專利名稱：核酸模板的分類的制作方法
核酸模板的分類相關(guān)專利申請的交叉引用本申請請求2008年12月11日提交的美國專利申請?zhí)?1/201，551，2009年5月 21日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/180，350和2009年6月12日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/186，661的優(yōu)先權(quán)，他們的全部內(nèi)容通過引用納入本文用于所有目的。
背景技術(shù)：
開發(fā)各種所需應用的生物學過程分析試驗。例如對關(guān)鍵生物學通路活性的監(jiān)測可導致更好地了解這些系統(tǒng)的功能以及可能破壞這些系統(tǒng)正常功能的因素。事實上，由于特定生物學通路的運行或中斷所引起的各種疾病是許多醫(yī)學研究的焦點。通過對這些通路的了解，人們就可模擬出影響它們的方法來預防疾病發(fā)生或在其有所表現(xiàn)時減輕癥狀。開發(fā)生物學過程監(jiān)測方法的一個老套例子存在于藥學研究和開發(fā)領域。具體說， 為促進分析，常常在體外系統(tǒng)中重現(xiàn)或模擬這些通路中與治療有關(guān)的生物學通路，或其中的各步驟或各步驟的某些亞組。通過觀察存在和沒有潛在治療組合物，如藥物組合物或其他物質(zhì)時，這些步驟或整個通路的進程，人們可以鑒定這些組合物影響體外系統(tǒng)，和可能有益地影響正有通路在以有害方式發(fā)揮作用的生物體的能力。具體的例子有，甲基轉(zhuǎn)移酶對胞嘧啶5’位點的可逆甲基化是最為廣泛研究的外遺傳修飾之一。在哺乳動物中，5-甲基胞嘧啶(5-MeC)常見于CpG 二核苷酸，后者常簇集存在于轉(zhuǎn)錄起始位點處或其附近被稱為 CpG島的區(qū)域內(nèi)。CpG島區(qū)內(nèi)胞嘧啶的甲基化可干擾轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，并與轉(zhuǎn)錄抑制基因調(diào)節(jié)相關(guān)。此外，已知DNA甲基化是哺乳動物發(fā)育所必需，并且與癌癥和其他疾病過程相關(guān)。 近來，在大腦的某些類型細胞中鑒定到新的5-羥甲基胞嘧啶外遺傳標志，提示其在神經(jīng)元功能的外遺傳控制中具有作用(S. Kriaucionis 等，Science 2009,324(5929) :929-30, 全文通過引用納入本文用于所有目的)。本技術(shù)領域的以下文獻提供了關(guān)于胞嘧啶甲基化及其對基因調(diào)控、發(fā)育及疾病過程影響的進一步信息A. Bird，Genes Dev 2002,16,6 ； M-Gardiner-Garden等，J Mol Biol 1987,196,261 ；S. Saxonov等，Proc Natl Acad Sci U S A 2006，103，1412 ;R. Jaenisch 等，Nat Genet 2003，33 增刊，245 ;E. Li 等，Cell 1992，69， 915 ;Α· Razin 等，Hum Mol Genet 1995，4 特刊，1751 ;Ρ· A. Jones 等，Nat Rev Genet 2002， 3，415 ;P. A. Jones 等，Nat Genet 1999，21，163 禾口 K. D. Robertson，Nat Rev Genet 2005，6， 597，所有這些的全文通過引用納入本文用于所有目的。人類基因甲基化繪圖是比確定人類基因組更復雜的任務，因為甲基化狀態(tài)在組織類型之間不同，隨年齡變化，使甲基化狀態(tài)有所不同，并被環(huán)境因素該變(P.A. Jones等， Cancer Res 2005，65，11M1，其全文通過引用納入本文用于所有目的)。因為現(xiàn)有的DNA測序技術(shù)對樣品制備的要求和短讀取長度的特點，全面、高分辨率地分析給定樣品的全基因組甲基化模式是很有難度的(K. R-Pomraning等，Methods 2009，47，142，其全文通過引用納入本文用于所有目的)。亞硫酸氫鹽測序法是現(xiàn)有單核苷酸分辨率的甲基化分析方法中的上選(S. Beck 等，Trends Genet 2008，24，231 和 S. J. Cokus 等，Nature 2008，452，215，它們的全文通過引用納入本文用于所有目的)。用亞硫酸氫鹽處理DNA可使甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，但不轉(zhuǎn)化 5-MeC(M. Frommer 等，Proc Natl Acad Sci U S A 1992，89，1827，其全文通過引用納入本文用于所有目的)。然后擴增該DNA(將所有的尿嘧啶轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶)，再用各種方法分析，包括基于微陣列的技術(shù)(R. S. Gitan等，Genome Res 2002，12，158，其全文通過引用納入本文用于所有目的)或第二代測序技術(shù)(K. H. Taylor等，Cancer Res 2007,67,8511 和R. Lister等，Cell 2008，133，523，二者的全文通過引用納入本文用于所有目的)。雖然亞硫酸氫鹽技術(shù)大大促進了甲基化DNA的分析，但它們也有幾種缺點。首先，亞硫酸氫鹽測序要求大量時間制備樣品(K. R. Pomraning等，同上)。其次，使非甲基化胞嘧啶完全轉(zhuǎn)變成尿嘧啶的苛刻反應條件可導致DNA降解(C. Grunau等，Nucleic Acids Res 2001,29, E65, 其全文通過引用納入本文用于所有目的)，因此，需要樣品的起始用量很大，這對某些應用可能成為問題。此外，由于亞硫酸氫鹽測序依賴于微陣列或第二代DNA測序技術(shù)來讀取甲基化狀態(tài)，它也有這些方法具有的相同局限性。對基于陣列的過程，亞硫酸氫鹽導致的序列復雜性降低使得難于設計出進行全基因組分析所需的獨特探針(S. Beck等，同上)。大多數(shù)第二代DNA測序技術(shù)采用短讀取(short reads)，因此難以對高度重復基因組區(qū)域進行排列比對(KUomraning等，同上)。因為許多CpG島位于這種區(qū)域內(nèi)，這就特別成問題。鑒于這些局限，亞硫酸氫鹽測序也不太適合甲基化的從頭分析(S. Beck等，同上)。另一廣泛應用的技術(shù)，甲基化DNA免疫沉淀(MeDIP)技術(shù)中，采用抗5_MeC的抗體來富集甲基化DNA序列(M. Weber等，Nat Genet 2005，37，853，其全文通過引用納入本文用于所有目的)。MeDIP對于全基因組甲基化狀態(tài)的評估有許多優(yōu)點，但它提供的堿基分辨率不如亞硫酸氫鹽處理方法那樣高。此外，它也受現(xiàn)有微陣列和第二代測序技術(shù)的相同局限的限制。旨在提高我們對于人類甲基化組認識的研究努力會極大地受益于新的、不再受限于上述局限的甲基化分析技術(shù)的開發(fā)。因此，存在對于核酸序列中的修飾，特別是核酸甲基化修飾的改進檢測技術(shù)的需要。通常，模擬的生物學系統(tǒng)依賴于大宗反應確定生物反應的總體趨勢并提供該大宗系統(tǒng)如何與不同效應器反應的指示。雖然這類系統(tǒng)可用作體內(nèi)大宗反應的模型，但在對這些大宗反應結(jié)果進行平均時丟失了大量信息。具體說，個別分子復合體的活性和其所受影響的信息通常不能從這類大宗數(shù)據(jù)收集方法中得到。核酸合成的單分子實時分析已顯示能提供勝過測序方法中常用的核酸合成監(jiān)測法的有力優(yōu)勢。具體說，在監(jiān)測核酸聚合酶復制核酸的同時監(jiān)測其合成過程，可獲得經(jīng)數(shù)百萬年進化而完善的系統(tǒng)的優(yōu)點。特別是，天然的DNA合成過程能夠在極短時間內(nèi)以對于被復制模板的極高保真度復制全基因組。本發(fā)明涉及用于監(jiān)測生物學反應的進程和效應的多種不同單分子實時分析，特別是檢測核酸序列中的修飾。例如，本發(fā)明提供了基于對單個聚合酶分子動力學的實時、高多重性觀察的直接甲基化測序技術(shù)。該技術(shù)將提供對快速、經(jīng)濟的甲基化模式分析，即使是基因組的重復區(qū)域。發(fā)明簡述本發(fā)明一般涉及對修飾核酸序列的檢測，特別是采用實時直接檢測方法對核酸序列中甲基化堿基的檢測。預期本發(fā)明將對旨在闡明DNA甲基化在人類健康中作用的研究有重大影響。在本發(fā)明的某些方面，提供鑒定核酸分子中修飾的方法。通常，提供包含所述修飾的模板核酸和能加工該模板的酶。使模板核酸與酶接觸，然后監(jiān)測酶對模板的加工。檢測加工過程中的變化，這種變化是模板中存在修飾的指示?？捎帽景l(fā)明方法檢測的示范性修飾包括但不限于甲基化堿基(如5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤等)，假尿苷堿基，7，8-二氫-8-氧鳥嘌呤堿基，2’-0-甲基衍生堿基，缺口，脫嘌呤位點，脫嘧啶位點，嘧啶二聚體，順式模板(cis-platen)交聯(lián)產(chǎn)物，氧化損傷，水解損傷，大堿基加合(bulky base adducts), 胸腺嘧啶二聚體，光化學反應產(chǎn)物，鏈間交聯(lián)產(chǎn)物，錯配堿基，二級結(jié)構(gòu)和結(jié)合試劑。在優(yōu)選實施方式中，摻入酶合成的新生鏈中的核苷酸或其類似物被顯著標記，使得能鑒定摻入特定核苷酸或核苷酸類似物的序列。在某些優(yōu)選實施方式中，通過磷酸基團，如α磷酸基團以外的磷酸基團連接標記與核苷酸或核苷酸類似物。如此可在摻入新生鏈時從核苷酸或核苷酸類似物上除下標記。在一些實施方式中，模板核酸用酶加工前經(jīng)過處理，例如改變其修飾。這種處理可以是化學或酶處理，包括，例如糖基化酶修飾、亞硫酸氫鹽修飾、DMS修飾、胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶修飾、TETl修飾和胞苷脫氨酶修飾。在一些實施方式中，通過酶將非天然核苷酸類似物 (如嵌二萘類似物)摻入到合成的新生鏈中。在一些實施方式中，所述方法包括處理模板和非天然核苷酸類似物摻入到新生鏈中。在一些實施方式中，非天然核苷酸類似物摻入新生鏈中的位置與模板的修飾配對。例如，模板中的甲基化胞嘧啶可與修飾的鳥嘌呤核苷酸類似物配對；模板修飾可與非天然核苷酸類似物配對以形成非天然堿基對，如異胞嘧啶與異鳥嘌呤；5-甲基異胞嘧啶與異鳥嘌呤；Im-N°與Ihi-On ；A*與f ；和8-oxoG與腺嘌呤。在一些實施方式中，非摻入性的核苷酸類似物與模板/酶復合體結(jié)合，但不摻入新生鏈中，這種 “無效臂合作用的檢測作為模板中有修飾的指示。這種非摻入性的核苷酸類似物優(yōu)選被顯著標記以利于監(jiān)測，并可選地，用以區(qū)分這種結(jié)合與含標記的可摻入核苷酸類似物的摻入。在某些實施方式中，模板核酸包含內(nèi)部互補區(qū)(如雙鏈部分)和至少一條單鏈部分，優(yōu)選其修飾位于至少一個內(nèi)部互補區(qū)中。在某些實施方式中，模板是環(huán)形模板。在某些實施方式中，模板是包含至少二個內(nèi)部互補區(qū)的環(huán)形模板。在某些實施方式中，所述酶是聚合酶，如DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶或它們的衍生物或變體。在優(yōu)選實施方式中，所述酶是能鏈置換的聚合酶。在特定實施方式中，所述酶是Φ四聚合酶，可選地，包含至少一個以下位點的突變Κ392、Κ422、193、Μ188、Κ392、V399、Τ421、Κ422 ；S95、ΥΙΟΙ、Μ102 ；Q99、 L123、Κ124、Τ189、Α190 ；G191、S388 ；Ρ127、L384、Ν387、S388 和 L389、Υ390 及 G391。在本發(fā)明各種實施方式中所監(jiān)測的酶加工模板過程中變化的例子包括但不限于 動力學、持續(xù)合成能力(processivity)、信號特征、差錯度量(error metrics)、信號內(nèi)容等。在一些實施方式中，改變只發(fā)生在修飾處，在其它實施方式中，改變發(fā)生在靠近修飾的一個或多個位置，也可包括修飾處。在某些方面，所述方法還包括繪制修飾圖。在某些優(yōu)選實施方式中，繪制修飾圖包括在臨檢測加工中的改變之前，檢測加工中的改變期間和/或剛檢測加工中的改變之后所產(chǎn)生的一部分讀取序列進行分析以確定與模板核酸互補的序列；測定與模板核酸互補序列的補體；繪制靠近與模板核酸互補序列的補體處的模板核酸位置上的修飾。在某些實施方式中，所述加工中可指示修飾的變化是加工過程中的動力學差異(如檢測到脈沖間隔期(interpulse duration)，脈沖寬度、持續(xù)合成能力等中的一個或多個改變)和/或差錯度量的改變(如精確度、不導致?lián)饺氲慕Y(jié)合事件的增加等)。加工過程中的改變可表明模板核酸中存在的修飾類型，因為不同類型的修飾對酶的活性和/或保真度有不同影響。在優(yōu)選實施方式中，在酶加工模板過程中進行實時監(jiān)測。在優(yōu)選實施方式中，將模板核酸與酶形成的復合體固定在基板的反應位置，在更優(yōu)選的實施方式中，將多個復合體固定在基板上光可分辨的反應位置，其中固定在反應位置之一處的一個復合體可與固定在其它反應位置的其它復合體光可分辨。在某些實施方式中，光可分辨的反應位置是基板中的納米級孔，可以是光限制件，如零模式波導管。在優(yōu)選實施方式中，所述模板核酸是監(jiān)測期間彼此可光分辨的多種模板核酸。優(yōu)選模板核酸在接觸酶之前不經(jīng)擴增。在一些實施方式中，所述修飾是模板核酸中的二級結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾環(huán)，所述修飾的變化是動力學變化，如脈沖間隔期延長或脈沖寬度增加。鑒定二級結(jié)構(gòu)改變的某些方法通常包括暫停前和暫停后模板核酸的讀取序列；鑒定暫停前產(chǎn)生的與暫停后所產(chǎn)生第二部分讀取序列互補的第一部分讀取序列；至少根據(jù)所述第一部分與第二部分的核苷酸組成，確定加工過程中模板核酸第一部分與第二部分退火形成發(fā)夾環(huán)的可能性。在本發(fā)明另一方面，提供檢測單個核酸模板上試劑結(jié)合的方法。在某些實施方式中，這種方法通常包括提供單個核酸模板與聚合酶的復合體；將反應混合物引入該復合體，其中所述反應混合物包含所述試劑；監(jiān)測聚合酶合成的多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸與所述單個核酸模板互補，合成中的變化可表明所述試劑與單個核酸模板結(jié)合。適用于這種方法的試劑的例子包括但不限于轉(zhuǎn)錄因子、聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、組蛋白、限制性酶、抗體、核酸結(jié)合蛋白和核酸結(jié)合劑。適用于這種方法的單個核酸模板的例子包括但不限于雙鏈DNA、雙鏈RNA、單鏈DNA、單鏈RNA、DNA/RNA雜交體，和包含雙鏈與單鏈區(qū)的模板。在本發(fā)明的某些方面，測定了所述試劑的一致結(jié)合位點。這種測定包括，例如，在存在該試劑時對一組單個核酸模板進行多重合成測序反應產(chǎn)生一組受結(jié)合影響的新生多聚核苷酸序列；在缺少該試劑時對該組單個核酸模板進行多重合成測序反應產(chǎn)生一組全長新生多聚核苷酸序列；分析受結(jié)合影響的新生多聚核苷酸序列，以確定在存在所述試劑進行合成測序反應期間所述試劑與單個核酸模板結(jié)合的位置；和鑒定該位置處與全長新生多聚核苷酸序列的一致序列，從而鑒定所述試劑的一致結(jié)合位點。在某些實施方式中，所述受結(jié)合影響的新生多聚核苷酸序列是截短的新生多聚核苷酸序列；在其它實施方式中，所述受結(jié)合影響的新生多聚核苷酸序列是其合成在所述試劑結(jié)合位置處暫停的新生多聚核苷酸序列。在本發(fā)明還有一方面，提供檢測合成測序反應期間單個核酸模板中修飾的方法。 例如，這種方法可包括提供單個核酸模板與聚合酶的復合體；將反應混合物引入該復合體，反應混合物中包含能特異性結(jié)合所述修飾的試劑；和監(jiān)測聚合酶合成的多聚核苷酸，其中合成的多聚核苷酸與該單個核酸模板互補，并且該多聚核苷酸合成的暫?；蛑兄贡砻魉鲈噭┙Y(jié)合于所述單個核酸模板，從而得以檢測所述單個核酸模板中的修飾。在某些實施方式中，所述修飾是8-氧鳥嘌呤損傷，和/或所述試劑選自下組hOGGl、FPG、yOGGl、AlkA、 Nth、Nei, MutY, UDG, SMUG、TDG, NEIL、抗8-氧鳥嘌呤的抗體、或其結(jié)合域。在其它實施方式中，所述修飾是甲基化堿基，和/或所述試劑是選自下組的蛋白質(zhì)MECP2、MBDU MBD2、MBD4、UHRF1、抗甲基化堿基的抗體、或其結(jié)合域。在還有其它實施方式中，所述修飾是核酸模板中二級結(jié)構(gòu)的形成。優(yōu)選所述復合體被固定在光限制件中。所述模板可包括，例如，線形單鏈核酸、環(huán)形單鏈核酸、線形雙鏈核酸、環(huán)形雙鏈核酸、或它們的組合物。在某些實施方式中，模板核酸中的修飾可以通過例如合成測序反應中，在反應混合物中加入損傷修復機制所需組分，得以修復。在某些實施方式中，合成測序反應的序列讀取長度比用所述單個核酸模板與聚合酶復合體但缺少所述試劑與損傷修復機制進行合成測序反應的更長，。在本發(fā)明另一方面，提供在合成測序反應期間繞過單個核酸模板中一個或多個修飾處的方法。某些示范性方法包括提供所述單個核酸模板與測序引擎的復合體；將反應混合物引入該復合體，所述反應混合物包含繞道聚合酶；啟動合成測序反應，監(jiān)測測序引擎合成多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸與單個核酸模板互補，多聚核苷酸合成的暫?；蛑兄贡砻鳒y序引擎遇到單個核酸模板的修飾處；隨后監(jiān)測繞道聚合酶合成的多聚核苷酸， 其表明該修飾處被繞過；每次遭遇到單個核酸模板中的下一修飾處時，重復此監(jiān)測步驟， 從而在合成測序反應期間繞過單個核酸模板中的一個或多個修飾處。在某些實施方式中， 繞道聚合酶包含可檢測標記，合成測序反應期間檢測到該可檢測標記的信號表明繞道聚合酶在活躍地合成多聚核苷酸。在優(yōu)選實施方式中，合成測序反應的讀取序列長度比采用單個核酸模板與聚合酶復合體但缺少繞道聚合酶進行的另外合成測序反應的更長。在特定實施方式中，所述反應混合物包含多個不同的繞道聚合酶和持續(xù)合成因子(processivity factor)。優(yōu)選將單個核酸模板、測序引擎和繞道聚合酶中至少一種直接或間接地固定在光限制件中。例如，可通過與固定在光限制件中的寡核苷酸引物雜交固定所述模板。在某些實施方式中，用測序引擎在單個反應位點處多次加工單個核酸模板，進一步產(chǎn)生冗余的序列數(shù)據(jù)。用于本方法的核酸模板可以是環(huán)形和/或可包含感興趣核酸區(qū)段的多個拷貝。此外，在某些實施方式中，合成測序反應產(chǎn)生的多聚核苷酸包含與所述感興趣區(qū)段互補區(qū)段的多個拷貝，從而可進一步產(chǎn)生冗余的序列數(shù)據(jù)。在其他方面，提供了新型組合物。例如，在某些實施方式中，本發(fā)明的組合物包含基板，其上具有的反應位點能與基板上其它反應位點光可分辨；固定在該反應位點上的模板與測序引擎的單一復合體；可摻入核苷酸或核苷酸類似物的混合物；模板核酸含有至少一個修飾，模板的修飾處或修飾附近的加工與模板遠離修飾處不同。在某些實施方式中，所述修飾是模板中的非天然堿基。修飾可位于模板核酸中與測序引擎合成的新生鏈互補的那條鏈中，或模板核酸中被測序引擎置換的那條鏈中。在某些優(yōu)選實施方式中，模板核酸包含內(nèi)部互補區(qū)域，可選地，所述修飾位于該內(nèi)部互補區(qū)域之一中。某些實施方式還包括至少一種類型的非摻入性核苷酸類似物。某些實施方式包括至少一種類型的非天然可摻入性核苷酸類似物。優(yōu)選本發(fā)明組合物中的一個或多個或所有的核苷酸或核苷酸類似物含有可將不同類型的核苷酸或核苷酸類似物彼此區(qū)分的不同標記。本發(fā)明的組合物也可包含測序引擎以外的能結(jié)合所述修飾和/或能化學或酶促改變所述修飾的試劑。優(yōu)選本發(fā)明的組合物包含測序引擎產(chǎn)生的新生鏈，所述新生鏈與模板核酸互補，可選地，包含與模板核酸互補區(qū)域的多個拷貝。此外，某些組合物包含基板中的納米級孔，反應位點安置在該納米級孔中，如零模式波導管中。在本發(fā)明其它方面，提供了鑒定核酸模板中修飾的系統(tǒng)。在某些優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的系統(tǒng)包含固相支持物，其上(如在反應位點，如納米級孔中，如零模式波導管中)安置有聚合酶復合體，所述聚合酶復合體包含含有修飾的核酸模板；接受固相支持物的固定平臺；與該固相支持物至少一部分進行光通信以檢測其發(fā)射信號的光系統(tǒng)；與固定平臺或光系統(tǒng)操作性連接用于使光系統(tǒng)或固相支持物中的一方相對另一方移動的轉(zhuǎn)換系統(tǒng)；和與光系統(tǒng)操作性連接的數(shù)據(jù)加工系統(tǒng)。所述聚合酶復合體優(yōu)選包含具有加工核酸模板活性的聚合酶。所述聚合酶復合體更優(yōu)選包含能通過模板指導的合成持續(xù)合成新生鏈的聚合酶。在優(yōu)選的實施方式中，所述光系統(tǒng)能檢測固相支持物在核酸模板加工期間發(fā)出的信號。在還有其他方面，本發(fā)明提供用于將反應數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)變成修飾檢測數(shù)據(jù)的機器執(zhí)行方法，其中反應數(shù)據(jù)代表了根據(jù)模板核酸的核苷酸序列合成新生鏈的合成測序反應期間的一系列活動，而修飾檢測數(shù)據(jù)代表一個或多個修飾在模板核酸中的存在。優(yōu)選通過在機器用戶介面中實施該機器執(zhí)行方法的一個或多個步驟，所述機器裝有存儲在機器可讀介質(zhì)中的指令和執(zhí)行所述指令的處理器。在本發(fā)明的最后方面，提供了計算機程序產(chǎn)品。在某些實施方式中，轉(zhuǎn)變反應數(shù)據(jù)的機器執(zhí)行方法包括區(qū)分真正摻入與隨機脈沖的分類器，基于隱馬爾柯夫模型構(gòu)架的分割算法，和/或根據(jù)條件隨機場框架(conditional random field framework)的分割算法，進行分類。在某些特定實施方式中，所述方法可鑒定模板中隨機脈沖密度高于真正摻入的區(qū)域。在某些特定實施方式中，所述方法可鑒定模板中IPD較高的區(qū)域。本發(fā)明的示范性計算機程序產(chǎn)品通常包括計算機可用介質(zhì)，該介質(zhì)中載有計算機可讀程序代碼，所述計算機可讀程序代碼適合于被運行以執(zhí)行本發(fā)明的機器執(zhí)行方法；和機器可讀介質(zhì)，用以儲存所述機器執(zhí)行方法的一個或多個步驟所得的結(jié)果。附圖簡要說明

圖1提供了單分子核酸實時(SMRT )核酸測序的示范性說明。圖2提供了各類脈沖跟蹤反應數(shù)據(jù)的說明性示例。圖3示意顯示了相對DNA聚合酶活性位點位于其5'方向堿基上的5_MeC的結(jié)構(gòu)模型。圖4顯示了 5-堿基DNA甲基化測序的示范性實施方式。圖4A描述基因組DNA片段化以產(chǎn)生DNA模板。圖4B顯示DNA糖基化酶從模板上切去5_MeC。圖5顯示了反應的說明性實施方式，反應包含線形模板和能識別單鏈模板中損傷的損傷結(jié)合試劑。圖6顯示了本發(fā)明的一種實施方式，包含環(huán)形模板和能識別雙鏈模板中損傷的損傷結(jié)合試劑。圖7顯示了對真正摻入(實線)與隨機脈沖(虛線)觀察隨時間的變化。圖8提供了用于測序跟蹤期間劃分暫停(P)狀態(tài)與測序狀態(tài)的簡單隱馬爾柯夫模型的說明性示例。圖9提供了本發(fā)明系統(tǒng)的說明性示例。圖IOA提供了本發(fā)明模板核酸的示范性示意圖。圖IOB提供如圖IOA描述的模板核酸的脈沖間隔期的繪圖。圖11提供了含5-甲基胞嘧啶修飾的模板核酸中IPD比例對模板位置所作的圖。圖12提供了含5-甲基胞嘧啶修飾的模板核酸中IPD比例對模板位置所作的圖。
圖13A提供了本發(fā)明的示范性模板核酸的示意圖。圖1 提供了圖13A描述的模板核酸的脈沖間隔期圖。圖13C提供了圖1 中數(shù)據(jù)的ROC曲線。圖14提供了包含N6-甲基腺嘌呤修飾的模板核酸中IPD比例對模板位置所作的圖。圖15提供了包含5-羥甲基胞嘧啶修飾的模板核酸中IPD比例對模板位置所作的圖。圖16提供了包含5-羥甲基胞嘧啶修飾的模板核酸中脈沖寬度比例對模板位置所作的圖。圖17提供了包含8-氧鳥嘌呤修飾的模板核酸中IPD比例對模板位置所作的圖。圖18提供了包含8-氧鳥嘌呤修飾的模板核酸中脈沖寬度比例對模板位置所作的圖。發(fā)明詳述I.概述本發(fā)明總體涉及用于檢測核酸序列中修飾的方法、組合物和系統(tǒng)，在特別優(yōu)選的方面，它們用于通過單分子核酸分析檢測模板序列中的甲基化核苷酸。在核酸序列中檢測出修飾的能力有助于繪制各種類型修飾和/或多組核酸序列，如跨越一組mRNA轉(zhuǎn)錄物、跨越感興趣染色體區(qū)域或跨越全基因組的圖譜。所繪制的修飾圖譜然后可以與核酸的轉(zhuǎn)錄活性、核酸二級結(jié)構(gòu)、siRNA活性、mRNA翻譯動態(tài)、DNA和RNA結(jié)合蛋白的動力學和/或親和力、及核酸(如DNA和/或RNA)代謝的其他方面相關(guān)聯(lián)。雖然就單鏈DNA分子(如單鏈DNA模板)中的修飾核苷酸或其它修飾的檢測對本發(fā)明的某些實施方式進行描述，但本發(fā)明的多種方面可應用于許多不同類型的核酸，包括， 例如單鏈和雙鏈核酸,可包括 DNA、RNA (如 mRNA、siRNA、microRNA、rRNA、tRNA、snRNA 等)、 RNA-DNA雜交體、PNA、LNA、嗎啉代與其它RNA和/或DNA模擬物及其衍生物、或上述的任意組合。本文提供的用于本方法的核酸、組合物和系統(tǒng)可以全部由天然核苷酸組成，或可以包含能與天然核苷酸配對或能與相同或不同的非天然堿基/核苷酸配對的非天然堿基/核苷酸(如合成的和/或工程改造的)。在某些優(yōu)選的實施方式中，所述核酸包含單鏈與雙鏈區(qū)域的組合，如2009年3月27日提交的U. S. S. N. 12/383，855和12/413，258中所述的模板， 它們的全文通過引用納入本文用于所有目的。具體說，需要逆轉(zhuǎn)錄酶作PCR擴增的技術(shù)因為所作處理不能在擴增子中保留修飾，因此難以檢測mRNA的修飾。本發(fā)明提供的方法不需要進行這種擴增而能分析mRNA分子的修飾。一般來說，本發(fā)明的方法包括監(jiān)測分析反應以收集“反應數(shù)據(jù)”，此反應數(shù)據(jù)可表明反應的進展。反應數(shù)據(jù)包括直接收集的反應數(shù)據(jù)，以及對該直接收集數(shù)據(jù)作不同處理所得到的結(jié)果，它們的任何一種或組合可作為模板核酸中存在修飾的信號。例如，某些類型的數(shù)據(jù)是在反應過程中實時收集，例如與反應動力學相關(guān)的度量、持續(xù)合成能力、信號特征等。信號特征視所監(jiān)測分析反應的類型而不同。例如，一些反應采用可檢測標記來標記一種或多種反應組分，可檢測標記的信號特征包括但不限于信號的類型(如波長、電荷等) 和信號的形狀(如高度、寬度、曲線等)。另外，也可采用多種信號的信號特征(如瞬時靠近的信號)，包括，例如，反應期間信號之間的距離、額外(如不與反應進程對應)信號的數(shù)目、內(nèi)部互補性和局部信號內(nèi)容(即給定信號之前和/或之后的一種或多種信號)。例如，模板引導的測序反應常常聯(lián)合多個核苷酸摻入事件的信號數(shù)據(jù)以產(chǎn)生所合成新生鏈的序列讀取，利用這種序列讀取產(chǎn)生模板鏈序列，例如通過互補性。對實時反應數(shù)據(jù)作統(tǒng)計學分析，產(chǎn)生其它類型的反應數(shù)據(jù)，包括，例如，精確度、準確性、一致性等。在一些實施方式中， 也可利用所監(jiān)測反應以外來源的數(shù)據(jù)。例如，可將核酸測序反應產(chǎn)生的序列讀取與重復實驗產(chǎn)生的序列讀取作比較，或與來自相同或相關(guān)生物學來源的已知或產(chǎn)生的參比序列作比較?；蛘?，或另外，可用未修飾的核苷酸擴增一部分模板核酸制品然后測序以提供實驗參比序列，與沒有擴增的原模板序列作比較。雖然本文詳細描述了利用特定類型反應數(shù)據(jù)檢測某種類型修飾的某些具體實施方式
，但應理解所述方法、組合物和系統(tǒng)不限于這些具體實施方式
。可綜合不同類型的反應數(shù)據(jù)以檢測各種修飾，在某些實施方式中，可在對單個模板的單次反應中檢測和鑒定一種以上的修飾。基于本文提供的教導，對本發(fā)明詳述實施方式的這些變化對本領域普通技術(shù)人員是顯而易見的。在某些實施方式中，產(chǎn)生和分析冗余的序列信息以檢測模板核酸中的一種或多種修飾?？捎酶鞣N方法實現(xiàn)這種冗余度，包括用同一初始模板進行多次測序反應，例如采用陣列形式，如ZMW陣列。在一些實施方式中，不太可能在給定模板的所有拷貝中發(fā)生損傷，可綜合所述多次反應產(chǎn)生的反應數(shù)據(jù)(如序列讀取、動力學、信號特征、信號內(nèi)容和/或進一步統(tǒng)計學分析的結(jié)果)，進行統(tǒng)計學分析以確定模板的一致序列。以此方式，模板第一拷貝中某區(qū)域的反應數(shù)據(jù)可以用模板第二拷貝中同一區(qū)域的反應數(shù)據(jù)進行補充和/或校正。類似地，可擴增模板(如通過滾動循環(huán)擴增)產(chǎn)生含模板的多個拷貝的多聯(lián)體，測定該多聯(lián)體的序列，從而產(chǎn)生內(nèi)在冗余的測序讀取。如此，該多聯(lián)體第一區(qū)段(對應于模板第一區(qū))的序列數(shù)據(jù)可利用多聯(lián)體也對應于模板第一區(qū)的第二區(qū)段的序列數(shù)據(jù)進行補充和/或校正。 或者，或另外，對模板進行重復測序反應以產(chǎn)生冗余的序列信息，可以分析該信息以更全面地鑒定模板中所存在的修飾。本文所用術(shù)語“修飾”不僅指核酸的化學修飾，而且指核酸構(gòu)型的變化、試劑與核酸的相互作用(例如，與核酸結(jié)合)和與核酸相關(guān)的其它干擾。因此，修飾位置是在核酸內(nèi)發(fā)生修飾的基因座(如單個核苷酸或多個毗連或不毗連的核苷酸)中。對于雙鏈模板， 修飾可發(fā)生在與聚合酶加工模板合成的新生鏈互補的鏈中，或可發(fā)生在被置換鏈中。雖然本發(fā)明的某些具體實施方式
就5-甲基胞嘧啶的檢測作了描述，但也考慮了其它類型的核苷酸修飾(例如，N6-甲基腺苷、N3-甲基腺苷、N7-甲基鳥苷、5-羥甲基胞苷、其它甲基化核苷、假尿苷、硫尿核苷、異鳥苷、異胞苷、二氫尿苷、辮苷、懷俄苷、肌苷、三唑、二氨基嘌呤、8-氧鳥苷、和腺苷、胞苷、鳥苷及尿苷的2’ -0-甲基衍生物)。本領域普通技術(shù)人員知曉這些和其它的修飾，它們的進一步描述可參見，例如Narayan P等(1987)Mol Cell Biol 7(4) :1572-5 ；Horowitz S 等(1984)Proc Natl Acad Sci U.S. Α. 81(18) :5667-71; "RNA' s Outfits :The nucleic acid has dozens of chemical costumes (RNA 的裝備 核酸有幾十種化學戲裝)” (2009) C&EN ；87 (36) :65-68 ；Kriaucionis 等 Q009)kience 324(5929) :929-30 ；Tahiliani 等(2009)Science 324(5929) :930-35 ；Matray ^ (1999) Nature 399(6737) :704-8 ；Ooi 等(2008) Cell 133 :1145-8 ；Petersson等(2005) J Am Chem Soc. 127(5) :1424-30 Johnson 等(2004)32(6) :1937-41 ；Kimoto 等(2007) Nucleic Acids Res.35(16) :5360-9 ;Ahle 等(2005)Nucleic Acids Res 33(10) :3176 ;Krueger 等 Curr Opinions in Chem Biology 2007,11(6) :588) ；Krueger 等(2009)Chemistry & Biology16(3) 242 ；McCulIough 等(1999)Annual Rev of Biochem 68:255 和 Liu 等(2003) Science 302(5646) :868_71，它們的全文通過引用納入本文用于所有目的。修飾還包括在模板核酸中存在非天然堿基對，包括但不限于羥基吡啶酮與吡啶并嘌呤的同質(zhì)或異質(zhì)堿基對、吡啶-2，6- 二羧酸與吡啶金屬堿基對、吡啶-2，6- 二羧酰胺與吡啶金屬堿基對、金屬介導的嘧啶堿基對T-Hg(II)-T和C-Ag(I)-C、和2，6-雙(乙基巰甲基)吡啶核苷堿基的金屬-同質(zhì)堿基對Spy，和嘌呤或嘧啶堿基的炔基、烯胺基、醇基、咪唑基、胍基和吡啶基置換產(chǎn)物(Wettig 等(2003) J Inorg Biochem 94 :94-99 ；Clever 等(2005) Angew Chem Int Ed 117 :7370-7374 ；Schlegel 等(2009) Org Biomol Chem 7(3) :476-82 ；Zimmerman 等(2004) Bioorg Chem 32(1) 13-25 ；Yanagida等(2007)Nucleic Acids Symp Ser(Oxf) 51 :179-80; Zimmerman(2002) J Am Chem Soc 124(46) :13684-5 ；Buncel 等(1985)Inorg Biochem 25 61-73 ;0no 等 Q004)Angew Chem 43 :4300-4302 ;Lee 等(1993)Biochem Cell Biol 71: 162-168 ；Loakes 等 U009)，Chem Commun 4619-4631 和 Seo 等 U009)J Am Chem Soc 131 3246-3252，它們的全文通過引用納入本文用于所有目的)。其它類型的修飾包括，例如，缺口、丟失堿基(如脫嘌呤或脫吡啶位點)、嘧啶二聚體(如胸腺嘧啶二聚體或環(huán)丁烷嘧啶二聚體)、順鉬交聯(lián)、氧化損傷、水解損傷、其它甲基化堿基、大量DNA堿基加成、光化學反應產(chǎn)物、鏈間交聯(lián)產(chǎn)物、錯配堿基和其它類型的核苷酸“損傷”。如此，本文描述的某些實施方式指“損傷”，這種損傷也可視為本發(fā)明所述的核酸修飾。使DNA接觸射線(如UV)、致癌化學物、交聯(lián)劑(如甲醛)、某些酶(如切口酶、糖基化酶、核酸外切酶、甲基化酶和其它核酸酶等)、病毒、毒素和其它化學劑、熱破壞劑等等可導致核苷酸修飾。在體內(nèi)，DNA損傷是突變的主要原因，可導致各種疾病，包括癌癥、心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病(Lindahl，T. (1993) Nature 362(6422) :709_15，其全文通過引用納入本文用于所有目的)。本文提供的方法和系統(tǒng)也可用于檢測DNA的不同構(gòu)型，具體可檢測其二級結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾環(huán)、莖環(huán)、內(nèi)部環(huán)、凸起、假結(jié)體、堿基三聚體等；也可用于檢測試劑與該核酸的相互作用，如結(jié)合的蛋白或其它分子。 在某些方面，提供了在單分子測序中檢測和/或逆轉(zhuǎn)模板中修飾，以及確定核酸分子中它們所在位置(即作圖)的方法、組合物和系統(tǒng)。在某些優(yōu)選的實施方式中，采用高通量、實時、單分子、模板引導的測序試驗，例如通過監(jiān)測聚合酶加工模板時的推進和/或動力學，來檢測損傷位點的存在和確定它們在DNA模板中的位置。例如，當聚合酶遇到DNA 模板中的某些類型損傷或其它修飾時，聚合酶的推進可能被暫時或永久阻斷，如導致聚合酶停止推進或解離。如此，檢測到新生鏈合成暫?；蚪K止即表明存在這種損壞或損傷。通過分析合成中暫?；蛑兄骨暗男蛄凶x取，以及替代或補充的，合成再啟動后的序列讀取，人們就可在模板上繪出損傷位點。因為不同類型的損傷對聚合酶在底物上的推進有不同的影響，在某些情況下，聚合酶在模板上的行為不僅告知何處有損傷，而且可告知存在何種類型損傷。此外，在某些實施方式中，通過摻入模板鏈損傷的非核苷酸結(jié)合伴侶可以繞過修飾位點。例如，脫堿基位點(如用糖基化酶產(chǎn)生的)可與嵌二萘(pyrenes)或其它相似的類似物“配對”(參見，例如Matray等(1999) Nature 399(6737) :704-8)。也可用能與反應混合物中的核苷酸上的標記光學區(qū)分的可檢測標記來標記這種類似物，以便光檢測其摻入。本發(fā)明的某些方面提供實時逆轉(zhuǎn)這類修飾的方法，從而能再啟動測序反應繼續(xù)產(chǎn)生模板核酸的序列信息。這種方法還可用于研究各種試劑(如藥物、化學劑、酶等)和反應條件對產(chǎn)生和/或修復這類損傷的影響。在以下描述和實施例中更加詳細地說明了本發(fā)明的這些方面和其它方面的內(nèi)容。II.單分子測序在本發(fā)明的某些方面，采用單分子實時測序系統(tǒng)，通過分析這類系統(tǒng)產(chǎn)生的序列和/或動力學數(shù)據(jù)來檢測核酸模板的修飾。具體說，模板核酸鏈的修飾可以各種方式改變核酸聚合酶的酶活性，例如延長了使結(jié)合的核苷酸摻入的時間和/或延長摻入事件間的間隔時間。在某些實施方式中，用單分子核酸測序技術(shù)檢測聚合酶的活性。在某些實施方式中，利用核酸測序技術(shù)實時檢測新生鏈中核苷酸的摻入，來檢測聚合酶活性。在優(yōu)選的實施方式中，單分子核酸測序技術(shù)能實時檢測核苷酸的摻入。本領域已知這些測序技術(shù)，包括， 例如SMRT 測序和納米孔測序技術(shù)。關(guān)于納米孔測序的更多信息可參見，例如美國專利號 5，795，782 ;Kasianowicz 等(1996)Proc Natl Acad Sci USA 93(24) :13770-3 ；Ashkenas 等(2005) Angew Chem Int Ed Engl 44(9) :1401-4 ；Howorka 等(2001) Nat Biotechnology 19(7) :636-9和六8衍61~等 Q006)J Am Chem Soc 128(5) 1705-10，它們的全文通過引用納入本文用于所有目的。關(guān)于核酸測序，術(shù)語“模板”指引導新生鏈合成的核酸分子。模板可包括DNA、RNA、或它們的模擬物或衍生物。此外，模板可以是單鏈、雙鏈，或可包含單鏈和雙鏈二種區(qū)域。雙鏈模板中的修飾可以位于與新合成的新生鏈互補的鏈中，或可以位于新合成鏈相同的鏈，即被聚合酶置換的鏈中。本文所述的優(yōu)選直接甲基化測序技術(shù)通?？刹捎脝畏肿訉崟r測序系統(tǒng)來實施，即顯示和觀察各反應復合體隨時間推移的變化，例如那些為SMRTtmDNA測序技術(shù)開發(fā)的(參見，例如P.M. Lundquist等，Optics Letters 2008，33，1026，其全文通過引用納入本文用于所有目的)。上述SMRT 測序儀器通常能同時檢測由數(shù)千種ZMW所組成陣列發(fā)出的熒光信號，產(chǎn)生高度并行操作。各ZMW與其它ZMW相隔幾微米，各代表一個獨立的測序室。單個分子或分子復合體的實時檢測，例如在分析反應過程中，通常涉及直接或間接處理分析反應物使每種待檢測的分子或分子復合體單獨可辨。以此方式，可分別監(jiān)測各分析反應物，即使單個基板上固定有多種這類反應?？赏ㄟ^一些機制實現(xiàn)各分析反應物的單獨可辨設置，通常包括將反應的至少一種反應組分固定在反應位點上。本領域已知提供單獨可辨設置的各種方法，例如，可參見Balasubramanian等的歐洲專利號11055 和已公開的國際專利申請?zhí)朩O 2007/041394，它們的全文通過引用納入本文用于所有目的。基板上的反應位點一般是基板上進行和監(jiān)測單個分析反應的位置，監(jiān)測優(yōu)選是實時監(jiān)測。反應位點可以在基板的平坦表面上，或可在基板表達的凹孔內(nèi)，如孔、納米孔或其它孔內(nèi)。在優(yōu)選實施方式中，這種孔是“納米孔”，這種納米級洞或孔能提供將感興趣分析材料結(jié)構(gòu)性限制在納米級的直徑內(nèi)，例如 l-300nm。在一些實施方式中，這種孔具有光限制特征，如零模式波導特征(也是納米級孔)，其在本文中另有進一步描述。通常這種孔的觀察容積(即發(fā)生反應檢測的體積)為微微微升(10_w升)至毫微微微升(10_21升)規(guī)模，此容積適合單分子和單分子復合體的檢測和分析。分析反應組分的固定可設計為各種方式。例如，可使酶(如聚合酶，逆轉(zhuǎn)錄酶、激酶等)結(jié)合在基板的反應位點，如光限制件或其它納米孔內(nèi)。在其它實施方式中，可使分析反應中的底物(例如，模板核酸，如DNA、RNA或它們的雜交體、類似物、及其模擬物，或激酶的靶分子)結(jié)合在基板的反應位點。例如，2009年9月18日提交的美國專利申請?zhí)?2/562，690中提供了模板固定的某些實施方式，其全文通過引用納入本文用于所有目的。 本領域技術(shù)人員知曉有許多方法可以共價或非共價地、通過接頭部分或連接于固定部分將核酸和蛋白質(zhì)固定在光限制件中。這些方法是固相合成和微陣列領域熟知的(Beier等， Nucleic Acids Res. 27 1970-1-977 (1999))。能使核酸或聚合酶附著于固相支持物的結(jié)合部分的非限制性例子包括鏈霉親和素或親和素/生物素連接、氨基甲酸酯連接、酯鍵，酰胺鍵、硫酯鍵、(N)-功能化硫脲鍵、功能化馬來酰亞胺鍵、氨基、二硫鍵、酰胺鍵、腙鍵等。也可采用能特異性結(jié)合一種或多種反應組分的抗體作為結(jié)合部分。此外，可用本領域已知方法，通過甲硅烷基使核酸直接附著于基板如玻璃。在一些實施方式中，通過將包含互補區(qū)、能與模板雜交的引物的引物附著在反應位點，可將模板核酸固定在反應位點上(如光限制件中)，使其位于適合監(jiān)測的位置。在某些實施方式中，例如通過先固定酶，將酶復合體組裝在光限制件中。在其它實施方式中， 先配制酶復合體溶液再固定。需要時，可修飾待固定的酶或其它蛋白反應組分使之含市售抗體特異性識別的一個或多個表位。此外，可修飾蛋白質(zhì)使之含異源結(jié)構(gòu)域，例如谷胱苷肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖-結(jié)合蛋白(MBP)、特異性結(jié)合肽區(qū)域(參見如美國專利號 5，723，584 ;5，874，239和5，932，433)或免疫球蛋白的Fc部分。這些結(jié)構(gòu)域的各自結(jié)合試劑即谷胱苷肽、麥芽糖、和抗免疫球蛋白Fc部分的抗體可購得并可用于包被本發(fā)明光限制件的表面。所述結(jié)合部分或其固定的反應組分的試劑可采用本領域熟知常規(guī)化學技術(shù)施用于支持物。一般而言，這些方法涉及支持物表面的標準化學修飾，以不同溫度在含有結(jié)合部分或試劑的不同介質(zhì)中培育支持物，可能的后續(xù)步驟為洗滌和清潔。在一些實施方式中，基板包含用于監(jiān)測多種生物學反應的反應位點陣列，每種反應在單個反應位點進行。本領域普通技術(shù)人員已知在陣列基板上加載多種生物學反應的各種方法，方法的進一步描述可參見如USSN 61/072，641，其全文通過引用納入本文用于所有目的。例如，基本方法包括在反應位點處產(chǎn)生某反應組分的單個結(jié)合位點；通過催化或后繼結(jié)合方法去除該反應位點處多余的結(jié)合位點；調(diào)整待固定反應組分的尺寸或電荷；將該反應組分包裹在粒子內(nèi)(如病毒衣殼內(nèi))或與之結(jié)合，相應的反應位點可容納一個粒子 (由于粒子的尺寸或電荷和/或觀察容積)；采用非擴散受限式加載法可控地加載反應組分(例如用微流體計或光或電控制)；反應位點/觀察容積內(nèi)的尺寸篩分和電荷選擇(如陣列中光限制件的尺寸)以控制哪一反應組分可容納入(從空間或靜電上)哪個反應位點 /觀察容積中；迭代加載反應組分，例如通過在循環(huán)加載之間遮蔽活性位點；富集已加載反應組分的活性；利用自裝配核酸進行空間控制加載；調(diào)整反應位點/觀察容積的尺寸等等。 提供的這類方法和組合物可用各單獨反應組分(如分子復合體)完全加載單分子陣列的反應位點(而非“泊松限制”加載法產(chǎn)生的約30%位點加載)。在優(yōu)選方面，本文提供的方法、組合物和系統(tǒng)采用光限制件以促進分析反應的單分子分辨。在優(yōu)選實施方式中，所述光限制件設置為提供密閉的光限制，反應混合物只有很小體積可供觀察。這樣的一些光限制件和其制作方法及應用的詳述可參見，例如美國專利號 7, 302，146,7, 476，503,7, 313，308,7, 315，019,7, 170，050,6, 917，726,7, 013，054、 7，181，122 和 7，292，742、美國專利
發(fā)明者B·弗盧斯貝格, D·韋伯斯特, J·哈尼斯, J·李, J·科拉奇, J·索倫森, J·萊爾, K·特拉弗斯, S·特納, 賈磊 申請人:加利福尼亞太平洋生物科學股份有限公司