)活性，該蛋白作用于人喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞(HEp-2)，可明顯改變其細(xì)胞周期。
3、本發(fā)明設(shè)計一對特異性引物，該引物在豬鏈球菌35個血清型中擴(kuò)增，可發(fā)現(xiàn)IMPDH基因廣泛存在于豬鏈球菌當(dāng)中(圖6)，檢測了IMPDH基因在豬鏈球菌35個血清型中的分布，該基因廣泛存在于不同血清型中，并且大多為致病血清型。。
4、本發(fā)明還涉及該基因及其編碼蛋白在SS致病機(jī)理及免疫等方面的應(yīng)用。選取IMPDH基因抗原性較強(qiáng)并且含功能結(jié)構(gòu)域的一段基因進(jìn)行體外表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物具有良好的抗原性和生物學(xué)活性，結(jié)果顯示其在豬鏈球菌病的快速診斷及免疫上具有應(yīng)用價值。IMPDH編碼蛋白可明顯改變細(xì)胞的周期，提示IMPDH有可能為一個新的SS毒力因子，為進(jìn)一步闡明SS的致病機(jī)理，尤其是SS2，提供了更豐富的依據(jù)。
四

圖1pET32a-IMPDH重組質(zhì)粒圖譜表達(dá)式為-ori-PT7-IMPDHgene-Amp gene-，它含有大腸桿菌復(fù)制子ori、PT7是T7RNA聚合酶/啟動子表達(dá)系統(tǒng)、外源目的基因IMPDH的部分基因，抗性篩選基因為氨芐青霉素Amp基因。
圖2IMPDH目的基因擴(kuò)增片段圖3IMPDH目的基因在豬鏈球菌35個標(biāo)準(zhǔn)血清型中的分布A泳道1～17分別為豬鏈球菌1～18血清型(12缺失)泳道18為DL-2000MarkerB泳道1～16分別為豬鏈球菌19～34及1/2血清型(20缺失)；泳道17為DL-2000MarkerIMPDH基因分別存在于1、2、3、4、5、6、7、9、11、14、16、18、19、21、23、25、26、27、29、30、31血清型中圖4pMD18-T載體克隆的EcoR I、Xho I雙酶切鑒定圖譜圖5表達(dá)重組質(zhì)粒pET32a-IMPDH的酶切鑒定圖譜圖6重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-IMPDH體外表達(dá)的SDS-PAGE圖譜泳道1為空pET32a載體誘導(dǎo)蛋白；泳道2為表達(dá)重組質(zhì)粒pET32a-IMPDH 0h誘導(dǎo)表達(dá)泳道3為pET32a-IMPDH 4h誘導(dǎo)表達(dá)；泳道4、5為表達(dá)蛋白超聲破碎后上清；泳道6、7為鎳柱純化蛋白圖7表達(dá)蛋白的免疫轉(zhuǎn)印鑒定8IMPDH活性染色反應(yīng)模式9表達(dá)蛋白活性染色圖五具體實施方式
1.獲取IMPDH目的基因并克隆入pMD18-T載體根據(jù)GenBank登陸的IMPDH序列(序列號DQ097893)，利用DNAStar軟件分析，選取IMPDH基因3’端2238-3194bp(IMPDH C-端抗原性較強(qiáng)的319個氨基酸)，自行設(shè)計一對特異性引物，引物兩端分別加限制性酶切位點EcoR I和Xho I及保護(hù)性堿基(TaKaRa公司合成)，下劃線部分為酶切位點。
P15′-ctggaattctgtttgagtcttgctccc-3′ (EcoR I)P25′-ttcctcgagctgttgcttgaactggt-3′ (Xho I)PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min，94℃30s，60℃30s，72℃60s共30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。以雙蒸水為陰性對照。(圖2)該引物在豬鏈球菌35個血清型中擴(kuò)增，可發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于豬鏈球菌當(dāng)中(圖3)。
將回收SS2的PCR產(chǎn)物4.5μl，與載體pMD18-T0.5μl和Solution I5.0μl，混勻后，4℃連接過夜，用于轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個菌落進(jìn)行過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用EcoR I、Xho I雙酶切，37℃水浴2小時，瓊脂糖凝膠電泳可以看到長度為2692bp的載體pMD18-T片段和792bp的插入目的片段條帶出現(xiàn)(圖4)，表明陽性克隆(pMD18-T-IMPDH)構(gòu)建成功。將陽性克隆(pMD18-T-IMPDH)重阻菌寄出，由大連寶生物公司進(jìn)行序列測定，結(jié)果此序列與模板序列相比較，核苷酸同源性為100％，獲得pMD18-T-IMPDH載體質(zhì)粒。
6.重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-IMPDH的構(gòu)建和鑒定將已測序鑒定的重組克隆質(zhì)粒pMD18-T-IMPDH和空載體pET32a(+)，用EcoR I和Xho I雙酶切，電泳后，回收目的片段和pET32a(+)，然后用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，用氨芐青霉素板篩選，挑取細(xì)菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，可見插入的792bp的目的條帶(圖5)，表明陽性克隆(pET32-IMPDH)構(gòu)建成功。將陽性重組質(zhì)粒命名為pET32a-IMPDH。
7.重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-IMPDH的表達(dá)和免疫轉(zhuǎn)印將陽性重組菌菌液以2％的比例接種與LB(Amp+)液體培養(yǎng)基中，37℃、180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)2小時后加入終濃度為1mmol/ml異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分別收集0h、2h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h的菌液。樣品用10％SDS-PAGE鑒定，表達(dá)產(chǎn)物誘導(dǎo)2小時時即可產(chǎn)生分子量約48kD的目的條帶，4小時達(dá)最高峰。取4小時的培養(yǎng)物超聲波處理，12,000r/min、4℃離心5min分離上清和沉淀，用10％SDS-PAGE鑒定，表達(dá)蛋白以可溶形式存在于上清當(dāng)中(圖6)。進(jìn)行免疫轉(zhuǎn)印，SS2免疫豬制備的多抗為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG為二抗，二氨基聯(lián)苯氨(DAB)顯色試劑盒顯色，在醋酸纖維素膜上可見48kD目的條帶的印跡(圖7)，表明表達(dá)產(chǎn)物具有良好的免疫原性，能與SS2全菌制備的抗血清反應(yīng)。結(jié)果顯示其在豬鏈球菌病的快速診斷及免疫上具有應(yīng)用價值。
8.IMPDH表達(dá)蛋白經(jīng)鎳柱純化后，測定蛋白濃度參照Novagen公司His·bindpurification kit的說明書，IMPDH表達(dá)蛋白經(jīng)鎳柱純化后，測定該蛋白濃度為2.0mg/ml。
9.IMPDH活性染色純化后的表達(dá)蛋白用3％濃縮膠，7％分離膠非變性PAGE電泳。把膠放入下列反應(yīng)混合物中(總體積25ml)50mM Tris-HCl(pH 7.5)，20mM次黃嘌呤(IMP)，0.3mg/ml氯化氮藍(lán)四唑(NBT)，0.05mg/ml吩嗪硫酸甲酯(PMS)，0.01mol/L KCl及0.5mM氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)。反應(yīng)結(jié)束后7％乙酸漂洗數(shù)次。結(jié)果表達(dá)蛋白能催化IMP反應(yīng)生成XMP，該反應(yīng)為鳥嘌呤核苷酸(GTP)經(jīng)典合成途徑的限速反應(yīng)，IMPDH為其限速酶，反應(yīng)依賴NAD+的參加。吩嗪硫酸甲酯(PMS)和氯化氮藍(lán)四唑(NBT)均為接受電子的染料，IMPDH與底物染色液在37℃保溫，脫下的氫最后傳遞給NBT生成不溶于水的藍(lán)紫色的還原型氯化氮藍(lán)四唑(NBTH2)，顯色反應(yīng)如圖8和圖9?；钚匀旧Y(jié)果表明目的片段蛋白具有IMPDH結(jié)構(gòu)域，可催化IMP反應(yīng)生成XMP，具IMPDH活性。
10.IMPDH體外表達(dá)蛋白對細(xì)胞周期的影響用含10％無支原體新生犢牛血清(NCS，Gibco)的RPMI1640(Gibco公司)完全營養(yǎng)液稀釋純化蛋白制成10μg/ml、20μg/ml和100μg/ml的工作液，3種濃度的蛋白溶液分別加到長滿單層的Hep-2細(xì)胞上。置37℃分別孵育12h，胰酶消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106/ml。加入乙醇至75％濃度，室溫固定10min。加入1％體積的碘化丙叮溶液(69μmol/L磷酯酰肌-38mmol/L檸檬酸鈉，pH 7.3)，室溫避光放置10min。以Becton Dickinson流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期。用RPMI1640(10％犢牛血清)營養(yǎng)液同倍稀釋配制空PET-32α載體蛋白重組蛋作陰性對照。結(jié)果見表1。重組目的蛋白作用細(xì)胞后，表現(xiàn)為處于S期即細(xì)胞DNA合成期的細(xì)胞數(shù)明顯增加，最大達(dá)39％；而處于G0/G1期即細(xì)胞間隙期的細(xì)胞數(shù)減少，最大達(dá)47.88％，細(xì)胞表現(xiàn)出旺盛的分裂增生能力。當(dāng)?shù)鞍诐舛仍黾拥?00μg/ml時，引起細(xì)胞G2/M期的數(shù)量明顯增加，可能是由于改變細(xì)胞其他信號傳導(dǎo)途徑，導(dǎo)致細(xì)胞停滯于G2/M期，具體原因尚不清楚。此結(jié)果表明IMPDH體外表達(dá)蛋白明顯影響Hep-2細(xì)胞周期，可明顯促進(jìn)細(xì)胞DNA的合成，促進(jìn)細(xì)胞分裂，而且不同的蛋白處理組呈現(xiàn)出一定量的關(guān)系。
表1重組蛋白對HEp-2細(xì)胞周期的影響

權(quán)利要求
1.豬鏈球菌次黃嘌呤核苷酸脫氫酶基因的應(yīng)用，其特征在于，該豬鏈球菌次黃嘌呤核苷酸脫氫酶基因為在GenBank登陸的IMPDH序列，序列號為DQ097893。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述豬鏈球菌次黃嘌呤核苷酸脫氫酶基因的應(yīng)用，其特征在于，重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建過程如下1)獲取IMPDH目的基因并克隆入pMD18-T載體根據(jù)GenBank登陸的IMPDH序列，序列號為DQ097893，利用DNAStar軟件分析，選取IMPDH基因3’端2238-3194bp，設(shè)計一對特異性引物P15′-ctggaattctgtttgagtcttgctccc-3′(EcoR I)P25′-ttcctcgagctgttgcttgaactggt-3′ (Xho I)引物兩端分別加限制性酶切位點EcoR I和Xho I及保護(hù)性堿基，下劃線部分為酶切位點；PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min，94℃30s，60℃30s，72℃60s共30個循環(huán)，最后72℃延伸10min，以雙蒸水為陰性對照；該引物在豬鏈球菌血清中擴(kuò)增，獲取IMPDH目的基因，將回收PCR產(chǎn)物4.5μl，與pMD18-T 0.5μl和Solution I 5.0μl，混勻后，4℃連接過夜，用于轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個菌落進(jìn)行過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用EcoR I、Xho I雙酶切，37℃水浴2小時，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可以看到一條792bp的條帶出現(xiàn)，將雙酶切鑒定陽性的細(xì)菌測序，獲得pMD18-T載體質(zhì)粒；2)重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-IMPDH的構(gòu)建和鑒定將已測序鑒定的載體質(zhì)粒pMD18-T和載體pET32a(+)，用EcoR I和Xho I雙酶切，電泳后，回收目的片段和pET32a(+)，然后用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，用氨芐青霉素板篩選，挑取細(xì)菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和PCR鑒定，將見到792bp的目的條帶，陽性重組質(zhì)粒命名為pET32a-IMPDH，即為所獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-IMPDH。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述豬鏈球菌次黃嘌呤核苷酸脫氫酶基因的應(yīng)用，其特征在于，將重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-IMPDH基因轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)，獲得重組菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述豬鏈球菌次黃嘌呤核苷酸脫氫酶基因的應(yīng)用，其特征在于，所獲得的重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得體外表達(dá)IMPDH蛋白。
5.權(quán)利要求1-4之一所述豬鏈球菌次黃嘌呤核苷酸脫氫酶基因應(yīng)用所獲得的產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及豬鏈球菌(Streptococcus suis，SS)次黃嘌呤核苷酸脫氫酶(IMPDH)基因的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。該基因登陸號為DQ097893。包括設(shè)計引物，獲取目的基因克隆入pMD18－T載體，目的片段再經(jīng)酶切后克隆入pET32a載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a－IMPDH，轉(zhuǎn)化獲得重組菌。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得體外高效表達(dá)IMPDH蛋白。IMPDH基因廣泛存在于豬鏈球菌35個血清型中的21個血清型菌株中，這些血清型大部分為致病型。本發(fā)明構(gòu)建了重組菌，體外表達(dá)IMPDH蛋白具有良好的抗原性和生物學(xué)活性、可明顯改變細(xì)胞的周期。本發(fā)明還涉及該基因及其編碼蛋白在SS致病機(jī)理及免疫等方面的應(yīng)用。
文檔編號C12N15/63GK1955300SQ20061009643
公開日2007年5月2日 申請日期2006年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月26日
發(fā)明者何孔旺, 段志濤, 張雪寒, 倪艷秀, 俞正玉, 郭容利, 呂立新, 陸承平 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 南京天邦生物科技有限公司