專利名稱：抗wssv和/或tsv的核酸藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗WSSV和/或TSV的核酸藥物。
背景技術(shù)：
對蝦養(yǎng)殖大面積發(fā)展興起于七、八十年代，我國沿海從南到北對蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)量很 大，對沿海經(jīng)濟(jì)的發(fā)展起到了很大的促進(jìn)作用。目前，病毒感染是影響對蝦養(yǎng)殖的嚴(yán)重威 脅，導(dǎo)致對蝦養(yǎng)殖場嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。其中，對蝦桃拉綜合征病毒(Taura Syndrome Virus, TSV)病和對蝦白斑綜合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)病是當(dāng)前嚴(yán)重危害對 蝦養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的兩種主要對蝦病毒性傳染病。根據(jù)世界銀行的蝦病報告，1994年對蝦 病毒病對全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)造成74%的產(chǎn)量損失，其經(jīng)濟(jì)損失達(dá)30億美元以上。1995年，國 際獸疫局(0ΙΕ)、聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)以及亞太地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖發(fā)展網(wǎng)絡(luò)中心(NACA)將該 病列為需要報告的水生動物病毒性疫病之一。對蝦白斑綜合征病毒(WSSV)病，于1992年首次發(fā)現(xiàn)于臺灣，1993年5 8月在我 國大陸沿海從南到北的養(yǎng)殖場暴發(fā)，日本等亞洲國家的對蝦養(yǎng)殖場也相繼暴發(fā)了此病。目 前，在亞洲已報道的該病毒的流行國家和地區(qū)包括朝鮮、泰國、韓國、印度尼西亞、越南、馬 來西亞、印度、斯里蘭卡、孟加拉國、中國大陸沿海及臺灣省等。1995年，美國德克薩斯州對 蝦養(yǎng)殖場出現(xiàn)白斑綜合征病毒，并在西半球的其它地區(qū)相繼暴發(fā)。至此，WSSV在世界范圍內(nèi) 傳播開來，每年給對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成幾百億元的經(jīng)濟(jì)損失，成為威脅對蝦養(yǎng)殖業(yè)的主要疾病。隨著市場需求的增加和養(yǎng)殖技術(shù)的不斷提高，我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展。但國內(nèi) 外市場對水產(chǎn)品質(zhì)量的要求越來越高，我國水產(chǎn)品藥殘超標(biāo)時有發(fā)生，水產(chǎn)品攜帶病毒、細(xì) 菌、寄生蟲、生物毒素的幾率較高，這就造成了水產(chǎn)品的安全障礙。對蝦屬于無脊椎動物，主 要是通過非特異性免疫(Non-specific immunity)力來抵抗病原的入侵。對蝦非特異性免 疫包括細(xì)胞免疫和體液免疫兩個方面，蝦體內(nèi)的細(xì)胞免疫和體液免疫作用緊密相關(guān)，血細(xì) 胞可合成并釋放體液免疫因子，細(xì)胞免疫反應(yīng)又受到體液免疫因子的介導(dǎo)和影響。目前主 要采用免疫增強(qiáng)劑來促進(jìn)或誘發(fā)宿主(對蝦)防御反應(yīng)，增強(qiáng)對蝦機(jī)體抗病能力。因而相 對于脊椎動物采用疫苗可以產(chǎn)生好的效果看，開發(fā)針對對蝦疫病新的治療和預(yù)防措施顯得 尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種無毒副作用，無耐藥性，能特異性直接殺死WSSV和/或 TSV，抗病毒效果好，無藥殘的抗WSSV和/或TSV的核酸藥物。本發(fā)明所提供的抗WSSV和/或TSV的核酸藥物，其活性成分為五種核酸，所述五 種核酸的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4和序列5。本發(fā)明的抗WSSV和/或TSV的核酸藥物，其中所述五種核酸為任意質(zhì)量比。本發(fā)明的抗WSSV和/或TSV的核酸藥物，其中所述五種核酸的質(zhì)量比為 1:1:1:1:1。
本發(fā)明的抗WSSV和/或TSV的核酸藥物，其中還包括可藥用載體或賦形劑。本發(fā)明的抗WSSV和/或TSV的核酸藥物無毒副作用，無耐藥性，能特異性直接殺 死WSSV和/或TSV，抗病毒效果好，無藥殘，能控制對蝦的白斑病病毒和桃拉綜合癥病毒的 感染，避免對蝦的大規(guī)模死亡，減少對蝦養(yǎng)殖的風(fēng)險，避免使用化學(xué)抗病毒及抗菌藥物所產(chǎn) 生的藥殘超標(biāo)等問題，以此提高對蝦產(chǎn)品的質(zhì)量。
具體實施例方式人工合成如下核酸VP19-1 :5，-UCAGAAUCGCUGUCCUUCUUU-3，；VP19-2 :5’ -⑶CAUCAUCAUCG⑶GACCUU-3’ ；VP19-3 :5， -CCUG⑶CCUGUUCUUAUAUUU-3，；VP28-1 :5’ -CGAUAUU⑶CU⑶⑶GG⑶UU-3’ ；VP28-2 :5’ -A⑶CACAGGAAUGCGGAGGUU-3’ ；VP28-3 :5’ -UUUCCAUUGCGGAUCUUGAUU-3’ ；CPl-I :5，-AUG⑶CGCU⑶GCUAAGUAUU-3，；CP1-2 :5， -AAUAUUUCCACGCCACCAAUU-3，；CP1-3 :5， -CACUACCAUAAGGGAGAUAUU-3，；CP2-1 :5，-UUGAGAACGGAAAUGACGAUU-3，；CP2-2 :5， -CUUUAGCAAGCGUACCUG⑶U-3，；CP2-3 :5， -UCUAAUUUCAGAAUUUCAAUU-3，。實驗條件小水箱，溫度20 士 2°C ；實驗動物日本對蝦，每尾10克左右，體長10 12cm ；毒株WSSV，TSV；病毒懸液的制備10g對蝦病料在500mL TNE緩沖液中勻漿，4°C、3500g離心5min， 上清液經(jīng)400目尼龍網(wǎng)過濾后，4°C 30000Xg離心30min，棄上清，沉淀懸于IOmL TM緩沖 液，經(jīng)3500\8離心5!1^11后，41 30000Xg離心20min，沉淀中的病毒粒子重懸浮于ImL TM 緩沖液，并用PCR進(jìn)行定量分析，將所制備的病毒懸液用生理鹽水調(diào)濃度。WSSV感染從日本對蝦倒數(shù)第二腹節(jié)處進(jìn)行注射；感染不給藥組對蝦每尾注射白 斑病毒懸液100 μ L ；空白對照組注射等量0. 9%無菌生理鹽水；感染給藥物組對蝦每尾注 射WSSV病毒懸液，拌料給核酸0. 2mg/天/只；注射后每日觀察、記錄活動情況，發(fā)病癥狀， 死亡情況等，如甲殼內(nèi)側(cè)有明顯白斑、活力迅速下降等；并連續(xù)觀察10d，每天換水30%，傍 晚時投餌一次。TSV感染TSV感染方法同于WSSV感染方式。WSSV檢測具體方法如下(1)煮沸法提取DNA 取患WSSV日本對蝦肌肉組織0. Ig分裝至1. 5mL離心管，每 管加入ImL pH為7. 4的PBS緩沖液，冰浴勻漿，將勻漿液6000rpm離心5min，取上清50 μ L 加入1 μ L蛋白酶K (10mg/mL)，55 V煮沸15min，然后立即放于冰上5min，以8000rpm離心 lOmin，上清做PCR模板；(2)引物
第一次擴(kuò)增引物Fl 5' -CGT GCC TGA ATC A GT ATG TAC GC-3'；Rl :5，-GAC GTT ACA ATA GAC CCA TGT TCG AT-3'；第二次擴(kuò)增引物F2 5' -CTC ATG TAC CAA ATC TGG GTT ACG A-3'；R2 :5， -CGA TAG ACC ACA A GT TCC GTA GGA-3，。(3) PCR檢測WSSV的體系及程序(i) PCR 反應(yīng)體系第一次擴(kuò)增2.5yL 10XPCR 緩沖液，0. 4μ L dNTP (2. 5mM)，0. 8 μ L 弓| 物 (F1+R1)，0. 3 μ L 的 TaqDNA 聚合酶(5U/ μ L)，2. 0 μ L 模板 DNA,最后加 19 μ L 的 ddH20 ；第二次擴(kuò)增2.5yL10XPCR 緩沖液，0. 4μ L dNTP (2. 5mM), 0. 8 μ 引物(F2+R2)， 0. 3 μ LTaq DNA聚合酶(5U/ μ L)，2. 0 μ L第一次擴(kuò)增的產(chǎn)物，最后加19 μ L的ddH20。(ii) PCR 擴(kuò)增條件:95V 2min ；35 個循環(huán):95°C，30s ；55°C，30s，72°C，lmin。最后 72°C IOmin 后在 10°C保存。(4) PCR完成后，進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳。第一次擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段長約為328bp，第二次擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段長約為258bp。TSV檢測具體方法如下擴(kuò)增體系(20 μ L) :Real-time PCR Premix 10 μ L, 25mmol/L MgCl2 0. 25 μ L, 2. 5mmol/LdNTP 0. 5 μ L, 5U/ μ L Taq DNA 聚合酶 0· 125 μ L, Tsv-F, Tsv-R 和 Tsv-T 濃度都 分別為0. 6,0. 4和0. 6 μ mol/L，體積均為2 μ L，其余用水補(bǔ)足。反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性20s ；然后按95°C變性10s、60°C退火延伸30s進(jìn)行40個 循環(huán)，最后于40°C結(jié)束反應(yīng)。最后采用軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。Tsv-F 5' -GCTTGCGTGGTGGGACTAAAT-3‘；Tsv-R 5' -CCTCCACTGGTTGTTGTATCAAAA-3‘；Tsv-T 5' -HEX-AATGCCTGCTAACCCAGTCGAAATT-ECLIPSE-3'。核酸在對蝦上的抗WSSV活性分析結(jié)果如表1所示；核酸在對蝦上的抗TSV活性分析結(jié)果如表2所示。表1.核酸在對蝦上的抗WSSV活性分析
5 表2.核酉髮在對蝦上的抗TSV活性分析

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從表1和表2的結(jié)果中確定VP19-l、VP19-2、VP28-2、CPl--1、CP1-3、CP2-2、CP2_:
抗WSSV活性和抗TSV活性較高。將VP19-1、VP28-2、CP1-1、CP2-3 和 CP2-3 按照質(zhì)量比為 1 1 1 1 1混
合制成核酸藥物。核酸藥物穩(wěn)定性分析流通蒸汽高溫105°C，20分鐘滅菌不影響其生物活性；50°C 恒溫箱內(nèi)存放2個月不影響其生物活性；室溫下存放24個月不影響其生物活性；-20°C存 放48個月不影響其生物活性。日本對蝦每尾10克左右，體長10 12cm，隨機(jī)分成14組，每組100只，每組分別 肌肉注射 VP19-1、VP19-2、VP19-3、VP28-1、VP28-2、VP28-3、CPl-U CP1-2、CP1-3、CP2-1、 CP2-2、CP2-3、核酸藥物、0. 9%無菌生理鹽水注射后每天觀察對蝦的活動情況及是否出現(xiàn) 死亡等，結(jié)果如表3。
表3.對蝦的毒性分析結(jié)果 ( 二)臨床試驗病毒濾液的制作分別取WSSV和TSV感染病蝦的鰓、上皮、肌肉、步足和頭部軟組 織，加入緩沖液PBS (PH7. 14)勻漿，8000g離心IOmin去沉淀，上清液用0. 45 μ m濾膜過濾， 得到可供感染的WSSV和TSV病毒濾液。投喂感染用上述獲得的WSSV和TSV病毒濾液分別注射感染健康對蝦，采集因此 感染而瀕臨死亡的蝦，_20°C保存，作為投喂感染模式的病蝦；感染時取該樣品的鰓部、上 皮、肌肉、步足和頭部，剪細(xì)制成肉糜，用青霉素和鏈霉素處理0. 5h，攻毒組幼蝦饑餓空胃 24h后投喂病蝦肌肉肉糜一次，6h以后，清除殘余物；然后繼續(xù)投喂各相應(yīng)餌料，同時設(shè)立 陰性對照。投藥途徑按照每千克飼料加入200毫克核酸藥物混入蝦飼料中，通過飼喂給藥。癥狀觀察感染后，每日觀察對蝦的活動情況，病死情況，10天后隨機(jī)抽取部分對 蝦進(jìn)行病毒檢測。WSSV和TSV的檢測方法同上。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析結(jié)果如表4和表5。
表4.對WSSV病毒的抗性分析結(jié)果 表 5.
以上的實施例僅僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進(jìn)行描述，并非對本發(fā)明的范圍進(jìn) 行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計精神的前提下，本領(lǐng)域普通工程技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方 案作出的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
8序號處理方式PCR檢出率存活率1核酸藥物3%98%2陽性對照組97%51%2陰性對照組099%
表 5.
對TSV病毒的抗性分析結(jié)果序號處理方式PCR檢出率存活率1核酸藥物4%97%2陽性對照組91%57%2陰性對照組095%
權(quán)利要求
抗WSSV和/或TSV的核酸藥物，其活性成分為五種核酸，所述五種核酸的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4和序列5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸藥物，其特征在于所述五種核酸為任意質(zhì)量比。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的核酸藥物，其特征在于所述五種核酸的質(zhì)量比為 1:1:1:1:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的核酸藥物，其特征在于還包括可藥用載體或賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗WSSV和/或TSV的核酸藥物，其活性成分為五種核酸，所述五種核酸的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4和序列5。本發(fā)明的抗WSSV和/或TSV的核酸藥物無毒副作用，無耐藥性，能特異性直接殺死WSSV和/或TSV，抗病毒效果好，無藥殘。
文檔編號A61P31/14GK101919873SQ20101022866
公開日2010年12月22日 申請日期2010年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月16日
發(fā)明者韓健寶 申請人:韓健寶