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人miR-133a反義核酸及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號:1153703閱讀:237來源:國知局
專利名稱:人miR-133a反義核酸及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域和藥物領(lǐng)域。具體地,本發(fā)明涉及一種 microRNAs(miRNA)的用途,尤其是涉及人microRNA_133a (人miR_133a)反義核酸及其應(yīng) 用。該反義核酸可與人miR-133a互補,從而抑制人miR-133a的表達而起到抗腫瘤的作用。 本發(fā)明還涉及含有該miRNA反義核酸的藥物組合物。
背景技術(shù)
mi RNAs是小的非編碼RNA,長度為20_25bp,通常是由RNA聚合酶II(PolII) 轉(zhuǎn)錄的,一般最初產(chǎn)物為大的具有帽子結(jié)構(gòu)(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的 pri-miRNA。這些pri_miRNA在RNase III Drosha和其輔助因子Pasha的作用下被處理成 70個核苷酸組成的pre-miRNA前體產(chǎn)物。RAN-GTP和exportin 5將這種前體分子輸送到細 胞質(zhì)中。隨后,另一個RNase III Dicer將其剪切產(chǎn)生約為22個核苷酸長度的雙鏈。這種 雙鏈很快被引導(dǎo)進入(miRISC)復(fù)合體中,其中含有Argonaute蛋白,并且成熟的單鏈miRNA 保留在這一復(fù)合物中。成熟的miRNA結(jié)合到與其互補的mRNA的位點通過兩種依賴于序列 互補性的機制負(fù)調(diào)控基因表達,與靶mRNA不完全互補的miRNA在蛋白質(zhì)翻譯水平上抑制其 表達。然而,最近也有證據(jù)表明,這些miRNA也有可能影響mRNA的穩(wěn)定性。使用這種機制 的miRNA結(jié)合位點通常在mRNA的3’端非翻譯區(qū)。如果miRNA與靶位點完全互補(或者幾 乎完全互補),那么這些miRNA的結(jié)合往往引起靶分子mRNA的降解。miRNAs在物種進化中 相當(dāng)保守,在動物,植物和真菌等中發(fā)現(xiàn)的miRNAs表達均有嚴(yán)格的組織特異性和時序性。目前,只有很小一部分miRNAs的生物學(xué)功能得到闡明。這些miRNAs調(diào)節(jié)細胞生 長和組織分化,與生物生長發(fā)育有關(guān)。一系列的研究表明miRNAs在細胞生長和凋亡,血細 胞分化,同源異形盒基因調(diào)節(jié),神經(jīng)元的極性,胰島素分泌,大腦形態(tài)形成,心臟發(fā)生,胚胎 后期發(fā)育等過程中發(fā)揮重要作用。例如,miR-273參與線蟲的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程;miR-430 參與斑馬魚的大腦發(fā)育;miR-181控制哺乳動物造血細胞分化為B細胞;miR-375調(diào)節(jié)哺乳 動物胰島細胞發(fā)育和胰島素分泌;miR-143在脂肪細胞分化起作用;miR-196參與了哺乳動 物四肢形成,miR-1與心臟發(fā)育有關(guān)。另有研究人員發(fā)現(xiàn)許多神經(jīng)系統(tǒng)的miRNAs在大腦皮 層培養(yǎng)中受到時序調(diào)節(jié),表明其可能控制著區(qū)域化的mRNA翻譯。miRNA表達與多種癌癥相關(guān),并且這些基因可能起到腫瘤抑制基因或是癌基因作 用。最先在B細胞慢性淋巴性白血病(CLL)中發(fā)現(xiàn)有miRNA表達水平的改變,隨后陸續(xù)在 各種人類腫瘤中均檢測到miRNA表達水平的變化。研究發(fā)現(xiàn),miRNAs與腫瘤形成相關(guān),既能 發(fā)揮腫瘤抑制基因的作用(如miR-15a和miR-16-l),又能起到癌基因的作用(如miR-155 和miR-17-92簇)。目前認(rèn)為,在腫瘤細胞中,有些miRNA成熟體或前體表達水平異常,而 表達異常的miRNA通過影響靶mRNA翻譯發(fā)揮作用,參與腫瘤形成過程,并起重要作用。如 Ras原癌基因受let-7家族的調(diào)控,BCL2抗凋亡基因受miR-15a-miR-16-l簇調(diào)控,E2F1轉(zhuǎn) 錄因子受miR-17-92簇調(diào)控,BCL6抗凋亡基因受miR-127的調(diào)控等。miRNAs的表達下調(diào)也 和腫瘤發(fā)生有密切關(guān)系,這預(yù)示著miRNA具有癌基因的功能。例如,miR-143和miR-145在結(jié)腸癌中明顯下調(diào)。有趣的是,其發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體分子在腫瘤和正常組織中含量相似,這表 明,miRNAs的表達下調(diào)可能是由于其加工過程受到破壞。但是,miR-143和miR-145的腫瘤 抑制基因功能可能不僅僅局限于結(jié)腸癌,在乳腺癌、前列腺癌、子宮癌、淋巴癌等細胞系中 其表達量也明顯下調(diào)。另一個報道表明,miR-21在膠質(zhì)母細胞瘤中表達增加。這個基因在 腫瘤組織中的表達量比在正常組織中高5-100倍。miRNAs是天然的反義作用因子,能夠調(diào)控與真核生物生存和增殖相關(guān)的多種基 因。在腫瘤治療方面,miRNA的應(yīng)用前景光明。在利用miRNA作為治療靶點方面,已有實驗 數(shù)據(jù)支持如在吉西他濱(gemcitabine)治療的過程中,出現(xiàn)miRNA表達譜的變化;調(diào)控部 分miRNA的表達水平(如使miR-21過表達),能增進膽管癌細胞對化療藥物的敏感性。通 過引入與具有癌基因特性的miRNA互補的合成的反義寡聚核苷酸——抗miRNA寡聚核苷酸 (AMOs)——可能有效的滅活腫瘤中的miRNAs,延緩其生長。臨床上,可以通過經(jīng)常的或者持 續(xù)的2’ -0-甲基化或者鎖核酸(LNA)等修飾的反義寡聚核苷酸給藥使miRNA失活。這些 修飾使得寡核苷酸更穩(wěn)定,比其他治療手段毒性更低。使用antagomirs (與膽固醇偶聯(lián)的 AMOs),注射小鼠后可以在不同器官有效抑制miRNA活性,因而可能成為一種有希望的治療 藥物。相反的,過表達那些具有腫瘤抑制基因作用的miRNAs,如let-7家族,也可以用于治 療某些特定的腫瘤。反義寡聚核苷酸(Flanagan WM. Antisense comes of age. Cancer&Metastasis Reviews 1998 ;17(2) :169-76)是指一段可以與其靶基因的堿基互補的核苷酸。反義寡聚 核苷酸可以抑制相應(yīng)基因的表達。人 microRNA-133a(hsa-mir-133a)前體序列有兩條,分別為 hsa-mir-133a_l,位 于 18 號染色體上,序列為 ACAAUGCUUUGCUAGAGCUGGUAAAAUGGAACCAAAUCGCCUCUUCAAUGGAUU UG⑶CCCCUUCAACCAGCUGUAGCUAUGCAUUGA ;和 hsa-mir-133a_2,位于 20 號染色體上,序列為 GGGAGCCAAAUGCUUUGCUAGAGCUG⑶AAAAUGGAACCAAAUCGACUGUCCAAUGGAUUUGGUCCCCUUCAACCA GCUGUAGCUGUGCAUUGAUGGCGCCG,但這兩個前體卻只表達一個成熟體hsa_miR-133a,序列為 UUUG⑶CCCCUUCAACCAGCUG。Amdt等采用Micro芯片來分析結(jié)直腸癌中miRNA的表達情況,研 究表明在45個結(jié)腸直腸癌組織樣本中,mir-133a的表達水平與正常組織相比是顯著降低 的。Childs等用TaqMan real-time PCR在頭頸部鱗狀上皮細胞癌組織中也發(fā)現(xiàn)mir_133a 表達水平是顯著下降的。Ichimi等在膀胱癌組織中發(fā)現(xiàn)miR-133a是顯著降低的,同時表 達水平下降的還有miR-145,miR-30a-3p,miR-199a*等7個miRNAs,還有意思的是,他們發(fā) 現(xiàn)這下調(diào)的 7 個 miRNA 中有 3 個 miRNAs (miR-30_3p,miR-133a and miR_199a*)都能夠抑 制KRT7的mRNA水平。但還沒有關(guān)于mir_193b在膠質(zhì)瘤中的功能和表達水平的研究報道。 (Arndt, Dossey et al. 2009 ;Childs,Fazzari et al. 2009 ;Ichimi,Enokidaet al. 2009)近三十年,盡管臨床上腫瘤的綜合治療已很普遍,但以手術(shù)為主,放化療為輔的綜 合治療對腫瘤患者的生存率提高并不明顯,5年總體生存率仍然較低,徘徊在30% 55% 左右,并沒有顯著提高,中晚期患者的5年生存率更低,約為20%。而且這些方法都存在各 自的局限性,特別是對中晚期和復(fù)發(fā)患者療效不佳,對伴有遠處轉(zhuǎn)移者療效更差。因此,尋 找更安全有效的治療途徑是提高腫瘤患者生存率和生存質(zhì)量所亟待解決的難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的主要問題就是提供一組新的miR-133a的反義核酸(抑制劑),用 于高效、低毒或無毒地抑制miR-133a的表達,進而治療由miR_133a過度表達引發(fā)的疾病, 包括腫瘤,尤其為腦膠質(zhì)瘤。本發(fā)明要解決的另一問題就是提供上述反義寡聚核苷酸在制備治療mir-133a過 度表達的相關(guān)疾病的藥物中的用途。本發(fā)明要解決的再一問題是提供一種包含上述反義核酸的藥物組合物。本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究,設(shè)計并合成了一系列專一性針對miR-133a不 同區(qū)域的長度不同的反義核酸,并在培養(yǎng)細胞中驗證具有抑制效果的反義核酸。研究顯示, 這些反義核酸能夠抑制腫瘤細胞的生長和惡性增殖能力。本發(fā)明設(shè)計了一系列可以結(jié)合于miR-133a不同位置的反義核酸分子,在培養(yǎng)細 胞U87/MG中,驗證對miR-133a表達特異性抑制的反義核酸對細胞生長能力、增殖能力的影 響,反義核酸分子長度可以包含13 22個核苷酸殘基,均有不同程度的抑制人腫瘤細胞生 長能力、增殖能力的特性,其中最短的反義核酸長度為13個堿基,不同長度的反義核酸均 具有良好的腫瘤細胞生長及增殖抑制活性。因此,上述反義核酸均可用來制備抑制腫瘤細 胞生長能力、增殖能力的制劑,其中優(yōu)選miR-133a高表達的腫瘤細胞。在此基礎(chǔ)上完成了 本發(fā)明。本發(fā)明的第一方面,提供了一種miR-133a的反義寡聚核苷酸,所述反 義寡聚核苷酸抑制人細胞內(nèi)miR-133a的表達。通常,所述反義寡聚核苷酸與 5’ -UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG-3,中連續(xù)13 22個核苷酸序列互補。在本發(fā)明的一個優(yōu) 選實施例中,所述反義寡聚核苷酸的長度為18 22個核苷酸。更佳地,所述反義寡聚核苷 酸的序列是 5 ‘ -CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA-3 ’。從目前來看,核酸雜交中RNA與miRNA的雜交親和力比DNA與miRNA雜交的親和 力要高,具有很高的藥用價值。但是人工合成DNA的成本遠遠比合成RNA的成本低,也具有 很好的市場潛力。而且也可以采用核糖RNA單體與脫氧核糖DNA單體嵌合相連而成的反義 核酸作為藥物進行開發(fā)。本發(fā)明設(shè)計的一系列反義核酸分子,既包括DNA分子,也包括RNA 分子,兩種分子均具有抑制miR-133a表達的活性。本發(fā)明設(shè)計的反義核酸,其序列具有特異性生物學(xué)活性,其對于某一基因互補的 位點的反義核酸所互補的長度有很大關(guān)系,如互補的長些,則生物學(xué)活性會更高些,抑制效 果也會更好一些,在增加或減少一個至數(shù)個堿基而互補于同一基因位點的反義核酸,同樣 也具有不同程度的生物學(xué)活性,也可達到不同程度的抑制腫瘤細胞生長與增殖的作用,本 發(fā)明的研究表明,最短可達13個堿基仍然具有抑制miR-133a表達的作用。反義核酸研究 中,各種化學(xué)修飾方法很多,包括選自核糖修飾、堿基修飾和磷酸骨架修飾中的一種或幾種 的組合等。應(yīng)當(dāng)明確的是,任何能夠增加反義核酸穩(wěn)定性和生物利用度的修飾方法都可以 應(yīng)用,如膽固醇修飾、PEG修飾、硫代修飾、2’ -甲氧基修飾等。本文中所述反義寡聚核苷酸 經(jīng)過2’甲氧基修飾。本發(fā)明的上述反義核酸具有抑制miR-133a表達的效果。當(dāng)將上述反義核酸轉(zhuǎn)染 到miR-133a高表達的細胞株U87中后,能夠有效抑制腫瘤細胞的生長和惡性增殖能力。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物,它含有安全有效量的本發(fā)明寡聚核苷酸以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括但不限于鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇 及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式,例 如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。所述“有效量”是指可對人和/或動物產(chǎn)生功能或活性且可被人和/或動物所接 受的量。所述“藥學(xué)上可接受的”成分是適用于人和/或動物而無過度不良副反應(yīng)(如毒 性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的,即有合理的效益/風(fēng)險比的物質(zhì)。在本發(fā)明的第三方面,提供了本發(fā)明的反義寡聚核苷酸的用途,用于制備治療以 下疾病的藥物治療人體與miR-133a過表達有關(guān)的疾病,包括腫瘤,優(yōu)選為腦膠質(zhì)瘤。如本文所用,“反義寡聚核苷酸”指反義的核苷酸寡聚物。反義寡聚核苷酸通過堿 基互補(A-T,A-U, G-C)配對與雙鏈DNA形成三鏈(反基因),或與單鏈RNA形成雜交雙鏈 (反義),從而阻斷基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后mRNA的加工和翻譯。同時,雙鏈RNA能被細 胞內(nèi)的核糖核酸酶H(RNaseH)所降解,從而更有效地阻斷靶基因的表達。由于反義核苷酸 只能與反向互補的靶序列結(jié)合,具有專一性高,副作用小的特點。本發(fā)明的反義寡核苷酸的長度沒有特別限制,一般來說,為了達到雜交的專一性, 反義寡聚核苷酸需要至少13個單體組成的核苷酸。通常反義寡聚核苷酸的長度為13 35bp,對于miRNA成熟體來說,較佳的反義寡聚核苷酸長度為18 22bp。


圖1顯示了 miR-133a反義寡聚核苷酸抑制腫瘤細胞U87/MG細胞的生長 和增殖,A,B為轉(zhuǎn)染了 FAM標(biāo)記的陰性對照后的U87/MG細胞;C為轉(zhuǎn)染陰性對照 (5,-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3,)后 U87/MG 細胞狀態(tài);D 為轉(zhuǎn)染 miR_133a 反義寡聚核 苷酸(5,-CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA-3,)后 U87/MG 細胞狀態(tài)。
具體實施例方式本發(fā)明的反義寡聚核苷酸,其序列與5 ’ -UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG-3,中連續(xù) 13 22個核苷酸序列互補,并且亦不與其他基因的RNA序列互補。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實 施例中,所述反義寡聚核苷酸的序列為5' -CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA-3‘。本發(fā)明提供的 反義寡聚核苷酸可以為修飾產(chǎn)物,它含有至少兩個,通常至少4個,較佳的至少6個,更佳的 至少8個核苷酸沒有毒性副作用的修飾的核苷酸,所述修飾方式包括2’位甲氧基取代、硫 代修飾等。為了增加反義寡聚核苷酸的細胞攝取率,還可以在上述修飾的基礎(chǔ)上對反義寡 聚核苷酸進行膽固醇修飾或者PEG化修飾。上述修飾后的寡聚核苷酸能繼續(xù)與靶序列有效 配對,而且比普通的未經(jīng)修飾的核糖核酸或者脫氧核糖核酸在體內(nèi)具有更長的半衰期。本發(fā)明具有如下優(yōu)點1、反義寡聚核苷酸作用于特異性的靶位點,非特異性結(jié)合的位點很少,專一性 尚;2、本發(fā)明提供的反義寡聚核苷酸經(jīng)過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾,具有毒性低、副作用小和 半衰期長等特點;3、本發(fā)明提供的反義寡聚核苷酸具有很好的抑制效果,對腫瘤細胞生長的抑制率超過40%。下面將結(jié)合實施例及附圖進一步詳細地描述本發(fā)明。然而應(yīng)當(dāng)理解,列舉這些實 施例只是為了起說明作用,而并不是用來限制本發(fā)明的范圍。實施例實施例l、miR-133a反義寡聚核苷酸對人神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤細胞系U87/MG抑制活性 檢測首先,由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成miR-133a反義寡聚核苷酸,序列為 5' -CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA-3‘。在實施例中涉及的所用序列均由上海吉瑪制藥技術(shù)有 限公司合成。細胞培養(yǎng)U87/MG細胞(購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫),10% FBS-DMEM培 養(yǎng)基(FBS購自Gibco,DMEM購自Hyclone)培養(yǎng),37°C,5% CO2培養(yǎng)。收集生長狀態(tài)良好的 U87/MG細胞,離心計數(shù),以2X IO3每孔鋪于96孔板內(nèi),37°C,5% CO2培養(yǎng)24h。轉(zhuǎn)染1)轉(zhuǎn)染前一天,在96孔板中用適量不含抗生素的培養(yǎng)基接種培養(yǎng)細胞,使轉(zhuǎn)染時 細胞的匯合度達到30 50% ;2)轉(zhuǎn)染樣品按照如下方法準(zhǔn)備寡聚物-Lipofecta mine 2000復(fù)合物a.用25 μ 1不含血清的Opti-MEM I培養(yǎng)基(Gibco)分別稀 釋 miR-133a 反義寡聚核苷酸(5 ‘ -CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA-3 ‘)、陰性對照 (5,-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3,)、FAM標(biāo)記的陰性對照,加入孔內(nèi)后終濃度為50nM,輕輕 混勻,每個轉(zhuǎn)染設(shè)3個復(fù)孔;b.使用前輕輕混勻 Lipofecta mine 2000 (Invitrogen),然后取 0. 25 μ 1 稀釋到 25 μ 1的Opti-MEM I培養(yǎng)基,輕輕混勻后在室溫下孵育5min ;c.孵育5min后,稀釋的Lipofecta mine 2000分別與稀釋的反義核苷酸及對照 混合,輕輕混勻后在室溫下孵育20min,以允許復(fù)合物的形成;3)將復(fù)合物加入到每一個包含細胞和培養(yǎng)基的孔中,輕輕地前后搖動培養(yǎng)板混 合;反義核苷酸及對照的終濃度為50nM。4) 37°C ,5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育72小時后,顯微鏡觀察U87/MG細胞,照相。如圖1所示,轉(zhuǎn)染72小時后,超過80%的U87/MG細胞成功轉(zhuǎn)染了 FAM標(biāo)記的陰性 對照(圖A,B);轉(zhuǎn)染陰性對照后,U87/MG細胞完整,透光性強(圖C);轉(zhuǎn)染miR-133a反義 寡聚核苷酸后大部分U87/MG細胞死亡(圖D)。基于MTT的細胞毒性實驗向上一步驟中得到的細胞,加入配制好的MTT(Sigma)5mg/ml(用0.9%的生理鹽 水配制),每孔加入20 μ 1,37°C,5% CO2孵育4小時后吸去培養(yǎng)基及MTT,每孔加入DMSO 100 μ 1并通過酶標(biāo)儀讀取0D570-0D630的吸光度值。樣品陰性對照
權(quán)利要求
1.一種反義寡聚核苷酸,其特征在于,所述反義寡聚核苷酸包含與下述核苷酸序列中 13 22個連續(xù)的核苷酸互補的序列5,-UUUG⑶CCCCUUCAACCAGCUG-3,。
2.如權(quán)利要求1所述的反義寡聚核苷酸,其特征在于,所述反義寡聚核苷酸序列為 5, -CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA-3,。
3.如權(quán)利要求1所述的反義寡聚核苷酸,其特征在于,所述反義寡聚核苷酸為核糖核 苷酸、脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸與脫氧核糖核苷酸的嵌合體。
4.如權(quán)利要求1 3中任一項所述的反義寡聚核苷酸,其特征在于,所述反義寡聚核苷 酸進一步被修飾。
5.如權(quán)利要求4所述的反義寡聚核苷酸,其特征在于,所述修飾選自核糖修飾、堿基修 飾和磷酸骨架修飾中的一種或幾種的組合。
6.如權(quán)利要求5所述的反義寡聚核苷酸,其特征在于,所述修飾選自硫代修飾、2’-甲 氧基修飾和膽固醇修飾中的一種或幾種。
7.如權(quán)利要求1 6中任一項所述的反義寡聚核苷酸用于制備治療mir-133a過度表 達的相關(guān)疾病的藥物的用途。
8.如權(quán)利要求7所述的用途,其特征在于,所述反義寡聚核苷酸與其他治療藥物聯(lián)合 施用。
9.如權(quán)利要求7所述的用途,其特征在于,所述miR-133a過度表達的相關(guān)疾病為腫瘤, 優(yōu)選為腦膠質(zhì)瘤。
10.一種藥物組合物,其特征在于,含有治療有效量的權(quán)利要求1 6中任一項所述的 反義寡聚核苷酸以及藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明公開一種抑制人microRNA-133a表達的反義寡聚核苷酸及其應(yīng)用。該反義寡聚核苷酸特異性結(jié)合于人miR-133a,包含與下述核苷酸序列中13~22個連續(xù)核苷酸互補的序列5’-UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG-3’,特別是其包含序列5’-CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA-3’。本發(fā)明的反義寡聚核苷酸可以為核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸與脫氧核糖核苷酸的嵌合體,并可對鏈中任一核苷酸進行修飾。本發(fā)明的miR-133a反義寡核苷酸能夠有效抑制人腦膠質(zhì)瘤細胞中miR-133a表達,抑制其生長和增殖,從而有效治療腦膠質(zhì)瘤及其他miR-133a高表達的腫瘤。
文檔編號A61P35/00GK102080086SQ20091019973
公開日2011年6月1日 申請日期2009年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月1日
發(fā)明者丁侃, 東楠, 張佩琢, 李捷, 沈孝坤 申請人:中國科學(xué)院上海藥物研究所, 蘇州吉瑪基因藥物科技有限公司
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