專利名稱：用于遞送核酸基因的ldl樣陽離子納米微粒、其制備方法以及使用其遞送核酸基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于遞送核酸基因的低密度脂蛋白(LDL)樣陽離子納米微粒、其制備 方法以及使用其遞送核酸基因的方法，更具體地，涉及用于遞送核酸基因的LDL樣陽離子 納米微粒，所述陽離子納米微粒被天然LDL的組成成分——脂質(zhì)組分表面修飾和/或重建， 以便它具有改善的轉(zhuǎn)染效率和穩(wěn)定性，涉及所述陽離子納米微粒的制備方法以及使用其遞 送核酸基因的方法。
背景技術(shù)：
已經(jīng)報(bào)導(dǎo)，作為RNA干擾的調(diào)節(jié)劑的2l_25bp長度的合成的小干擾核糖核 酸(siRNA)的雙螺旋可引起哺乳動物細(xì)胞中目標(biāo)信使RNA的裂解，這繼而抑制特定 基因 的表達(dá)(A. Hamilton, D. Baulcombe, A species of smallantisense RNA in post-transcriptional gene silencing in plants， Science 286(1999)950-2.； S.Elbashir，J.Harborth, W. Lendeckel，A.Yalcin，K. Weber, T.Tuschi. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference incultured mammalian cells， Nature 411(2001)494-8.)。從那以后，在通過基因療法治療獲得性或先天性疾病或病癥方面，具有 在mRNA水平選擇性地?fù)舻?knocking-down)目標(biāo)基因的性能的siRNA引起了更多的關(guān)注。siRNA是公知的針對基因療法的希望的候選藥物，然而，由于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的障 礙，它在實(shí)際的治療應(yīng)用中具有局限性。帶負(fù)電荷的siRNA顯示極低的細(xì)胞攝取和轉(zhuǎn)染效 率。主要的細(xì)胞外障礙是被血清核酸酶化學(xué)降解，因此，siRNA在血液中的不穩(wěn)定性造成靜 脈內(nèi)(IV)給藥方面的問題。為了克服上述障礙，基于電荷互補(bǔ)行為，通過聚合電解質(zhì)復(fù)合物形成，已經(jīng)將陽 離子月旨質(zhì)(De Paula D, Bentley MV, Mahato RI. Hydrophobizationand bioconjugation for enhanced siRNA delivery and targeting), RNA. 13 (2007) 431—56)和 / 或陽離子聚 合物(DJ. Gary, N. Puri, YY. Won, Polymer-basedsiRNA delivery !Perspectives on the fundamental and phenomenologicaldistinctions from polymer-based DNA delivery), J Control Release. 2007 May26，[打印前電子版])應(yīng)用于siRNA遞送系統(tǒng)。特別地，在聚合電解質(zhì)復(fù)合物(polyplex)形成中廣泛使用以阻止血清核酸酶的 聚陽離子聚乙烯亞胺(PEI)可附著于質(zhì)膜，并且因此可以通過胞吞而被攝取。然而，已知PEI通常通過壞死或凋亡造成各種細(xì)胞系的細(xì)胞死亡，而且，隨著PEI 的分子量和/或支化程度的增加，這樣的細(xì)胞毒活性變得越明顯。已經(jīng)表明，低分子量的PEI或聚乙二醇(PEG)接枝的PEI共聚物具有較低的細(xì)胞 毒性。然而，由于陽離子聚合物的胺密度低并且復(fù)合物縮合的程度低，所以，該聚合物不能 積極地轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并因此增加培養(yǎng)基中的酶促(水解)反應(yīng)和siRNA的不穩(wěn)定性。應(yīng)該注意，據(jù)顯示，相比siRNA/PEI復(fù)合物，結(jié)合PEG的siRNA和PEI (分子量為 25K)系聚合電解質(zhì)復(fù)合物(PEC)微粒具有改善的對抗酶攻擊的穩(wěn)定性和優(yōu)良的使基因沉默的效力。得自天然來源的非合成載體可減輕細(xì)胞毒性，同時(shí)可提高生物相容性和生物可降 解性，因此優(yōu)選用于遞送siRNA。天然載體的優(yōu)選實(shí)施方案可以包含既不會引起免疫反應(yīng) 也不會被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)識別的LDL的脂質(zhì)部分。該LDL通常參與脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的運(yùn) 輸，具體地，通過其體循環(huán)參與將膽固醇遞送至外部肝臟組織。實(shí)際上，在臨床前治療或臨床治療中，將非親水性的藥物諸如環(huán)孢霉素A和兩性 霉素B脂質(zhì)復(fù)合物(ABLC)與LDL微粒結(jié)合，以便被有效地遞送。所述LDL可以與硬脂酰 聚(L-賴氨酸)(硬脂酰-PLL)(所謂的Terplex DNA系統(tǒng))結(jié)合，以便用于基因送遞(DG. Affleck，L Yu, DA. Bull，SH. Bailey, SW. Km，Augmentation of myocardial transfection usingTerplex DNA :a novel gene delivery system, Gene Ther.8 (5) (2001)349-53)。對 于該制劑，已經(jīng)與帶負(fù)電荷的DNA發(fā)生相互作用的PLL成分之間可能存在疏水作用。同時(shí)，已知從血液中分離天然LDL的過程非常困難并且耗費(fèi)大量時(shí)間。為此， 人們已經(jīng)使用膽固醇酯和磷脂在不加入載脂蛋白的條件下，開發(fā)出作為LDL模擬模型 的重建的LDL樣微乳(LDE)。已從動物研究和臨床治療揭露，被引入血流中的LDE像 天然 LDL 那樣發(fā)揮作用(RC.Maranhao，B. Garicochea, EL. Silva, P. Dorlhiac-Llacer, SM. Cadena, D.Coelho, JC. Meneghetti, FJ. Pileggi, DA. Chamone. Plasma kinetics and biodistribution ofa lipid emulsion resembling low-density lipoprotein in patients with acuteleukemia, Cancer Res.54 (17) (1994)4660-6)。然而，為了確立基于核酸基因諸如siRNA的方法的實(shí)際應(yīng)用，仍強(qiáng)烈需要新的技 術(shù)方案和/或策略以克服常規(guī)問題，諸如較低的轉(zhuǎn)染效率和/或穩(wěn)定性。發(fā)明技術(shù)問題的公開因此，本發(fā)明涉及解決關(guān)于常規(guī)方法的上述問題，而且，本發(fā)明的目的是提供用于 遞送核酸基因的具有改善的轉(zhuǎn)染效率和穩(wěn)定性的LDL樣陽離子納米微粒，所述陽離子納米 微粒被模仿天然LDL的組分表面修飾和/或重建。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供制備用于遞送核酸基因的具有改善的轉(zhuǎn)染效率和穩(wěn) 定性的LDL樣陽離子納米微粒的方法。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供用于遞送核酸基因的方法，所述方法使用如上所述的 用于遞送所述核酸基因的具有改善的轉(zhuǎn)染效率和穩(wěn)定性的LDL樣陽離子納米微粒。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供用于遞送核酸基因的LDL樣陽離 子納米微粒，所述陽離子納米微粒包含含有膽固醇酯和甘油三酸酯的脂質(zhì)核部分；和含 有膽固醇、磷脂和陽離子脂質(zhì)的陽離子表面脂質(zhì)部分，該部分通過疏水作用形成所述脂質(zhì) 核部分的陽離子表面。本發(fā)明還提供制備用于遞送核酸基因的LDL樣陽離子納米微粒的方法。更進(jìn)一步，本發(fā)明提供用于將核酸基因遞送至目標(biāo)細(xì)胞的方法，所述方法使用如 上所述制備的LDL樣陽離子納米微粒。有益效果由于本發(fā)明的用于遞送核酸基因的LDL樣陽離子納米微粒被模仿天然LDL的組分 表面修飾和重建，所以本發(fā)明的納米微粒顯示出優(yōu)良的轉(zhuǎn)染效率和穩(wěn)定性，由此有效地將
5核酸基因特別地是SiRNA遞送至目標(biāo)細(xì)胞。附圖簡述結(jié)合附圖，相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員將更清楚本發(fā)明的以上目的、特征和優(yōu)點(diǎn)。所述附 圖中

圖1的示意圖說明用于制備陽離子脂質(zhì)微乳(CLM)的LDL的脂質(zhì)部分、DOPE和 DC-膽固醇的組裝，其中說明了通過帶正電荷的CLM表面和帶負(fù)電荷的siRNA之間的靜電相 互作用形成siRNA-PEG/CLM復(fù)合物的方法；圖2顯示通過透射電子顯微鏡(TEM)觀察到的CLM的圖像，比例條是500nm ；圖3顯示通過透射電子顯微鏡(TEM)觀察到的CLM的圖像，比例條是200nm ；圖4描繪的圖表說明在10%血清存在下MDAMB435細(xì)胞中基因載體的細(xì)胞毒性分 析結(jié)果，其中黑色長方形和白色圓圈分別代表PEI 25K和CLM;圖5說明siRNA/CLM復(fù)合物的特性，其中，測得的siRNA-PEG/CLM復(fù)合物的尺寸和 ζ電位的結(jié)果與DC-膽固醇(包含在CLM中)/siRNA-PEG的重量比具有函數(shù)關(guān)系；圖6說明siRNA/CLM復(fù)合物的特性，其中，凝膠阻滯分析結(jié)果與DC-膽固醇(包含 在CLM中)/siRNA-PEG的重量比具有函數(shù)關(guān)系，在長方形圖片B中，M和0分別對應(yīng)標(biāo)記物 和對照siRNA-PEG，箭頭指示siRNA-PEG的完全復(fù)合的重量比。；圖7描繪的圖表說明在含有10%血清的RPM-I培養(yǎng)基1640中測得的siRNA-PEG/ CLM復(fù)合物的尺寸；圖8描繪的圖表說明培養(yǎng)2小時(shí)后PC-3細(xì)胞中用cy3標(biāo)記的siRNA-PEG/CLM復(fù) 合物的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果；圖9和10描繪的圖表說明由siRNA-PEG/CLM復(fù)合物的轉(zhuǎn)染造成的基因表達(dá)抑制 的比率與DC-膽固醇(包含在CLM中)/siRNA-PEG的重量比具有函數(shù)關(guān)系。實(shí)施本發(fā)明的最佳方式從以下的詳細(xì)描述和附圖，本發(fā)明將更加清楚。根據(jù)所述本發(fā)明的第一個(gè)方面，用于遞送核酸基因的LDL樣陽離子納米微粒包 含含有膽固醇酯和甘油三酸酯的脂質(zhì)核部分；和含有膽固醇、磷脂和陽離子脂質(zhì)的陽離 子表面脂質(zhì)部分，該部分通過疏水作用形成所述脂質(zhì)核部分的陽離子表面。本發(fā)明的膽固醇酯涉及與具有10-24個(gè)碳原子的飽和的或不飽和的脂肪酸通過 酯化結(jié)合的膽固醇。優(yōu)選地，所述膽固醇酯是具有16-18個(gè)碳原子的不飽和脂肪酸(諸如 油酸)的酯。本發(fā)明的納米微粒可以包括單種或多種膽固醇酯。本發(fā)明的甘油三酸酯可以包括具有不同組成的各種脂肪酸的純化的甘油三酸酯 或主要含有具有多種脂肪酸的甘油三酸酯的植物油。優(yōu)選地，所述甘油三酸酯包括動物油 或植物油，并且所述植物油可以包括大豆油、橄欖油、棉籽油、芝麻油、肝油等。這樣的油可 以單獨(dú)使用或以其兩種或多種組合起來使用。本發(fā)明的膽固醇酯和甘油三酸酯可以通過疏水作用形成本發(fā)明的LDL樣陽離子 納米微粒的脂質(zhì)核部分。本發(fā)明的磷脂可以包括任意類型的中性磷脂、陽離子磷脂和陰離子磷脂，此外，可 以包括單種或多種磷脂。所述磷脂可以包括磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨 酸、磷脂酰甘油、以上磷脂的溶血類型，或具有6-24個(gè)碳原子的脂族鏈的完全飽和的或部
6分硬化的形式。本發(fā)明的磷脂不受特別的限制，然而，可以包括選自以下的至少一種二油 酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)；棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿(POPC)；卵磷脂酰膽堿(EPC) ；二硬脂酰 磷脂酰膽堿(DSPC) ；二油酰磷脂酰膽堿(DOPC) ；二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC) ；二油酰磷脂 酰甘油(DOPG)；和二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)。本發(fā)明的磷脂和膽固醇可以改善基因轉(zhuǎn)染效率，并用作助手(helper)脂質(zhì)用于 減少陽離子脂質(zhì)合成物的細(xì)胞毒性。磷脂通過促進(jìn)所述納米微粒的陽離子脂質(zhì)與內(nèi)體膜磷 脂的融合使內(nèi)體小泡的膜不穩(wěn)定。此外，膽固醇為表面包裝(packing)提供形態(tài)學(xué)剛性，由 此改善所述納米微粒的穩(wěn)定性同時(shí)改善所述助手的活性。本發(fā)明的陽離子脂質(zhì)可以包括在特定pH(諸如生理pH)下本質(zhì)上具有正電荷的 陽離子脂質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施方案，所述陽離子脂質(zhì)可以包括選自以下的至少一 種3β-[Ν-(Ν' ,N' ,N'-三甲基氨基乙烷)氨基甲?；鵠膽固醇(TC_膽固醇)；3β-[Ν-(Ν' ,N' -二甲基氨基乙烷)氨基甲?；鵠膽固醇(DC-膽固醇)；3 β-[N-(N'-一甲基氨基乙烷)氨基甲?；鵠膽固醇(MC-膽固醇)；3 β-[N-(氨基乙烷)氨基甲?；鵠膽固醇(AC-膽固醇)；N-(N'-氨基乙烷)氨基甲?；嵘?AC-生育酚)；N-(N'-甲基氨基乙烷)氨基甲?；嵘?MC-生育酚)；N，N- 二油基-N，N- 二甲基氯化銨(DODAC)；N, N- 二硬脂?；?N，N- 二甲基溴化銨(DDAB)；N-(1-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTAP)；N，N- 二甲基-(2，3- 二油酰氧基)丙胺(DODMA)；N-(1-(2，3-二油基氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)；1,2- 二油?；?3- 二甲基銨丙烷(DODAP)；1,2- 二油?；被柞；?3- 二甲基銨丙烷(DOCDAP)；1，2-二亞油?；?dilineoyl)-3-二甲基銨丙烷(DLINDAP)；二油酰氧基-N-[2_(精胺酰氨基)乙基]-N，N-二甲基-1-丙基三氟乙酸銨 (DOSPA)；雙十八烷基酰氨基甘氨酰精胺(DOGS)；1，2-二肉豆蔻氧基丙基-3-二甲基羥基乙基溴化銨(DMRIE)；3- 二甲氨基-2-(膽留-5-烯-3 β -氧基丁 -4-氧基)(順式，順式_9，12-十八 碳二烯氧基)丙烷(CLinDMA)；2_[5’ _(膽甾-5-烯-3β_氧基)_3’ -氧雜戊氧基]-3-二甲基-1-(順式，順 式-9’，12’ -十八碳二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)；N，N- 二甲基-3，4- 二油基氧基芐胺(DMOBA)；1，2-Ν，N’ - 二油基氨基甲?；?3- 二甲氨基丙烷(DOcarbDAP)；1，2- 二酰基-3-三甲基銨丙烷(TAP)；和1，2- 二?；?3- 二甲基銨丙烷(DAP)。特別地，DC-膽固醇比其他陽離子脂質(zhì)顯示出更低的細(xì)胞毒性，而且DC-膽固醇系 基因載體已經(jīng)獲得批準(zhǔn)用于各種疾病的臨床治療，所述疾病包括例如黑素瘤、囊性纖維化、
7宮頸癌、乳腺癌、卵巢癌等。因此，DC-膽固醇可優(yōu)選地用于本發(fā)明。本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案是提供用于遞送核酸基因的LDL樣陽離子納米微粒，所述 陽離子納米微粒包含含有膽固醇酯和甘油三酸酯的脂質(zhì)核部分；和含有膽固醇、二油酰 磷脂酰乙醇胺(DOPE)和3β-[Ν-(Ν' ,N' - 二甲氨基乙烷)氨基甲?；鵠膽固醇(DC-膽 固醇)的陽離子表面脂質(zhì)部分，該部分通過疏水作用形成所述脂質(zhì)核部分的陽離子表面。上述陽離子脂質(zhì)可以與所述核酸通過靜電相互作用結(jié)合以形成核酸/脂質(zhì)復(fù)合 物。本發(fā)明的納米微粒是LDL樣陽離子納米微粒。天然LDL通常包含兩種脂質(zhì)相，即 極性組分(磷脂和載脂蛋白)和預(yù)先由膽固醇酯和甘油三酸酯組成的非極性的中性脂質(zhì)， 它們的組成和物理化學(xué)性質(zhì)顯示在表1中。磷脂和載脂蛋白使非極性脂質(zhì)乳化，以確保其 表面的穩(wěn)定性，由此形成穩(wěn)定的生物微乳。表 1[表1][表]天然LDL的組成和它們的物理化學(xué)性質(zhì)
部分天然LDL成分含量(w/w)脂質(zhì)核部分膽固醇酯45%甘油三酸酯3%表面部分膽固醇10%磷脂22%載脂蛋白B-10020%尺寸(nm)18-25ζ電位(mV)-11.4士 1.9 [25]本發(fā)明的用于遞送核酸基因的LDL樣陽離子納米微粒包含30_60重量％膽固醇 酯；0. 1-10重量％甘油三酸酯；5-20重量％膽固醇；5-30重量％磷脂；和10-50重量％陽 離子脂質(zhì)。優(yōu)選地，該納米微粒可以包含40-50重量％膽固醇酯；1-5重量％甘油三酸酯； 8-12重量％膽固醇；12-16重量％磷脂；和25-30重量％陽離子脂質(zhì)。在本發(fā)明的納米微粒中，所述脂質(zhì)核部分與所述表面脂質(zhì)部分的重量比可以是， 相對納米微粒載體的重量，30 70-70 30，優(yōu)選地可以是40 60-60 40，并且更優(yōu)地 可以是 45 55-55 45。在本發(fā)明的示例性實(shí)施方案中，對于CLM，磷脂膽固醇陽離子脂質(zhì)的摩爾比是 9.4 13 26，陽離子脂質(zhì)與助手脂質(zhì)的摩爾比是1.16，這允許有效的組成具有基本上相 等的摩爾比。本發(fā)明的LDL樣陽離子納米微?？梢杂糜谶f送核酸。這樣的核酸可以選自siRNA、核糖體RNA(rRNA)、RNA、脫氧核糖核酸(DNA)、互補(bǔ)
8DNA (cDNA)、適體、信使DNA (mRNA)、轉(zhuǎn)移RNA (tRNA)和反義寡脫氧核苷酸(AS-ODN)，然而，并 不具體地局限于這些。例如，本文中使用的SiRNA指雙螺旋RNA或單鏈RNA (在所述單鏈RNA內(nèi)具有雙螺 旋RNA形式)。雙螺旋RNA的兩條鏈可以通過核苷酸之間的氫鍵結(jié)合，所述雙螺旋RNA中的 所有核苷酸不需要完全地、互補(bǔ)地結(jié)合在一起。所述siRNA的長度可以是15-60、15-50或
15-40個(gè)核苷酸(對于雙螺旋RNA，是一條鏈的核苷酸數(shù)量，即堿基對的數(shù)量；而對于單鏈 RNA，是該單鏈RNA內(nèi)的雙螺旋鏈的長度)。通常，以上siRNA包括長度為15-30、15-25或
16-25個(gè)核苷酸，優(yōu)選地長度為19-25、21-25或21-23個(gè)核苷酸的siRNA。此外，所述siRNA 可以包括其中引入了不同官能團(tuán)的核苷酸，以便增加在血液中的穩(wěn)定性或損壞免疫活度。因此，本發(fā)明的siRNA可以是一般siRNA的修飾形式或未修飾形式。例如，可以用 聚乙二醇修飾所述siRNA的一個(gè)末端。 PEG是疏水性的、可彎曲的和非離子型的聚合物，而且是修飾納米微粒的表面 并使載體具有長的循環(huán)周期以防止單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)(MPS)識別納米微粒的表面的 一種廣泛己知的物質(zhì)(Xing X， Yujiao Chang J, Hung Μ. Preclinical and clinical study of HER-2/neu-targeting cancer gene therapy, Adv Drug Deliv Rev. 30(1~3) (1998)219-227. ；S. Mao, M. Neu, 0. Germershaus, 0. Merke 1, J. Sitterberg, U. Bakowsky, T.Kissel. , Influence ofpolyethyleneglycol chain length on the physic—ochemical and biologicalproperties of poly (ethyleneimine)-graft-poly(ethyleneglycol) blockcopolymer/SiRNA polyplexes, Bioconjug Chem. 17(5)(2006) 1209—18)。在本發(fā)明的示例性實(shí)施方案中，如果PEG具有5，000道爾頓的分子量，那么所述 siRNA可充分受到保護(hù)，抵抗核糖核酸酶消化，同時(shí)繼續(xù)保持其優(yōu)良的轉(zhuǎn)染性能。在本發(fā)明中，所述陽離子脂質(zhì)與所述核酸的N/P比率可以是0. 1-128，優(yōu)選可以是 地0. 5-32，并且更優(yōu)地可以是1-16。在本發(fā)明的示例性實(shí)施方案中，所述陽離子脂質(zhì)與所 述核酸的重量比可以是1. 4-3. 2，并且優(yōu)選地可以是2. 8-16. 8。本發(fā)明的LDL樣陽離子納米微粒可以包含一類或多類載脂蛋白。所述載脂蛋白 可以從天然脂蛋白中提取或通過蛋白質(zhì)重組來制備。所述載脂蛋白的優(yōu)選實(shí)例可以包括 B-100、載脂蛋白E等。這樣的載脂蛋白可以使本發(fā)明的納米微粒以特定的方式被有效地引 入細(xì)胞中。根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供制備用于遞送核酸基因的LDL樣陽離子納米微粒 的方法。通過該方法制備的納米微粒的組分的種類和含量基本上等同于上述的那些。在本發(fā)明的示例性實(shí)施方案中，提供制備用于遞送核酸基因的LDL樣陽離子納米 微粒的方法，所述方法包括(a)將膽固醇酯、甘油三酸酯、磷脂、膽固醇和陽離子脂質(zhì)溶解 在有機(jī)溶劑中；(b)除去所述有機(jī)溶劑以產(chǎn)生脂質(zhì)膜；和(c)向所述脂質(zhì)膜中添加水溶性溶 液以使所述脂質(zhì)膜水合。所述步驟(a)中使用的有機(jī)溶劑可以包括例如選自氯仿、甲醇和環(huán)己烷的至少一 種。例如，所述有機(jī)溶劑是單獨(dú)的氯仿或甲醇或者它們以相對比率的組合，然而，并不具體 地局限于此。在高于膽固醇酯的熔點(diǎn)的溫度下除去所述步驟(b)中的有機(jī)溶劑，如果使用膽固 醇油酸酯，所述溫度優(yōu)選地是52-60°C。
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在本發(fā)明的另一個(gè)示例性實(shí)施方案中，提供制備用于遞送核酸基因的LDL樣陽離 子納米微粒的方法，所述方法包括(a’ )溶解膽固醇酯、甘油三酸酯、磷脂、膽固醇和陽離 子脂質(zhì)；(b’ )向以上溶液中加入水并混合以制備混合物；和(C’ )攪拌所述混合物以形成 均勻的溶液。在所述步驟(a’)中，可以通過加熱或使用上述步驟(a)中的有機(jī)溶劑來溶解所述 脂質(zhì)成分。在通過使用所述有機(jī)溶劑來溶解所述脂質(zhì)成分的情況下，根據(jù)所述第二個(gè)示例 性實(shí)施方案的以上方法還可包括從所述均勻的溶液中除去所述有機(jī)溶劑的步驟(d')。在 高于膽固醇油酸酯的熔點(diǎn)的溫度下除去所述有機(jī)溶劑，如果使用膽固醇酯，所述溫度優(yōu)選 地是 52-60°C。在所述步驟(b’ )中，水的添加量可以是所述溶液的3-7倍(ν/ν)。所述步驟(C’ )中的攪拌可以通過任意的常規(guī)方法諸如聲處理、高壓均化、使用膜 流化裝置等來進(jìn)行，以產(chǎn)生均一的微粒。關(guān)于聲處理，它可以在125W時(shí)進(jìn)行1-5分鐘，然而， 并不具體地局限于這些條件。優(yōu)選地，本發(fā)明的另一個(gè)示例性實(shí)施方案的用于遞送核酸基因的LDL樣陽離子納 米微粒可以通過改良的溶劑乳化法來制備。在本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供將核酸基因遞送至目標(biāo)細(xì)胞的方法，所述方法使用 如上所述的用于遞送核酸基因的LDL樣陽離子納米微粒。在本發(fā)明的示例性實(shí)施方案中，提供這樣的方法，所述方法包括(1)制備核酸基 因和如上所述的LDL樣陽離子納米微粒的復(fù)合物；和(2)使所述制備的復(fù)合物轉(zhuǎn)染目標(biāo)細(xì) 胞。所述步驟(1)中的復(fù)合物可以通過在核酸基因存在下，在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS) 或除鹽水中溫育所述LDL樣陽離子納米微粒來形成。所述PBS的ρΗ可以是7. 0-8. 0，并且 所述PBS可以包含0. 8% NaCl，然而并不具體地局限于此。以上方法還可以包括所述步驟(1)之后的從核酸基因-PEG綴合物和所述LDL樣 陽離子納米微粒得到的復(fù)合物的凝膠阻滯處理。可以實(shí)施這樣的凝膠阻滯處理，以確定通 過帶負(fù)電荷的siRNA和納米微粒的帶正電荷表面之間的靜電相互作用是否穩(wěn)定地形成了 所述復(fù)合物。在本發(fā)明的另一個(gè)示例性實(shí)施方案中，如果使用PEG修飾所述核酸，那么以上方 法還可以包括在所述步驟(1)之前形成核酸基因-PEG綴合物的步驟(1’)。具體地，可以使用核酸基因和PEG之間的二硫鍵來獲得所述步驟(1’ )中的綴合 物，更優(yōu)選地，使用在siRNA的有義鏈的3’末端具有官能化的己胺基的核酸基因來制備所 述綴合物。過量的N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基聯(lián)硫基)丙酸鹽(SPDP)在siRNA的3' 末端處與己胺在PBS(pH 7. 5)中反應(yīng)，以激活該核酸。剩余的未反應(yīng)的SPDP使用除鹽柱除 去。SPDP激活的siRNA可與PEG (分子量為5，000)-SH過量反應(yīng)，以產(chǎn)生二硫鍵，由此與所 述PEG結(jié)合。剩余的未反應(yīng)的PEG-SH通過透析(MWC0 = 10，000)除去，由此獲得純化的通 過所述二硫鍵與所述PEG結(jié)合的siRNA。例如，所述siRNA由于其良好的表達(dá)抑制活性，對基因治療非常有用。然而，該核 酸在穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率方面有問題，因此在實(shí)際應(yīng)用中受到限制。本發(fā)明的陽離子納米微粒(CLM)可以在含有血清的培養(yǎng)基中通過靜電相互作用與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，其中，與所述核酸結(jié)合的CLM顯示出非常低的細(xì)胞毒性和優(yōu)良 的細(xì)胞攝取，因此它對于遞送所述核酸是非常有用的?；蛘撸梢允寡獫{載脂蛋白吸附到CLM的表面，由此使所述CLM模仿含有天然載脂 蛋白的脂蛋白。因此，期望在體內(nèi)通過天然脂蛋白機(jī)制產(chǎn)生所述CLM。在下文中，從以下實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)例，本發(fā)明將變得清楚，所述實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)例的給 出僅出于說明的目的，而不應(yīng)該被解釋成是對本發(fā)明的范圍的限制。所述實(shí)施例和/或?qū)嶒?yàn)例中使用的膽固醇油酸酯、甘油三油酸酯(甘油三酸酯) 和未酯化的膽固醇購自Sigma Chemical。L-α-二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和3β-[N-(N'，N' -二甲基氨基乙烷)氨基 甲?；鵠膽固醇鹽酸鹽由Avanti Polar Lipids生產(chǎn)。此夕卜，VEGFsiRNA 禾口 GFP siRNA 購 自 Bioneer Co. (Daejeon， Korea)。GFP siRNA 的有義鏈?zhǔn)?5 ‘ -GCAAGCUGACCCUGAAGUUdTdT-3 ‘，而其反 義鏈?zhǔn)?5 ‘ -AACUUCAGG⑶CAGCUUGCdTdT-3 ‘。同樣地，VEGF siRNA 的有義鏈?zhǔn)?5' -GGAGUACCCUGAUGAGAUCdTdT-3‘，而其反義鏈?zhǔn)?5' -GAUCUCAUCAGGGUACUCCdTdT-3‘。N-琥珀酰亞胺基-3-(2_吡啶基聯(lián)硫基)丙酸鹽(SPDP)和巰基衍生的甲 氧基聚(乙二醇)(mPEG-SH，分子量是5，000)分別購自Pierce (Lockford，IL)和 Nectar(Huntsville, AL)。胎牛血清(FBS)、RoswellPark Memorial Institute-I (RPM-I)培養(yǎng)基 1610 和達(dá) 爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)購自Gibco BRL(Grand Island，NY)。此外，用于分析的 其他化學(xué)藥品和試劑用于所述本發(fā)明的示例性實(shí)施方案中。實(shí)施例1 陽離子脂質(zhì)微乳的制備通過改良的溶劑乳化作用制備陽離子脂質(zhì)微乳(CLM)。更具體地，在玻璃瓶中，將 22. 5mg(45重量％ )膽固醇油酸酯、1. 5mg(3重量％ )甘油三油酸酯、7mg (14重量％ )D0PE、 5mg(10重量％ )未酯化的膽固醇和14mg(28重量％ )DC_膽固醇溶解在2mL由氯仿甲醇 (2 1)組成的溶劑中。CLM中，DOPE 膽固醇DC-膽固醇的摩爾比是9. 4 13 26， 陽離子脂質(zhì)與助手脂質(zhì)的摩爾比是1. 16，這允許有效的組成具有基本上相等的摩爾比。在充分?jǐn)嚢柘拢蛟撊芤褐屑尤隝OmL蒸餾水。用Branson 450超聲破碎儀(20kHz， 工作循環(huán)=40，輸出控制=3. 5)，使所得懸浮液接受3分鐘聲處理。將制得的微乳轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，然后在52-60°C的溫度(該溫度是膽固醇油酸 酯的熔點(diǎn))下除去溶劑，并在4°C儲存。實(shí)施例2 SiRNA-PEG的合成siRNA-PEG 通過二硫鍵結(jié)合。SP，將 300 μ g siRNA (20nmol VEGF 或 GFP siRNA)溶 解在PBS(pH 7.5)中，所述siRNA已在有義鏈的3’ -末端被己胺基修飾。之后，將20μ L(400nmol)20mM SPDP的DMSO溶液加入制得的siRNA溶液中。使該 混合物在室溫下反應(yīng)3小時(shí)，然后通過凝膠滲透色譜法(D-SaltTM葡聚糖除鹽柱，Pierce, Lockford，IL)除去過量SPDP以獲得純化的siRNA_SPDP。接著，向純化的siRNA-SPDP中加入在PBS (pH 7. 5)中的4 μ molmPEG-SH，隨后在室 溫下反應(yīng)3天。通過對除鹽水透析(MWC0 10，000)來分離未反應(yīng)的PEG，同時(shí)使用高速真空 濃縮設(shè)備濃縮siRNA-PEG綴合物。
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通過測定260和280nm處的UV吸收值來測定所得產(chǎn)物的純度和濃度。純化的 siRNA-PEG綴合物保存在_80°C。實(shí)施例3 復(fù)合物的形成以分別是0、1. 4、2. 8、4. 2、5. 6和8. 4的各DC-膽固醇(包含在CLM中)/siRNA重 量比使用siRNA-PEG，于室溫下在PBS (pH 7. 4和150mMNaCl)或脫鹽水中溫育CLM15分鐘。 之后，對所得復(fù)合物進(jìn)行凝膠阻滯并通過測量其尺寸和ζ電位確定性質(zhì)。實(shí)施例4 =SiRNA-PEG/陽離子微乳復(fù)合物的凝膠阻滯如上所述，以不同重量比制備各siRNA-PEG/CLM復(fù)合物(20 μ L)，并與2 μ L負(fù)載染 料混合(IOX)。將22 μ L全部懸浮液與tris-乙酸鹽(TAE)電泳緩沖液加入具有2%瓊脂 糖凝膠的孔內(nèi)進(jìn)行電泳，于100V下、歷時(shí)15分鐘使所述孔從陰極移動至陽極。使用溴化乙錠將所得siRNA-PEG染色以變得可見，并通過紫外線獲得其凝膠圖像。實(shí)施例5 siRNA-PEG/CLM復(fù)合物的轉(zhuǎn)染用得自Korean Cell Line Bank (Seoul，Korea)的 PC3 細(xì)胞(人前列腺癌細(xì)胞 系)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，使細(xì)胞生長在含有熱滅活的10% (ν/ν)胎牛血清、100UI/mL青霉素和 100 μ g/mL鏈霉素的RPM-I培養(yǎng)基1610上。使過度表達(dá)的GFP和Samyang Co. (Dae jeon，Korea)提供的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MDAMB 435 細(xì)胞(人乳腺癌細(xì)胞)生長在補(bǔ)充了 10%血清和上述抗生素的DMEM上。于37°C和5% CO2下使細(xì)胞保持在潮濕空氣中，隨后使用胰蛋白酶/EDPA標(biāo)準(zhǔn)分 裂細(xì)胞培養(yǎng)物。使Cy3標(biāo)記的siRNA_PEG與CLM復(fù)合，然后在含有10%血清的培養(yǎng)基中與PC3細(xì) 胞溫育2小時(shí)，由此完成其轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)例1 陽離子納米微粒的表征通過激光散射法測得實(shí)施例3中制備的CLM的平均直徑是103.6士4.511111，用 透射電子顯微鏡(TEM)觀察到該CLM具有如圖2所示的球形形態(tài)。該CLM的ζ電位是 41. 76士2. 63mV。與天然LDL相比，因DC-膽固醇與DOPE結(jié)合而使該值增加，該CLM的表面 電荷從負(fù)值變?yōu)檎怠Ｖ苽浜?，該CLM在室溫下穩(wěn)定地保持?jǐn)?shù)周而無聚集。作為主要的核組分的膽固醇油酸酯的熔點(diǎn)是52°C，該CLM核在常規(guī)生理溫度下以 固態(tài)存在。這是為什么該CLM能在長時(shí)期內(nèi)保持穩(wěn)定性的原因。具有高穩(wěn)定性的該CLM會 比常規(guī)的DC-膽固醇/DOPE脂質(zhì)體制劑更有利。關(guān)于該CLM的物理化學(xué)性質(zhì)，據(jù)鑒定，該CLM是陽性修飾的用于遞送siRNA的脂質(zhì) 微乳并可成為用于醫(yī)學(xué)治療應(yīng)用的穩(wěn)定的LDL樣系統(tǒng)。通過TEM可見地觀察了 CLM的形態(tài)。按序三次將20 μ L該微乳(5mg/mL)浸入尺 寸為300目的Formvar/碳支架載網(wǎng)，隨后將該載網(wǎng)干燥2分鐘。在80kV用Zeiss Omega 912 TEM(Car Zeiss，Oberkochen，Germany)觀察所得載網(wǎng)。使用裝備了 He-Ne激光器的動態(tài)光散射儀(DLS) (Zeta-Plus, Brookhaven Instruments, NY)以632nm的波長和90°的探測角進(jìn)行尺寸和ζ電位的測量，以測定該 CLM和/或該CLM與siRNA-PEG的復(fù)合物的直徑和表面ζ電位。對于尺寸測量，合意地將各樣品稀釋在除鹽水中，以保持每秒104-105的計(jì)數(shù)數(shù)
12量。為了研究復(fù)合物在血清中的穩(wěn)定性，向該復(fù)合物中加入含有10% FBS的RPM-I培養(yǎng)基 1640，并進(jìn)行反應(yīng)動力學(xué)方面的測量。實(shí)驗(yàn)例2 陽離子納米微粒的細(xì)胞毒性分析對于陽離子納米微粒的細(xì)胞毒性的測定，在進(jìn)行細(xì)胞毒性分析之前24小時(shí)，將 MDAMB 435細(xì)胞接種于96孔板(每孔104個(gè)細(xì)胞)。在含有10% FBS的RPM-I培養(yǎng)基1610中制備具有不同濃度(3、6、12、18、24、36、 48和72μβ/πιυ的各CLM和ΡΕΙ。除去培養(yǎng)基之后，向平板的各個(gè)孔中加入100 μ L制備 的懸浮液。使細(xì)胞與CLM或PEI懸浮液在37°C下溫育24小時(shí)，向各孔中加入10 μ L Cell Counting Kit-8 (CCK-8)溶液(Dojindo molecular technologies Inc.，MD，USA)。細(xì)胞在 37°C下再溫育4小時(shí)，使用微孔鑒定板(BioRad Model 550)在450nm下對培養(yǎng)基進(jìn)行吸收 測量。通過將MDAMB 435細(xì)胞的細(xì)胞脫氫酶釋放到培養(yǎng)基中并對結(jié)果定量，來實(shí)施體外 細(xì)胞毒性分析?？紤]到以下轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，在含有10%血清的培養(yǎng)基的存在下，以3-72μ g/mL 的量使用CLM或作為一種最流行的非病毒類基因載體的PEI 25K，用于以上分析。在培養(yǎng) 24小時(shí)后，在18 μ g/mL時(shí)，PEI 25K僅顯示出6. 9士0. 4%細(xì)胞存活率(IC50值是約9 μ g/ mL)。而CLM直到48 μ g/mL時(shí)基本上顯示無有害影響。對于高劑量給藥，72 μ g/mLCLM顯 示出78士 的細(xì)胞存活率，這大大高于顯示出5. 2士0. 的細(xì)胞存活率的PEI 25K(見圖 3)。無siRNA的PEI 25K和CLM之間的細(xì)胞毒性比較表明，CLM比PEI25K顯示出更低 的細(xì)胞毒性。這表明CLM在細(xì)胞毒性方面會比PEI更有利，可以具有穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染效率并優(yōu) 選地代替PEI。實(shí)驗(yàn)例3 :siRNA-PEG/CLM復(fù)合物的表征對于siRNA-PEG和CLM之間的復(fù)合與DC-膽固醇(包含在CLM中)/siRNA的重量 比的函數(shù)關(guān)系的表征，在室溫下使siRNA-PEG與CLM在水溶液中溫育。通過根據(jù)DLS測量 微乳的尺寸和其ζ電位來測定通過靜電相互作用復(fù)合的程度。如圖5中說明的，當(dāng)DC-膽固醇(包含在CLM中)/siRNA的重量比從1增加至4. 67 時(shí)，CLM的ζ電位從-13. 8士3. 9mV增加至+35. 67士 1.2mV，然后，當(dāng)DC-膽固醇/siRNA的 重量比超過4.7時(shí)，保持該ζ電位值。這些數(shù)據(jù)表明，在DC-膽固醇/siRNA重量比為4. 7 時(shí)，所有帶負(fù)電荷的siRNA磷酸酯殘基完全與CLM形成復(fù)合物。而且，觀察到，包被了 siRNA-PEG的CLM的尺寸基本上保持接近lOOnm，這與DC-膽 固醇(包含在CLM中)/siRNA-PEG的重量比無關(guān)，因此，在與siRNA-PEG —起溫育后，CLM未 發(fā)生很多的聚集(見圖5)。從這些尺寸和ζ電位數(shù)據(jù)顯示，siRNA-PEG/CLM復(fù)合物的帶正 電荷的表面可以產(chǎn)生復(fù)合物之間的電荷排斥。此外，確定了 復(fù)合物表面上的PEG鏈用作保護(hù)云(protective cloud)，并通過空 間排斥防止CLM聚集。與此同時(shí)，對重量比為1. 4-8. 4的DC-膽固醇(包含在CLM)/siRNA實(shí)施凝膠阻滯 分析。作為瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在5. 6和8. 4的重量比時(shí)，CLM被siRNA-PEG充分 阻滯(見圖6)。這些結(jié)果表明，當(dāng)所述重量比超過5. 6時(shí)，通過電荷相互作用充分形成了siRNA-PEG/CLM復(fù)合物。ζ電位數(shù)據(jù)和凝膠阻滯分析證明，在約5的重量比時(shí)復(fù)合是完全 的，因此支持siRNA-PEG/CLM復(fù)合物的復(fù)合與重量比之間的相互關(guān)系。實(shí)驗(yàn)例4 siRNA-PEG/CLM復(fù)合物在含有10%血清的培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性通過經(jīng)二硫鍵的結(jié)合，將PEG 5K引入siRNA遞送系統(tǒng)。產(chǎn)生siRNA-PEG/CLM復(fù)合 物后，使用DLS在含有10%血清的培養(yǎng)基中測量該復(fù)合物的尺寸。如圖7中所示，在動力學(xué)方面表現(xiàn)出兩類吸附模式，即血漿蛋白的快速和慢速吸 附?？焖傥皆?分鐘的溫育時(shí)間之后達(dá)到，在所述溫育時(shí)間中，復(fù)合物的尺寸增加至 47.6nm。當(dāng)在含有血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行溫育達(dá)2_20分鐘時(shí)，siRNA-PEG/CLM復(fù)合物的尺 寸慢慢地但逐步地增長到19. 3nm(例如，在2分鐘時(shí)為151. 2士 13. 2匪，在20分鐘時(shí)為 170. 3 士 29. 9nm)，顯示其特定的變化曲線。這表明，最初時(shí)，血漿蛋白顆粒在聚乙二醇化(PEG化)的納米微粒系統(tǒng)的表面上 的吸附和重排增加了，在溫育20分鐘后達(dá)到其最大水平。這些事實(shí)解釋了在最初的20分 鐘溫育過程中，蛋白質(zhì)在siRNA-PEG/CLM復(fù)合物上的吸附。而且，當(dāng)溫育進(jìn)行了 20-60分 鐘時(shí)，復(fù)合物的尺寸基本上未改變，沒有因聚集造成尺寸增加，因此顯示出該復(fù)合物的穩(wěn)定 性。以上獲得的結(jié)果表明，模仿LDL的納米微粒上的PEG鏈造成的空間排斥可減少血 漿蛋白的離散吸附并可提供在含有血清的培養(yǎng)基中的高穩(wěn)定性且無聚集現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)例5 siRNA-PEG/CLM復(fù)合物的細(xì)胞攝取為了評估siRNA/CLM復(fù)合物的細(xì)胞攝取能力，使Cy3標(biāo)記的siRNA_PEG與CLM復(fù) 合，然后在含有10%血清的培養(yǎng)基中與PC3細(xì)胞溫育2小時(shí)。對所得cy3-siRNA-PEG/CLM 復(fù)合物進(jìn)行相對細(xì)胞攝取流式細(xì)胞計(jì)數(shù)。更具體地，在六(6)塊細(xì)胞板上以每孔5X105個(gè)細(xì)胞的密度接種PC3細(xì)胞，所述 細(xì)胞在含有10% FBS和抗生素的RPM-I培養(yǎng)基1640中在37°C下生長24小時(shí)。在除去培養(yǎng) 基后用PBS (pH 7. 4)洗滌所得細(xì)胞。1 μ gsiRNA-PEG或siRNA-PEG/CLM復(fù)合物(其中DC-膽 固醇(包含在CLM中)/siRNA的重量比為8.4)在37°C溫育2小時(shí)。除去培養(yǎng)基，停止細(xì)胞 攝取。所得細(xì)胞用冷PBS輕輕洗滌，隨后使用(w/v)多聚甲醛溶液固定細(xì)胞。通過流式 細(xì)胞計(jì)(FACScan，Becton，Dickinson)觀察細(xì)胞攝取并使用 CELLQUEST 軟件(PharMingen) 進(jìn)行分析。圖8顯示，cy3-siRNA-PEG/CLM復(fù)合物的熒光強(qiáng)度曲線移動至圖表的右側(cè)。該結(jié) 果證明細(xì)胞攝取顯著地大于對照。在僅為cy3-siRNA-PEG的情況下，相比對照，細(xì)胞攝取結(jié)果有輕微移動。因此，推 測cy3-siRNA-PEG可自我形成，微?？稍斐杉?xì)胞攝取的小幅增加。實(shí)驗(yàn)例6 siRNA-PEG/CLM復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率使用穩(wěn)定的MDAMB 435細(xì)胞系測定siRNA-PEG/CLM復(fù)合物抑制siRNA基因的效 力，所述細(xì)胞系過度表達(dá)GFP并在含血清培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染。更具體地，在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)之前，在十二(12)塊細(xì)胞板上以每孔2 X 105個(gè)細(xì)胞的密度 接種過度表達(dá)GFP的MDAMB 435細(xì)胞并培養(yǎng)24小時(shí)，所述孔含有具有10% FBS和抗生素的 DMEM培養(yǎng)基。除去培養(yǎng)基后，所得細(xì)胞用PBS (pH 7.4)洗滌三次。于37°C下在含有10% FBS的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染1 μ g各siRNA_PEG或具有不同的
14DC-膽固醇(包含在CLM中)/siRNA重量比(比率為0、1. 4、2· 8、5· 6、8· 4和16. 8)的 siRNA-PEG/CLM復(fù)合物2小時(shí)。用補(bǔ)充血清的新鮮培養(yǎng)基代替細(xì)胞上清液。接著，使轉(zhuǎn)染的細(xì)胞生長42小時(shí)并使用0. Triton XlOO的PBS溶液進(jìn)行處理。 在525nm下對細(xì)胞裂解液進(jìn)行熒光測量(該裂解液在488nm處顯示激發(fā))。對于使用PC3細(xì)胞進(jìn)行的VEGF釋放抑制實(shí)驗(yàn)，如上所述使樣品轉(zhuǎn)染，4小時(shí)后，用 含有血清的新鮮培養(yǎng)基代替使用過的細(xì)胞培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染處理后培養(yǎng)6小時(shí)，然后再次用補(bǔ) 充了 10% FBS和20 μ g/mL肝素的新鮮RPM-I培養(yǎng)基代替使用過的培養(yǎng)基。樣品再溫育16 小時(shí)，然后收集含有VEGF的細(xì)胞上清液。根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明書，使用Quantikine人VEGF免疫測定試劑盒(R&D System, Minneapolis,麗)測定從細(xì)胞釋放的VEGF的濃度。在含有10%血清的RPM-I培養(yǎng)基中，分別使用過度表達(dá)GFP的MDAMB 435細(xì)胞或 釋放VEGF的PC-3細(xì)胞處理GFP或VEGF基siRNA-PEG/CLM復(fù)合物。圖9顯示以上復(fù)合物的使GFP基因沉默的效力。根據(jù)DC-膽固醇(包含在CLM 中)/siRNA的重量比的增力Π，siRNA-PEG/CLM復(fù)合物在1. 4-8. 4的重量比范圍內(nèi)抑制GFP基 因的表達(dá)。在5. 6和8. 4的各個(gè)重量比時(shí)，含有GFP基siRNA_PEG的CLM復(fù)合物在GFP表達(dá) 方面分別顯示出41. 2士3. 7%和58. 9士4. 9%的下調(diào)節(jié)率。該結(jié)果基本對應(yīng)一個(gè)事實(shí)，即在 所述重量比超過5. 6的情況下完全形成了 GFP基siRNA-PEG/CLM復(fù)合物?？山忉尀?，通過完全復(fù)合為對siRNA具有化學(xué)計(jì)量作用的遞送系統(tǒng)，可以改善使 基因沉默的性能。還可以在釋放VEGF的PC3細(xì)胞中以與上述相同的方法(除了使用與CLM 復(fù)合的VEGF基siRNA-PEG)來測定轉(zhuǎn)染效率。PC3細(xì)胞的VEGF抑制曲線基本上與MDAMB 435細(xì)胞的GFP抑制曲線相同(見圖10)。對于重量比為5. 6和8. 4的VEGF基siRNA-PEG/CLM復(fù)合物，VEGF表達(dá)抑制率分別 是37. 6士 1. 2%和53. 8士0. 9%。這些結(jié)果依次在PC3細(xì)胞中呈現(xiàn)。同時(shí)，單獨(dú)的siRNA-PEG 使基因沉默的效率分別是6. 9士6. 5%和9. 55士7. 2%，因?yàn)镚FP基siRNA-PEG和VEGF基 siRNA-PEG都顯示低細(xì)胞攝取能力(見圖9和10)。在16. 8 的重量比下，GFP 基 siRNA-PEG/CLM 和 VEGF 基 siRNA-PEG/CLM 復(fù)合物的目 標(biāo)蛋白表達(dá)抑制率分別是38 士 0. 3 %和22. 8 士 13 %。這些結(jié)果表明，鑒于細(xì)胞攝取，未復(fù)合 的CLM可以保留并與siRNA-PEG/CLM復(fù)合物競爭。這可能是使基因沉默的效率在16. 8的 重量比時(shí)輕微下降的原因。盡管參考附圖和示例性的實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員會理 解，在不脫離所附權(quán)利要求書定義的本發(fā)明的范圍的情況下可以在其中作各種修改和變 化。工業(yè)實(shí)用性從以上公開的說明可明白，LDL受體在各種癌癥例如髓性白血病細(xì)胞、腸癌、腎癌、 腦癌等中過度表達(dá)，因此，本發(fā)明的陽離子納米微粒有效地用于使用此類LDL受體治療以 上疾病的癌癥治療中。雖然結(jié)合附圖中例舉的示例性的實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但這僅僅是說明性的。 本領(lǐng)域的技術(shù)人員會理解，可以對本發(fā)明做各種修改和等同。因此，本發(fā)明真正的技術(shù)范圍應(yīng)該由所附權(quán)利要求書確定。
權(quán)利要求
用于遞送核酸基因的低密度脂蛋白(LDL)樣陽離子納米微粒，所述陽離子納米微粒包含含有膽固醇酯和甘油三酸酯的脂質(zhì)核部分；和含有膽固醇、磷脂和陽離子脂質(zhì)的陽離子表面脂質(zhì)部分，該部分通過疏水作用形成所述脂質(zhì)核部分的陽離子表面。
2.權(quán)利要求1的陽離子納米微粒，其中所述陽離子納米微粒包含30-60重量％膽固醇 酯、0. 1-10重量％甘油三酸酯、5-20重量％膽固醇、5-30重量％磷脂和10-50重量％陽離子 脂質(zhì)。
3.權(quán)利要求1的陽離子納米微粒，其中，在所述納米微粒中，所述脂質(zhì)核部分與所述陽 離子表面脂質(zhì)部分的重量比是30 70-70 30。
4.權(quán)利要求1的陽離子納米微粒，其中所述磷脂是選自以下的至少一種二油酰磷脂 酰乙醇胺(DOPE)；棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿(P0PC)；卵磷脂酰膽堿(EPC) ；二硬脂酰磷脂酰 膽堿(DSPC) ；二油酰磷脂酰膽堿(D0PC) ；二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC) ；二油酰磷脂酰甘油 (D0PG)；和二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)。
5.權(quán)利要求1的陽離子納米微粒，其中所述陽離子脂質(zhì)是選自以下的至少一種 3^-[N-(N'，N'，N'-三甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]膽固醇(TC-膽固醇)； 3^-[N-(N'，N' -二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]膽固醇(DC-膽固醇)； 3^-[N-(N'-一甲基氨基乙烷)氨基甲?；鵠膽固醇(MC-膽固醇)；3 3-[N-(氨基乙烷)氨基甲?；鵠膽固醇(AC-膽固醇)；N_(N’ -氨基乙烷)氨基甲?；嵘?AC-生育酚)；N-(N'-甲基氨基乙烷)氨基甲?；嵘?MC-生育酚)；N，N- 二油基-N，N- 二甲基氯化銨(D0DAC)；N，N- 二硬脂?；?N，N- 二甲基溴化銨(DDAB)；N-(l-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化銨(D0TAP)；N，N-二甲基-(2，3-二油酰氧基)丙胺(D0DMA)；N-(l-(2，3-二油基氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化銨(D0TMA)；1，2-二油酰基-3-二甲基銨丙烷(D0DAP)；1，2-二油?；被柞；?3-二甲基銨丙烷(D0CDAP)；1，2-二亞油?；?3-二甲銨-丙烷(DLINDAP)；二油酰氧基-N-[2-(精胺酰氨基)乙基]-N，N-二甲基-1-丙基三氟乙酸銨(D0SPA)； 雙十八烷基酰氨基甘氨酰精胺(DOGS)； 1，2-二肉豆蔻氧基丙基-3-二甲基羥基乙基溴化銨(DMRIE)； 3_ 二甲氨基_2-(膽留-5-烯-3 0 -氧基丁 -4-氧基)-1_(順式，順式_9，12-十八碳 二烯氧基)丙烷(CLinDMA)；2_[5’_(膽留-5-烯-3 0-氧基)-3’_氧雜戊氧基]-3-二甲基-1-(順式，順式-9’， 12’ -十八碳二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)；N，N- 二甲基-3，4- 二油基氧基芐胺(DM0BA)； 1，2-N，N’ -二油基氨基甲酰基-3-二甲氨基丙烷(DOcarbDAP)； 1，2-二?；?3-三甲基銨丙烷(TAP)；和 1,2- 二?；?3- 二甲基銨丙烷(DAP)。
6.權(quán)利要求1的陽離子納米微粒，其中所述核酸選自小干擾RNA(siRNA)、核糖體RNA(rRNA)、核糖核酸(RNA)、脫氧核糖核酸(DNA)、互補(bǔ)DNA(cDNA)、適體、信使DNA(mRNA)、 轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)和反義寡脫氧核苷酸(AS-0DN)。
7.制備用于遞送核酸基因的LDL樣陽離子納米微粒的方法，所述方法包括(a)將膽固醇酯、甘油三酸酯、磷脂、膽固醇和陽離子脂質(zhì)溶解在有機(jī)溶劑中；(b)從溶液中除去所述有機(jī)溶劑以形成脂質(zhì)膜；和(c)向所述脂質(zhì)膜添加水溶性溶液以使所述脂質(zhì)膜水合。
8.制備用于遞送核酸基因的LDL樣陽離子納米微粒的方法，所述方法包括 (a’ )將膽固醇酯、甘油三酸酯、磷脂、膽固醇和陽離子脂質(zhì)溶解在有機(jī)溶劑中； (b’ )向以上溶液中加入水并混合以制備混合物；和(c’ )攪拌所述混合物以形成均勻的溶液。
9.權(quán)利要求8的方法，其中，通過加熱溶解膽固醇酯、甘油三酸酯、磷脂、膽固醇和所述 陽離子脂質(zhì)。
10.權(quán)利要求8的方法，其中，通過向膽固醇酯、甘油三酸酯、磷脂、膽固醇和所述陽離 子脂質(zhì)添加有機(jī)溶劑將它們?nèi)芙狻?br> 11.權(quán)利要求7或10的方法，其中所述有機(jī)溶劑是選自氯仿、甲醇和環(huán)己烷的至少一種。
12.權(quán)利要求10的方法，所述方法還包括所述步驟(c’)之后的除去所述有機(jī)溶劑的 步驟(d’ )。
13.權(quán)利要求8的方法，其中，所述步驟(c’)中的攪拌通過選自聲處理、高壓均化和使 用膜流化裝置的任意方法來進(jìn)行。
14.用于將核酸基因遞送至目標(biāo)細(xì)胞的方法，所述方法使用權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng) 的LDL樣陽離子納米微粒。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述方法包括(1)制備核酸基因和所述LDL樣陽離子納米微粒的復(fù)合物；和(2)使所制備的復(fù)合物轉(zhuǎn)染目標(biāo)細(xì)胞。
16.權(quán)利要求15的方法，所述方法還包括所述步驟(1)之前的形成核酸基因-PEG綴合 物的步驟(1，)。
全文摘要
本申請公開了用于遞送核酸基因的具有改善的轉(zhuǎn)染效率和穩(wěn)定性的LDL樣陽離子納米微粒，所述陽離子納米微粒被模仿天然LDL的脂質(zhì)組分表面修飾和重建，公開了所述陽離子納米微粒的制備方法和使用其遞送核酸基因的方法。本發(fā)明的陽離子納米微?？捎行У貞?yīng)用于過度表達(dá)LDL受體的癌癥的治療。
文檔編號A61K9/51GK101903018SQ200880121111
公開日2010年12月1日 申請日期2008年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月17日
發(fā)明者樸泰寬, 金仁京, 金賢龍 申請人:韓國科學(xué)技術(shù)院;株式會社三養(yǎng)社