專利名稱：：一種抗腫瘤的腺病毒制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域；更特別的，本發(fā)明涉及一種新的可用于腫瘤治療的制劑。
背景技術(shù)：
：惡性腫瘤是一類嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病，目前藥物治療的主要障礙是缺少腫瘤治療的特異耙標(biāo)和有效的體內(nèi)藥物載體，即很多抗腫瘤藥物在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也殃及正常細(xì)胞；有些特異的生物大分子抗腫瘤制劑，譬如反義核酸和siRNA等缺乏有效的體內(nèi)釋放載體。因此，發(fā)展生物大分子抗腫瘤藥物，最關(guān)鍵的是發(fā)現(xiàn)腫瘤特異的靶標(biāo)和發(fā)展有效的藥物載體。胰十二指腸同源盒基因-1(Pancreasduodenumhomeobox-1，PDX-1)是一種轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)胚胎時(shí)期的胰腺發(fā)育和維持正常P細(xì)胞功能起著至關(guān)重要的作用。既往的研究認(rèn)為，除胰島P細(xì)胞、S細(xì)胞和散在的十二指腸外分泌細(xì)胞外，機(jī)體其它組織均無PDX-l表達(dá)。然而，最近的研究發(fā)現(xiàn)，人體的多種腫瘤組織，如胰腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌和腎癌中也出現(xiàn)有PDX-1的表達(dá)。然而，PDX-1在人腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的確切機(jī)制和實(shí)際性意義尚不清楚。脂A干擾(RNAi)是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)新的有效的基因阻斷技術(shù)，不僅是研究基因功能和疾病機(jī)制的有效手段，同時(shí)具有臨床治療和發(fā)展基因特異的siRNA藥物的廣闊前景。目前化學(xué)合成的siRNA或質(zhì)粒胞內(nèi)釋放多采用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，用陽離子脂質(zhì)體在體外轉(zhuǎn)染是成功的，而在生物體內(nèi)卻由于其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低及與劑量相關(guān)的毒副作用限制了它的體內(nèi)應(yīng)用。病毒被認(rèn)為是體內(nèi)外較非病毒載體高效的轉(zhuǎn)基因載體，然而，大多數(shù)病毒在用于體內(nèi)轉(zhuǎn)染時(shí)存在安全性的問題?，F(xiàn)有技術(shù)中，對(duì)于PDX-1在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用仍然是未知的，因此，本領(lǐng)域需要進(jìn)一步研究PDX-1參與腫瘤發(fā)生與發(fā)展的機(jī)制，并且需要開發(fā)出新的針對(duì)腫瘤靶標(biāo)的有效藥物，從而為腫瘤的治療提供新的途徑。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種抗腫瘤的腺病毒制劑。在本發(fā)明的第一方面，提供一種可抑制PDX-1表達(dá)的構(gòu)建物，所述的構(gòu)建物具有以下式I結(jié)構(gòu)Seq正向一X一Seq反向5^1，式I中，SeqM為可與PDX-1基因上任一區(qū)域基本互補(bǔ)且與PDX-1基因以外的人基因均不互補(bǔ)的核苷酸序列，Seq^為與Seq^基本互補(bǔ)的核苷酸序列，或者，Seq^為可與PDX-1基因上任一區(qū)域基本互補(bǔ)且與PDX-1基因以外的人基因均不互補(bǔ)的核苷酸序列，Seq^為與Seq^基本互補(bǔ)的核苷酸序列，X為位于Seq^和Seq反^之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seq正向禾口Seq反向不互補(bǔ)，式I所示的結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，形成式n所示的二級(jí)結(jié)構(gòu)Seq正向S叫反向"^式工工，式II中，Seq正向、Seq反向和X的定義如上述，M表示在Seq^和Seqg^之間形成的氫鍵。在另一優(yōu)選例中，Seq正向具有14-30個(gè)核苷酸；Seq反向具有14-30個(gè)核苷酸；更優(yōu)選的，SeqM具有16-25個(gè)核苷酸；Seq^具有16-25個(gè)核苷酸；進(jìn)一步優(yōu)選的，Seq正向具有18-22個(gè)核苷酸；Seq反向具有18-22個(gè)核苷酸。在另一優(yōu)選例中，X具有4-20個(gè)核苷酸，優(yōu)選的具有5-15個(gè)核苷酸，更優(yōu)選的具有6-9個(gè)核苷酸。在另一優(yōu)選例中，所述的Seq正向或Seq反向選自下組(a)具有SEQIDNo:3所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列；(b)具有SEQIDNo:4所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列；(c)具有SEQIDNo:5所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列；或(d)具有SEQIDNo:6所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。在本發(fā)明的第二方面，提供一種重組載體，所述的載體中含有所述的構(gòu)建物。在本發(fā)明的第三方面，提供一種重組的腺病毒，所述的腺病毒的基因組中含有一重組表達(dá)盒，所述的重組表達(dá)盒含有所述的構(gòu)建物。在另一優(yōu)選例中，所述的腺病毒可感染腫瘤細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)生成可抑制PDX層1的siRNA。在另一優(yōu)選例中，所述的重組表達(dá)盒從5'至3'依次含有以下元件RNA聚合酶III啟動(dòng)子；所述的構(gòu)建物；和終止子。在另一優(yōu)選例中，所述的RNA聚合酶III啟動(dòng)子選自(但不限于)U6啟動(dòng)子，Hl啟動(dòng)子；更優(yōu)選的，所述的RNA聚合酶III啟動(dòng)子是U6啟動(dòng)子(如人源U6啟動(dòng)子(hU6))。在另一優(yōu)選例中，在脂A聚合酶III啟動(dòng)子與所述的構(gòu)建物之間還包括一多克隆位點(diǎn)。優(yōu)選的，所述的多克隆位點(diǎn)是BamHI酶切位點(diǎn)。在另一優(yōu)選例中，所述的構(gòu)建物與所述的PolIII終止子之間還包括一多克隆位點(diǎn)。優(yōu)選的，所述的多克隆位點(diǎn)是HindIII酶切位點(diǎn)。在另一優(yōu)選例中，所述的終止子是PolyT終止子；例如，所述的終止子序列為TTTTTT。在另一優(yōu)選例中，所述的腺病毒為Ad5型腺病毒。更優(yōu)選的，所述Ad5型腺病毒為復(fù)制缺陷型病毒，缺失與病毒復(fù)制相關(guān)的基因E1或E3。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的Ad5型腺病毒缺失與病毒復(fù)制相關(guān)的基因El，必須由宿主細(xì)胞(如293細(xì)胞)提供E1蛋白，才能復(fù)制出具有感染能力的病毒。在本發(fā)明的第四方面，提供所述的腺病毒的用途，用于制備治療PDX-l基因高表達(dá)相關(guān)疾病的藥物。在另一優(yōu)選例中，所述的PDX-1基因高表達(dá)相關(guān)疾病是腫瘤。在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤選自鱗狀細(xì)胞癌；基底細(xì)胞癌；移行細(xì)胞癌；腺癌；胃泌素瘤；膽管細(xì)胞癌；肝細(xì)胞腺瘤；肝細(xì)胞癌；腎細(xì)胞癌；黑色素瘤；纖維肉瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；橫紋肌肉瘤；畸胎瘤；血管肉瘤；Kaposi肉瘤；淋巴管肉瘤；骨瘤；骨肉瘤；成骨肉瘤；軟骨肉瘤；腦脊膜瘤；非霍奇金淋巴瘤；霍奇金淋巴瘤；白血病。在本發(fā)明的第五方面，提供一種藥物組合物，所述的藥物組合物包含有效量的所述的腺病毒；和與所述腺病毒相容的載體。在另一優(yōu)選例中，所述的腺病毒在藥物組合物中的含量為103-102°pfu/ml;優(yōu)選的為10fi-10l5pfu/ml;更優(yōu)選的為10'°-10"pfu/ml。在本發(fā)明的第六方面，提供一種治療腫瘤的方法，所述方法包括給予腫瘤患者有效量的所述的腺病毒。另一方面，本發(fā)明還提供一種抑制腫瘤細(xì)胞的方法，包括用抗PDX-1試劑接觸腫瘤細(xì)胞，所述的抗PDX-1抑制PDX-1活性，從而抑制腫瘤細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的抗PDX-1試劑抑制PDX-1的表達(dá)。在另一優(yōu)選例中，所述的抗PDX-1試劑為一雙鏈RNA復(fù)合物，它通過RNA千擾抑制PDX-1基因的表達(dá)。在另一優(yōu)選例中，所述的雙鏈RNA復(fù)合物包括大約28-60核苷酸，一有義鏈和一反義鏈，有義鏈和反義鏈都由14-30核苷酸組成，并且反義鏈至少有大約12-26核苷酸與有義鏈互補(bǔ)，同時(shí)有義鏈至少有大約12-26核苷酸與反義鏈互補(bǔ)。在另一優(yōu)選例中，雙鏈RNA復(fù)合物中，反義鏈與有義鏈通過一連接物相連。在另一優(yōu)選例中，所述連接物選自寡核苷酸，多聚核苷酸或非核苷酸。在另一優(yōu)選例中，所述的PDX-1選自抗體，適體，配體或抑制化合物。在另一優(yōu)選例中，所述的正義鏈或反義鏈與選自SEQIDNo:3，SEQIDNo:4，SEQIDNo:5，或SEQIDNo:6的核酸實(shí)質(zhì)上互補(bǔ)。在另一優(yōu)選例中，所述的抗PDX-1試劑選自反義寡核苷酸或核酶。另一方面，本發(fā)明還提供一種抑制腫瘤細(xì)胞PDX-1表達(dá)的方法，包括將腫瘤細(xì)胞與用有效量的可與編碼PDX-1的RNA的特定區(qū)域互補(bǔ)的抗PDX-1試劑接觸，所述的抗PDX-1試劑與編碼PDX-1的特定RNA分子雜交，并在腫瘤細(xì)胞中阻滯PDX-1基因的表達(dá)。在另一優(yōu)選例中，作為雙鏈RNA的復(fù)合物的抗PDX-1試劑以RNA干擾的方式阻滯PDX-1基因的表達(dá)。另一方面，本發(fā)明還提供一種組合物，所述組合物包括所述的抗PDX-1試劑以及藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。圖1顯示了各種細(xì)胞中PDX-1mRNA的表達(dá)情況，所述細(xì)胞包括PANOl，UKPAN，BxBc3，MiaPaCa2，MCF-7，SK-BR-3，AU565，MDA-MB-231，H23，H460，H520,T24，Um-UC-3和AG5229-hT。圖2顯示了使用PDX-1siRNA651(圖中簡(jiǎn)稱651)處理MiaPaCa-2胰腺癌細(xì)胞，收獲細(xì)胞并使用免疫印跡分析細(xì)胞內(nèi)PDX-1的表達(dá)的情況，以未處理的細(xì)胞(-)作為對(duì)照。圖2B是免疫印跡結(jié)果，圖2A是量化結(jié)果。圖3顯示了流式細(xì)胞術(shù)分析由PDX-1siRNA引起的表達(dá)抑制導(dǎo)致癌細(xì)胞系的凋亡情況。圖4顯示了RT-PCR分析PDX-1siRNA590轉(zhuǎn)染的MiaPaCa2細(xì)胞的PDX-1表達(dá)的量化結(jié)果。圖5顯示了倒置顯微鏡下PDX-1siRNA處理的腫瘤細(xì)胞的凋亡。其中，左列為對(duì)照siRNA處理后的情況，右列為PDX-1siRNA590處理后的情況。圖6顯示了本發(fā)明所用的pRNAi-shuttle質(zhì)粒的圖譜，該質(zhì)粒中含有hU6啟動(dòng)子，BaraHI酶切位點(diǎn)、HindIII酶切位點(diǎn)和終止子(TTTTTT)等。圖中所標(biāo)記的各位點(diǎn)名稱之后的數(shù)字代表該位點(diǎn)處于載體中的位置，如BamHI1025表示BaniHI酶切位點(diǎn)起始于載體序列的第1025位。圖7顯示了pAd/BLOCK-iT-DEST載體(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)的圖譜。圖8顯示了重組腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與克隆的基本流程。圖9顯示了利用PDX-1shRNA腺病毒制劑感染MiaPaCa2細(xì)胞、SK0V3細(xì)胞、Pane-l細(xì)胞后，細(xì)胞的凋亡情況，同時(shí)以表達(dá)無意義的shRNA((-)siControl)的腺病毒作為陰性對(duì)照。其中，A為MiaPaCa2感染第7日的情況(從左至右分別為空白對(duì)照孔，陰性對(duì)照孔，陽性感染孔)；B為SK0V3感染第10日的情況(從左至右分別為空白對(duì)照孔，陰性對(duì)照孔，陽性感染孔)；C為Pane-1感染第10的情況(從左至右分別為空白對(duì)照孔，陰性對(duì)照孔，陽性感染孔)。圖IO顯示了顯微鏡觀察利用PDX-1shRNA腺病毒制劑感染MiaPaCa2細(xì)胞、Pane-l細(xì)胞、SK0V3細(xì)胞后的細(xì)胞凋亡情況，同時(shí)以表達(dá)無意義的shRNA((-)siControl)的腺病毒作為陰性對(duì)照。其中，A為MiaPaCa2細(xì)胞感染后第7日陰性組(左)與陽性感染組(右)的情況；B為Pane-1細(xì)胞感染后第10日陰性組(左)與陽性感染組(右)的情況；C為SK0V3細(xì)胞感染后第10日陰性組(左)與陽性感染組(右)的情況。圖11顯示了顯微鏡觀察利用PDX-1shRNA腺病毒制劑感染SMMC7721人肝癌細(xì)胞、435s人乳腺癌細(xì)胞、SGC7901人胃癌細(xì)胞后的細(xì)胞凋亡情況，同時(shí)以表達(dá)無意義的shRNA((-)siControl)的腺病毒作為陰性對(duì)照。其中，A為SMMC7721細(xì)胞感染后第10日陰性組(左)與陽性感染組(右)的情況；B為435s細(xì)胞感染后第10曰陰性組(左)與陽性感染組(右)的情況；C為SGC7901細(xì)胞感染后第10日陰性組(左)與陽性感染組(右)的情況。圖12顯示了采用590腺病毒制劑和表達(dá)sh認(rèn)A((-)siControl)的腺病毒分別感染乳腺癌MDA-MB-435S細(xì)胞(A)，前列腺癌pc-3細(xì)胞(B)，乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞(C)，肺癌A549細(xì)胞(D)，宮頸癌hela細(xì)胞(E)，肝癌7721細(xì)胞(F)后，倒置顯微鏡下觀察590腺病毒制劑組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制情況。具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次揭示PDX-1是對(duì)于腫瘤發(fā)生和發(fā)展起重要作用的因子，阻斷其基因表達(dá)或抑制其蛋白活性可達(dá)到抗腫瘤的作用。本發(fā)明人還基于PDX-l基因序列，找到了對(duì)于抑制PDX-1mRNA轉(zhuǎn)錄有用的作用靶點(diǎn)。本發(fā)明還提供一種具有通過抑制PDX-1表達(dá)、從而抑制腫瘤生長(zhǎng)的小干擾RNA(siRNA)。本發(fā)明還提供了一種基于該小干擾RNA而設(shè)計(jì)的抗腫瘤的腺病毒制劑，所述腺病毒制劑產(chǎn)生滴度高、不整合到宿主基因組、安全性高。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。如本發(fā)明所用，"腫瘤"一詞包含了廣泛的含義，包括但不限于鱗狀細(xì)胞癌；基底細(xì)胞癌；移行細(xì)胞癌；腺癌；胃泌素瘤；膽管細(xì)胞癌；肝細(xì)胞腺瘤；肝細(xì)胞癌；腎細(xì)胞癌；黑色素瘤；纖維肉瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；橫紋肌肉瘤；畸胎瘤；血管肉瘤；Kaposi肉瘤；淋巴管肉瘤；骨瘤；骨肉瘤；成骨肉瘤；軟骨肉瘤；腦[脊]膜瘤；非霍奇金淋巴瘤；霍奇金淋巴瘤；白血病。如本文所用，術(shù)語"RNA干擾(RNAinterference,RNAi)"是指一些小的雙鏈RNA可以高效、特異地阻斷體內(nèi)特定基因表達(dá)，促使mRNA降解，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型，其也被稱為RNA干預(yù)或者RNA干涉。RNA干擾是高度特異的在mRNA水平上的基因沉默，它是體內(nèi)抵御外在感染的重要保護(hù)機(jī)制之一。簡(jiǎn)要地說，RNA干擾包含一個(gè)由小型干擾RNA(siRNA)所激發(fā)的機(jī)制，造成耙mRNA的降解。如本文所用，術(shù)語"小干擾RNA(smallinterfering歸，siRNA)"是指一種短片段雙鏈RNA分子，能夠以同源互補(bǔ)序列的mRNA為耙目標(biāo)降解特定的mRNA，這個(gè)過程就是RNA干擾途徑(RNAinterferencepathway)。如本文所用，術(shù)i吾"小發(fā)夾RNA(SmallhairpinRNA，shRNA)"是指能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的非編碼小RNA分子，小發(fā)夾RNA能夠通過RNA干擾途徑來抑制基因的表達(dá)。如本文所用，術(shù)語"互補(bǔ)"指的是核苷酸之間的堿基配對(duì)，特別指核苷酸之間的氫鍵結(jié)合，胸腺嘧啶或尿嘧啶殘基通過2個(gè)氫鍵與腺嘌呤結(jié)合，胞嘧啶和鳥嘌呤殘基通過3個(gè)氫鍵結(jié)合?？傮w來講，一條核酸含有一對(duì)與另一特定的核苷酸序列擁有"互補(bǔ)百分率"的核苷酸序列。例如，一條核苷酸序列對(duì)于另一條特定的核苷酸序列可能有80%，90%或100%的互補(bǔ)性，提示這個(gè)核苷酸序列的10個(gè)核苷酸中有8個(gè)，9個(gè)，或10個(gè)與另一個(gè)特定的核苷酸序列互補(bǔ)。兩條互補(bǔ)的核苷酸序列含有一個(gè)正義鏈(sense)和一個(gè)反義鏈(antisense)。術(shù)語"基本互補(bǔ)"或"基本上互補(bǔ)"指的是一條核苷酸序列對(duì)于另一條特定的核苷酸序列有至少80%，較佳的90%，更佳的95%，最佳的100%的互補(bǔ)性。PDX-1胰十二指腸同源盒基因-l(Pancreasduode畫homeobox-l，PDX-1)是一種轉(zhuǎn)錄因子。盡管已有研究發(fā)現(xiàn)人體的多種腫瘤細(xì)胞中有PDX-1的表達(dá)，但現(xiàn)有技術(shù)對(duì)PDX-l人腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的確切機(jī)制尚不清楚。本發(fā)明人的研究首次發(fā)現(xiàn)，PDX-l在許多腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，而在正常細(xì)胞(除胰島e細(xì)胞，5細(xì)胞和散在的十二指腸外分泌細(xì)胞外)中無明顯表達(dá)。進(jìn)一步的，本發(fā)明人通過干擾PDX-1的表達(dá)來研究PDX-l在腫瘤細(xì)胞中的作用，從而證實(shí)了PDX-l是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要性因子，抑制PDX-l的表達(dá)，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。因此可見，PDX-l是一種促進(jìn)細(xì)胞增殖的去分化因子或是一種抗凋亡因子，其在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵所在。關(guān)于上述研究還可參見美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)枮?0/889，808的專利申請(qǐng)。由于PDX-l在正常細(xì)胞中沒有明顯的表達(dá)，因此其可以作為一種良好的特異性抗腫瘤靶標(biāo)，也就是減少或阻斷PDX-1的表達(dá)在抗腫瘤的同時(shí)，對(duì)正常細(xì)胞的沒有明顯影響。PDX-1的蛋白序列及其核苷酸序列是本領(lǐng)域人員所已知的。PDX-1的蛋白序列與SEQIDNO:2所示的序列基本上相同或完全相同；一種編碼PDX-1蛋白的核苷酸序列例如可與SEQIDNO:l所示的序列基本上相同或完全相同。抑制PDX-1的siRNA基于抑制PDX-1的表達(dá)可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡的特點(diǎn)，可針對(duì)PDX-1來設(shè)計(jì)siRNA序列，從而用于抑制細(xì)胞內(nèi)PDX-1的表達(dá)。本發(fā)明人經(jīng)過長(zhǎng)期研究，根據(jù)PDX-1的序列，在該序列上找到了若干個(gè)對(duì)于抑制PDX-1mRNA轉(zhuǎn)錄有用的靶點(diǎn)，所述靶點(diǎn)的序列分別是5，AGTTCCTATTCAACAAGTA3，(SEQIDNo:3)，即人PDX-1核苷酸序列第590-608位。5，TTCCTATTCAACAAGTACA3，(SEQIDNo:4)，即人PDX-1核苷酸序列第592-610位。5，CTTGACCGAGAGACACATC3，(SEQIDNo:5)，即人PDX-1核苷酸序列第651-669位。5，TGACCGAGAGACACATCAA3，(SEQIDNo:6)，即人PDX-1核苷酸序列第653-671位。在篩選siRNA耙序列時(shí)，還需進(jìn)行比對(duì)分析，從而排除任何與PDX-1以外的任何人類基因同源的靶序列，找出最佳的有效片段。任何經(jīng)辨認(rèn)屬于非特異性的耙序列被排除在本發(fā)明之外。靶序列與核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中其它序列對(duì)比可通過目前已知的多種比較方法進(jìn)行。一種常用的比較方法如BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool,http://www,ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)分析。經(jīng)過本發(fā)明人大量的分析和比較，靶序列SEQIDNo:14、SEQIDNo:15、SEQIDNo:16和SEQIDNo:17與編碼人類PDX-1的核酸SEQIDNo:1的部分區(qū)域完全相同，與其它的人類核酸序列沒有顯著的同源性。并且經(jīng)驗(yàn)證，針對(duì)SEQIDNO:14-17任一所示的核苷酸序列設(shè)計(jì)的siRNA具有良好的干擾PDX-l表達(dá)的效果?；谏鲜霭尹c(diǎn)本發(fā)明提供了抑制腫瘤的siRNA，所述的siRNA可特異性地干擾PDX-1基因的轉(zhuǎn)錄。所述的siRNA為以人PDX-1基因序列為模板，根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則獲得的siRNA。所述的siRNA可以被制備成一種包含正義鏈和反義鏈的雙鏈核酸，在其中正義鏈和反義鏈基本上互補(bǔ)，且每一條正義鏈或反義鏈包含14-30個(gè)核苷酸?；パa(bǔ)的正義鏈和反義鏈隨意地包含1-2個(gè)核苷酸懸突在一條或兩條鏈上的3'末端。作為一種優(yōu)選方式，所述的siRNA包含正義鏈和反義鏈，每條鏈有21-23個(gè)核苷酸，其中2個(gè)核苷酸懸突在每條鏈的3'末端，而剩余的19-21個(gè)核苷酸100%互補(bǔ)。如上所述，siRNA復(fù)合物的進(jìn)一步細(xì)節(jié)在Engelke,D.R.，RNAInterference(RNAi):NutsandBoltsofRNAiTechnology,腿PressLLC,Eagleville，PA,2003—書中有描述。有關(guān)siRNA長(zhǎng)度和成分的額外描述在Elbashir，S.M.等的GenesandDevel.,15:188-200,2001;and0'Toole,A.S.etal.，RNA,11:512-516，2005—書中可找到。本發(fā)明對(duì)siRNA的制備方法沒有特別的限制，包括但不限于化學(xué)合成法，本夕卜轉(zhuǎn)錄法、RnaseIII(女卩SilencersiRNAConstructionKit，Ambion公司)或Dicer酶消化dsRNA法等。應(yīng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員在得知了本發(fā)明所提供的siRNA的序列以后，可以以各種途徑方便地制備或表達(dá)所述的siRNA。例如，在本發(fā)明的一種優(yōu)選例中，所述的siRNA是化學(xué)合成的。siRNA可以制備成雙鏈核酸的形式，它含有一個(gè)正義鏈和一個(gè)反義鏈，這兩條鏈僅在雜交的條件下形成雙鏈，其它情況下不連接。一個(gè)雙鏈RNA復(fù)合物可以由相互分離的正義鏈和反義鏈來制備。因此，舉例來講，互補(bǔ)的正義鏈和反義鏈?zhǔn)腔瘜W(xué)合成的，其后可通過退火雜交，產(chǎn)生合成的雙鏈RNA復(fù)合物。此外，siRNA包含的正義鏈和反義鏈可通過一個(gè)或多個(gè)編碼正義鏈和反義鏈的表達(dá)盒來制備。當(dāng)正義鏈和反義鏈由一個(gè)單獨(dú)的表達(dá)盒編碼時(shí)，它們可以從生成的轉(zhuǎn)錄物中斷裂形成分離的正義鏈和反義鏈，其后雜交生成雙鏈siRNA。在Engelke,D.R.寫的RNAInterference(腿i):NutsandBoltsofRNAiTechnology—書中，特別是第5和第6章，DNAPressLLC,Eagleville，PA，2003可以讀到制備siRNA的合成和重組方法。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，一種雙鏈"短發(fā)夾"RNA復(fù)合物(稱作"shRNA"或"發(fā)夾siRNA")包含一條反義鏈和一條正義鏈，通過一個(gè)間隔序列相連。shRNA可以化學(xué)合成，也可以通過一個(gè)重組核酸結(jié)構(gòu)里的表達(dá)盒轉(zhuǎn)錄成單鏈RNA之后進(jìn)行制備。shRNA有互補(bǔ)結(jié)構(gòu)區(qū)，在雜交條件下形成"發(fā)夾"構(gòu)象，在其中互補(bǔ)的正義鏈和反義鏈相連接，例如，通過一個(gè)l-20個(gè)核苷酸的核苷酸序列連接?？傮w來講，每一個(gè)互補(bǔ)的正義鏈和反義鏈有大約14-30個(gè)核苷酸。如上述，shRNA可以由編碼需要的轉(zhuǎn)錄物的雙鏈DNA模板來表達(dá)。編碼需要的轉(zhuǎn)錄物的雙鏈DNA模板被插進(jìn)一個(gè)載體，例如質(zhì)粒或病毒載體，然后在體外或體內(nèi)連接到一個(gè)啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá)。shRNA在真核細(xì)胞內(nèi)DICER酶的作用下，可被切割成小干擾RNA分子，從而進(jìn)入RNAi途徑。"構(gòu)建物"及"表達(dá)盒"在這里是指重組DNA分子，它包含預(yù)期的核酸編碼序列，這個(gè)序列編碼一個(gè)siRNA或shRNA;這個(gè)DNA分子還包含轉(zhuǎn)錄在體外或體內(nèi)可操作的連接編碼序列所必需的或預(yù)期的適合的調(diào)控元件。"調(diào)控元件"在這里指的是可一定程度上控制核酸序列表達(dá)的核苷酸序列?？勺鳛榈浞兜恼{(diào)控元件包括增強(qiáng)子，內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)，復(fù)制起點(diǎn)，多腺苷酸化信號(hào)，啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄終止序列，以及上游調(diào)節(jié)區(qū)，這些調(diào)控元件有助于核酸的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾等。重組腺病毒在獲得的可有效抑制PDX-1表達(dá)的siRNA后，需要通過特定的方法來將所述的siRNA特異性遞送到腫瘤細(xì)胞內(nèi)或者使所述的siRNA在腫瘤細(xì)胞內(nèi)被生成，從而使腫瘤細(xì)胞與所述的siRNA接觸。這種特異性遞送可通過多種不同的遞送方法來完成，例如直接在局部部位注射所述的siRNA。然而，研究遞送方法的同時(shí)還需要考慮對(duì)于人體的安全性問題。本發(fā)明人在研究中找到了一種特別有效的遞送方法，以腺病毒作為載體，將所述的siRNA或shRNA遞送到靶細(xì)胞中。以腺病毒作為遞送載體的優(yōu)點(diǎn)如下首先，大多數(shù)的腫瘤都是上皮細(xì)胞來源的，而腺病毒具有嗜上皮細(xì)胞性，因此采用腺病毒具有很好的選擇性；其次，腺病毒產(chǎn)生的滴度高，腺病毒DNA不整合到靶細(xì)胞基因組，對(duì)于人體有良好的安全性；再次，腺病毒的理化性質(zhì)穩(wěn)定，易于制備、純化、濃縮。腺病毒(Ad)是一種無包膜的病毒，雙鏈DNA長(zhǎng)約36Kb，基因組由九個(gè)區(qū)組成，四個(gè)表達(dá)較早(E1-E4)稱作早區(qū)，五個(gè)表達(dá)較晚(L1-L5)稱作晚區(qū)，表達(dá)受細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子和E1區(qū)控制，E2區(qū)主要調(diào)節(jié)DNA復(fù)制，E3區(qū)基因產(chǎn)物與病毒逃避宿主免疫系統(tǒng)的清除有關(guān)，而E4區(qū)的產(chǎn)物參與病毒DNA復(fù)制、晚區(qū)基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄本拼接等活動(dòng)。目前己發(fā)現(xiàn)IOO余種腺病毒血清型，基因治療常用的人的2型(Ad2型)及5型(Ad5型)腺病毒，在DNA序列上有95。/。的同源性。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，采用復(fù)制缺陷型Ad5，缺失與病毒復(fù)制相關(guān)的基因E1，必須由宿主細(xì)胞(如293細(xì)胞)提供E1蛋白，才能復(fù)制出具有感染能力的病毒。腺病毒可通過受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)攝途徑進(jìn)入細(xì)胞，核內(nèi)體酸化后破裂，胞漿內(nèi)病毒DNA于溶酶體降解之前釋出，然后進(jìn)入細(xì)胞核而變成附著體狀態(tài)。本發(fā)明提供一種重組的腺病毒，所述的腺病毒的基因組中含有一重組表達(dá)盒，所述的重組表達(dá)盒含有如式I結(jié)構(gòu)的構(gòu)建物Seq正向一X一Seq反向《I，式I中，Seq正向、Seq反向、X的定義同前所述。在重組表達(dá)盒中，除了所述構(gòu)建物以外，還包括與所述構(gòu)建物操作性相連的其它元件，包括但不限于啟動(dòng)子、終止子等。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在所述構(gòu)建物的5'端連接有RNA聚合物III啟動(dòng)子，在所述構(gòu)建物的3'端連接有Poiin終止子。在進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)后，所述的構(gòu)建物在RNA聚合酶III啟動(dòng)子(如U6)的作用下，形成式II所示的二級(jí)結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>Seq正向__^~-n''XSeq反向"^式n。式II的二級(jí)結(jié)構(gòu)在細(xì)胞內(nèi)被諸如Dicer酶加工后，形成可抑制PDX-1轉(zhuǎn)錄的siRNA。優(yōu)選的，所述的Seq正M或Seq^選自下組(或與選自下組的序列互補(bǔ))(a)具有SEQIDNo:3所示的核苷酸序列；(b)具有SEQIDNo:4所示的核苷酸序列；(c)具有SEQIDNo:5所示的核苷酸序列；或(d)具有SEQIDNo:6所示的核苷酸序列。此外，還可以使重組的腺病毒表達(dá)靶向元件或與靶向元件相結(jié)合，靶向元件例如可以是增強(qiáng)所述重組腺病毒穿越細(xì)胞膜屏障的。例如蛋白質(zhì)，肽類，抗體，抗原結(jié)合抗體片段，激素，抗原，半抗原，碳水化物結(jié)合部分如凝集素，酶，酶底物，受體，受體配體，運(yùn)載體的底物等，以及其它能夠與結(jié)合配偶體分子特異性相互作用的分子。更特別的，增強(qiáng)腺病毒到細(xì)胞內(nèi)特定位置的遞送作用的靶向元件可以是不同的細(xì)胞器定位信號(hào)，例如核定位信號(hào)?；蛘?，耙向元件可與靶細(xì)胞的標(biāo)記物發(fā)生相互作用。例如，特定的腫瘤表達(dá)可預(yù)示腫瘤細(xì)胞級(jí)別的腫瘤標(biāo)記物。評(píng)估腺病毒將siRNA或sh認(rèn)A引入細(xì)胞的有效量的效能的適合方法是已知的，包括測(cè)定PDX-1蛋白和/或PDX-1編碼mRNA的以下方法中的一種或多種RT-PCR，脂A印跡，免疫印跡，免疫沉淀作用以及ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)。此外還包括對(duì)接觸所述抑制制劑后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡進(jìn)行測(cè)定，例如對(duì)特異性凋亡指示物測(cè)定包括基因組DNA碎片，細(xì)胞錨定蛋白標(biāo)記，或活化Caspase-3水平測(cè)定。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，本發(fā)明人構(gòu)建了pdx-lsiRNA克隆載體"pRNAi-shuttle"，并與pAd/BLOCK-iTTM-DEST載體(購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司)實(shí)施LR重組反應(yīng)，最終制備了PDX-1shRNA重組腺病毒載體。體外抗腫瘤篩選實(shí)驗(yàn)證明其具有廣泛和近乎100%的高效抗腫瘤作用，表明可能為有效的體內(nèi)藥物載體。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的腺病毒為Ad5型腺病毒。藥物組合物本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，所述的藥物組合物包括有效量的所述重組腺病毒以及與所述腺病毒相容的載體。所述與腺病毒相容的載體需在本質(zhì)上對(duì)于人和/或動(dòng)物無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)，并在本質(zhì)上與腺病毒制劑、任何所用到的靶向元件以及其它成分無作用。所述"有效量"是指可對(duì)人和/或動(dòng)物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動(dòng)物所接受的量。所述"與腺病毒相容的載體"指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPub.Co.，N.J".1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的賦形劑的充分討論。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、潤(rùn)滑劑、助流劑、潤(rùn)濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。本發(fā)明所述的重組腺病毒的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴(yán)重程度等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)各種因素來確定(例如通過臨床試驗(yàn))。所述的因素包括但不限于所述的siRNA的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴(yán)重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。通常，當(dāng)本發(fā)明的重組腺病毒制劑每天以約10M0"pfu/kg(優(yōu)選的為104-1012pfu/kg;進(jìn)一步優(yōu)選的為1oMo'V"u/kg)動(dòng)物體重的劑量給予，能得到令人滿意的效果，較佳地每天以2-4次分開的劑量給予，或以緩釋形式給藥?？烧{(diào)節(jié)此劑量方案以提供最佳治療應(yīng)答。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或?qū)┝堪幢壤販p少。任何適用的給藥途徑都是可以的，包括但不限于靜脈內(nèi)注射、皮下注射、肌肉注射、經(jīng)皮給予、局部給予、植入、緩釋給予、腫瘤內(nèi)給予等；優(yōu)選的，所述給藥方式是非腸道給予的。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)首次揭示PDX-l是一種在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵性因子，而在非腫瘤的細(xì)胞中則無明顯表達(dá)，其可作為一種新的腫瘤治療的靶標(biāo)。(2)首次揭示可高效和特異地抑制PDX-l表達(dá)的siRNA片段，并采用RNA干擾技術(shù)驗(yàn)證了PDX-1在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中的重要作用。(3)提供一種良好的抑腫瘤制劑，以腺病毒作為將所述siRNA或shRNA遞送到細(xì)胞內(nèi)的載體。由于大多數(shù)的腫瘤都是上皮細(xì)胞來源的，而腺病毒具有嗜上皮細(xì)胞性，因此具有很好的選擇性；并且，腺病毒產(chǎn)生的滴度高，不整合宿主基因組，對(duì)于人體的安全性高；此外，腺病毒的理化性質(zhì)穩(wěn)定，易于制備、純化、濃縮。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例l人有效PDX-1siRNA片段的設(shè)計(jì)、合成1.耙序列的確定人PDX-1siRNA耙點(diǎn)是由DharmaconsiDesign工具(美國(guó)Dharmacon公司)設(shè)計(jì)的，基于的序列是人PDX-lmRNA序列(GenBank登錄號(hào)為醒—000209)。選出帶有30-50%GC含量的幾個(gè)候選的人PDX-1siRNA靶點(diǎn)，并用NCBIBLAST檢索任何與人PDX-1以外的其他基因序列互補(bǔ)的PDX-1siRNA，排除與人PDX-1以外的其他基因序列互補(bǔ)的PDX-1siRNA靶點(diǎn)。經(jīng)過反復(fù)的試驗(yàn)和篩選，結(jié)果確定4個(gè)針對(duì)人PDX-1的siRNA靶序列，分別如下5，AGTTCCTATTCAACAAGTA3，(SEQIDNo:3)，即對(duì)應(yīng)于核苷酸序列SEQIDNo:l的第590-608位。人PDX-l核苷酸序列見SEQIDNo:1，編碼的人PDX-l蛋白序列見SEQIDNo:2。5'TTCCTATTCAACAAGTACA3，(SEQIDNo:4)，即對(duì)應(yīng)于核苷酸序列SEQIDNo:1的第592-610位。5'CTTGACCGAGAGACACATC3，(SEQIDNo:5)，即對(duì)應(yīng)于核苷酸序列SEQIDNo:1的第651-669位。5，TGACCGAGAGACACATCAA3'(SEQIDNo:6)，即對(duì)應(yīng)于核苷酸序列SEQIDNo:1的第653-671位。以Dharmacon提供的(-)siControl(靶序列是ACTACCGTTGTATAGGTG(SEQIDNo:7))作為陰性對(duì)照，該序列已被證實(shí)與小鼠，大鼠以及人基因組均缺乏序列同源性。2.siRNA的合成根據(jù)上述獲得的靶位點(diǎn)的序列，來合成siRNA。各siRNA均可通過常規(guī)方法合成5，AGUUCCUAUUCMCAAGUAUU3，(SEQIDNo:14，PDX-1siRNA590);5，UUCCUAUUCAACAAGUACAUU3'(SEQIDNo:15，PDX-1siRNA592);5'CUUGACCGAGAGACACAUCUU3，(SEQIDNo:16，PDX-1siRNA651);5，UGACCGAGAGACACAUCAAUU3'(SEQIDNo:17，PDX-1siRNA653)。并且，陰性對(duì)照(-)siControl對(duì)應(yīng)的siRNA為:5，ACUACCGUUGUAUAGGUGUU3，(SEQIDNo:18)。實(shí)施例2Western印跡將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用RIPA裂解緩沖液裂解(由20mMTris-HC1，pH8.0，100mMNaCl，1mMEDTA和帶有蛋白抑制因子的混合物的1%NP-40組成)。在溶胞產(chǎn)物中的蛋白濃聚物用BSA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定(購(gòu)自Pierce,Rockford,IL)。每個(gè)樣本的50mg蛋白溶解物用5X加樣緩沖液(由0.25MTris-HCl，pH6.8，50%甘油，5%SDS，％52-巰基乙醇，和2.5%溴酚藍(lán))混合。這些樣品在98。C下被孵育5分鐘，在冰上孵育5分鐘，后在室溫下在一小離心機(jī)上以最大速度離心。蛋白質(zhì)在10y。SDS/聚丙烯酰胺凝膠溶解并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。膜在含有5%脫脂奶粉的TBST(由10mMTris-HCL，pH7.5,150mMNaCl，和0.1%Tween20組成)中阻滯1小時(shí)。被阻滯的膜由在TBST/5%脫脂奶粉中稀釋的第一抗體探測(cè)兩個(gè)小時(shí)。接著，膜用TBST中洗滌后在由辣根過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體孵育1小時(shí)。之后膜用TBST洗滌4次，抗體用化學(xué)發(fā)光試劑來檢測(cè)，如Amersham的ECLWesternblotting試劑。采用的一抗為兔多克隆anti-PDX-1抗體，其與從小鼠、大鼠及人中獲得的PDX-1可反應(yīng)，購(gòu)自Chemicon(目錄編號(hào)AB3243)。實(shí)施例3定量PCR利用常規(guī)的技術(shù)來提取細(xì)胞中的全部RNA，如用RNEASY試劑盒(Qiagen，Valencia,CA)。用常規(guī)技術(shù)來合成cDNA，如用HighCapacitycDNAArchivekit(Biosystems，F(xiàn)osterCity,CA)。使用如下引物5'-AGCCGGAGGAGAACAAGC-3，(SEQIDNo:8)和5，-TTCAACATGACAGCCAGCTC-3'(SEQIDNo:9)。擴(kuò)增條件為95°C，10分鐘，之后在一個(gè)Mx3000P熱循環(huán)儀(Stratagene，LaJolla，CA)中進(jìn)行40次30sec95°C/60sec6CTC。測(cè)量GAPDH在同樣擴(kuò)增條件下的表達(dá)作為內(nèi)部對(duì)照。實(shí)施例4通過測(cè)定AnnexinV來確認(rèn)凋亡大約5X105細(xì)胞被放在60mm直徑的培養(yǎng)皿中并培養(yǎng)一個(gè)晚上。細(xì)胞接著不被處理，或用對(duì)照或抗PDX-1的siRNA轉(zhuǎn)染。72或96小時(shí)后，細(xì)胞被胰酶酶解，用1X結(jié)合緩沖液洗滌，然后用熒光標(biāo)記的AnnexinV在黑暗中孵育15分鐘。然后，細(xì)胞迅速的用流式細(xì)胞儀分析。AnnexinV攝取的程度與PDX-1的表達(dá)的抑制誘導(dǎo)的凋亡程度成比例。實(shí)施例5人腫瘤細(xì)胞的PDX-1mRNA水平的測(cè)定人腫瘤細(xì)胞的PDX-1表達(dá)水平以PDX-1mRNA水平來呈現(xiàn)。人腫瘤細(xì)胞mRNA水平可由定量PCR來量化。許多人腫瘤細(xì)胞被評(píng)價(jià)，包括PANC-1，UKPAN(UK-PAN1),BxBc3，MiaPaCa2，MCF-7,SK-BR-3,AU565,MDA-MB-231，H23,H460，H520，T24，Um-UC-3和AG5229-hT(均購(gòu)自ATCC)。這些細(xì)胞相對(duì)于人正常組織(不包括胰腺beta和delta細(xì)胞)都過量表達(dá)PDX-1mRNA。結(jié)果見圖1?？俁NA通過常規(guī)技術(shù)從細(xì)胞中制備(RNAEASY，Qiagen,Valencia,CA)并合成cDNA(HighCapacitycDNAArchivekit,AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA)。人PDX-1raRNA通過使用BrilliantSYBRGreen檢測(cè)試劑(Stratagene，LaJolla，CA)，使用引物5，-AGCCGGAGGAGAACAAGC-3，(SEQIDNo:10)和5'-TTCAACATGACAGCCAGCTC-3，(SEQIDNo:11)。擴(kuò)增條件為95°C，10分鐘，之后在一個(gè)Mx3000P熱循環(huán)儀(Stratagene,LaJolla，CA)中進(jìn)行40次30sec95°C/60sec60°C。以GAPDH在同樣的擴(kuò)增條件下的表達(dá)作為內(nèi)部對(duì)照。(AssaysonDemand,AppliedBiosystems,FosterCity,CA)。PDX1mRNA的水平依據(jù)一個(gè)正常人成纖維細(xì)胞系，AG5229-hT中PDX-1表達(dá)的水平來進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。選擇不同的腫瘤細(xì)胞株來呈現(xiàn)不同組織來源的腫瘤的PDX-1表達(dá)情況胰腺癌(Panel,BxBC3，UKPAN，MiaPaCa-2)，乳腺癌(MCF-7，SK-BR-3，AU565,MDA-MB-231)，肺癌(H23,H460，H520)以及膀胱癌。所有這些細(xì)胞株都能夠在裸鼠體內(nèi)形成異種嫁接腫瘤，從而進(jìn)一步的在體內(nèi)進(jìn)行研究。實(shí)施例6siRNA對(duì)PDX-1表達(dá)的抑制使用前述合成的siRNA來阻止PDX-1表達(dá)和誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞凋亡。大約5X105MiaPaCa-2胰腺癌細(xì)胞被放在60mm直徑的培養(yǎng)皿中并在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)過夜。接著細(xì)胞用SEQIDNo:16的siRNA(PDX-1siRNA651)或SEQIDNo:18的siControlsiRNA孵育。未處理的細(xì)胞被用作附加對(duì)照組。72-96小時(shí)后，收獲細(xì)胞并使用免疫印跡分析PDX-1表達(dá)。圖2顯示了通過上述步驟獲得的免疫印跡結(jié)果，顯示PDX-1siRNA651(簡(jiǎn)稱651)顯著了抑制PDX-1表達(dá)。細(xì)胞放置為5X10s細(xì)胞/60國(guó)板。在過夜孵育之后細(xì)胞使用Dharmafect2siRNA轉(zhuǎn)染制劑轉(zhuǎn)染，為達(dá)到lOOnM的最終濃度，每板使用200ul的2uMsiRNA。72小時(shí)后收獲細(xì)胞，并通過免疫雜交來測(cè)定PDX-1蛋白的表達(dá)。以肌動(dòng)蛋白(actin)的表達(dá)作為參照。實(shí)施例7由PDX-1siRNA誘導(dǎo)的多種腫瘤細(xì)胞凋亡以及使用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定ArmexinV的結(jié)合采用乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌相關(guān)的細(xì)胞株(MCF-7、T-47D(購(gòu)自ATCC)、SK-BR-3、MiaPaCa-2、SK-OV-3、PC3(購(gòu)自ATCC))以及使用端粒酶永生化的人胚胎成纖維細(xì)胞(BJ)。細(xì)胞被放置為5xl()5細(xì)胞/60mni板。在一夜的孵育之后使用Dharmafect2siRNA轉(zhuǎn)染制劑轉(zhuǎn)染，為達(dá)到lOOnM的最終濃度，每板使用200ii1的2uMsiRNA。在轉(zhuǎn)染后72小時(shí)收獲細(xì)胞，在黑暗環(huán)境中用FITC-標(biāo)記的A皿exinV孵育15分鐘，然后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。上述每種細(xì)胞株以及胰腺癌細(xì)胞(MiaPaCa-2)均被制備成未轉(zhuǎn)染、siControl以及PDX-lsiRNA590(siPDX-1-590;SEQIDNo:14)組。結(jié)果顯示在圖3中，上述各種腫瘤細(xì)胞由于高表達(dá)PDX-l，siRNA干擾PDX-l表達(dá)后細(xì)胞廣泛凋亡；只有成纖維細(xì)胞(BJ)顯示對(duì)PDX-1的抑制抵抗。實(shí)施例8直接觀察siRNA處理的細(xì)胞的死亡使用合成siRNA來抑制PDX-1的表達(dá)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。大約5X105的UKP緒-1，PANC-1，MiaPaCa-2或LN-CaP(人前列腺癌細(xì)胞)被放置在60ram直徑的培養(yǎng)皿中并在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)一夜。使用DharraafectsiRNA轉(zhuǎn)染試劑，用SEQIDNo:14的2yMsiRNA600nL或SEQIDNo:18的siControl轉(zhuǎn)染細(xì)胞。最終的siRNA濃度為100nM。未處理的細(xì)胞培養(yǎng)株用作附加的對(duì)照。對(duì)使用合成si脂A來抑制PDX-1表達(dá)的細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行顯微鏡檢査和直接目測(cè)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞幾乎完全死亡。相反的，與對(duì)照siRNA孵育的細(xì)胞以及未處理的細(xì)胞卻沒有或僅有少量死亡。如果把siRNA轉(zhuǎn)染的當(dāng)天作為第一天，在第四天(siRNA轉(zhuǎn)染后72小時(shí))左右開始出現(xiàn)最初的細(xì)胞死亡。在第六天幾乎100%的細(xì)胞死亡。實(shí)施例9RT-PCR分析PDX-1siRNA590轉(zhuǎn)染的MiaPaCa2細(xì)胞PDX-1的表達(dá)前述合成的siRNA被用來阻止培養(yǎng)細(xì)胞的PDX-1表達(dá)。大約5X105MiaPaCa2細(xì)胞被放在60mm直徑的培養(yǎng)皿中并在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)一夜。細(xì)胞接著被SEQIDNo:14的PDX-1siRNA或SEQIDNo:18的對(duì)照siRNA孵育轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后24，48以及96小時(shí)細(xì)胞溶解，總RNA被分離，并使用定量RT-PCR分析所述的PDX-1siRNA降低PDX-1mRNA水平的有效性，結(jié)果如圖4所示，在第2天和第4天，PDX-1mRNA水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的下降。實(shí)施例IO觀察PDX-1siRNA處理的腫瘤細(xì)胞的凋亡前述合成的siRNA被用來阻止培養(yǎng)細(xì)胞的PDX-1表達(dá)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。約5X105UK-PAN1胰腺癌細(xì)胞、LN-CAP前列腺癌細(xì)胞或非癌細(xì)胞3T3被放在60mm的直徑的培養(yǎng)皿中并在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)一夜。接下來使用PDX-1siRNA590(SEQIDNo:14)或?qū)φ誷iRNA(SEQIDNo:18)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。未處理的細(xì)胞用作進(jìn)一步的對(duì)照。結(jié)果如圖5A-C所示，胰腺癌細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞被所述PDX-1siRNA(見圖中右列)殺死，但不受對(duì)照siRNA(見圖中左列)的損害，非癌細(xì)胞幾乎不受PDX-1siRNA的影響。實(shí)施例11重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建1.pRNAi-shuttle-shRNA的構(gòu)建分別以實(shí)施例1中4個(gè)靶點(diǎn)序列為正義鏈(S叫M)，以其互補(bǔ)鏈為反義鏈(SeqM)，分別在正、反義鏈之間加入反向互補(bǔ)序列Loop(TTCAAGAGA)，形成5，-SeQ正向-Loop-Seq反向-3'的結(jié)構(gòu)，并且分別在正義鏈5'端引入BamHI酶切位點(diǎn)，在反義鏈3，端引入RNApolIII終止子(polyT終止子，TTTTTT)禾QHindlll酶切位點(diǎn)，從而形成用于表達(dá)人PDX-1shRNA的寡核苷酸模板(DNAoligo)。上述的模板雙鏈經(jīng)退火后雜交，形成shRNA結(jié)構(gòu)，以BamHI和Hindlll酶切后克隆入載體pRNAi-shuttle(見圖6和圖13，原始質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，采用常規(guī)方法加入了hU6(人源U6)啟動(dòng)子，BamHI和Hindlll酶切位點(diǎn))的BamHI和Hindlll酶切位點(diǎn)內(nèi)(在hU6啟動(dòng)子和PolIII終止子之間)，獲得含有目的基因的克隆載體。根據(jù)PDX-l靶基因位點(diǎn)的不同，制備的克隆載體分別被命名為pRNAi-shuttle-shRNA590、pRNAi-shuttle-shRNA592、p瞧i-shuttle-s國(guó)A651、pRNAi-shuttle-shRNA653、p畫i-shuttle-shRNA(-)siControl。2.重組腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與克隆重組腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與克隆的基本流程見圖8。將前述構(gòu)建的含有目的基因的克隆載體pRNAi-shuttle-shRNA590、p腿i-shuttle-sh腿592、pRNAi-shuttle-s畫A651、pRNAi-shuttle-sh廳653、pRNAi-shuttle-s國(guó)A(-)siControl，分別與pAd/BLOCK-iT-DEST載體(見圖7，購(gòu)自Invitrogen公司)進(jìn)行LR重組反應(yīng)，獲得攜帶相應(yīng)sh脂A的重組載體。將所獲得的重組載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TopIO(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)，氨節(jié)青霉素陽性LB平板上篩選陽性克隆。從獲得的陽性克隆中抽提重組腺病毒表達(dá)載體。然后進(jìn)行PCR鑒定，用于鑒定的引物為正向5，GGAACCAATTCAGTCGACGAATTC3，(SEQIDNo:12);反向5，GCTGGGTCTAGACCAAGCTTTTCC3，(SEQIDNo:13);經(jīng)PCR和測(cè)序鑒定，獲得了正確的重組腺病毒表達(dá)載體。3.重組PDX-lshRNA腺病毒的產(chǎn)生及滴度的測(cè)定1)將重組腺病毒表達(dá)載體用PacI酶切，采用常規(guī)的DNA純化試劑盒利用酚氯仿提取法純化消化過的質(zhì)粒DNA，并抽提純化質(zhì)粒。2)采用LipofectamineTM2000將消化后的載體轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞(購(gòu)自ATCC);直到80Q/。CPE(細(xì)胞病變效應(yīng))出現(xiàn)時(shí)(一般在轉(zhuǎn)染后10-13天)收獲含病毒的細(xì)胞和培養(yǎng)液，反復(fù)凍融后離心獲得病毒原液。3)通過病毒原液感染293A細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增，收獲病毒原液后采用高速離心法濃縮純化病毒，并采用QuickTiterTM腺病毒滴度測(cè)定試劑盒(購(gòu)于美國(guó)CellBiolabs公司)測(cè)定滴度。利用Lipofectaraine2000轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞得到重組PDX-1shRNA腺病毒，通過病毒原液感染293A細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增，擴(kuò)增病毒滴度經(jīng)測(cè)定可達(dá)1X108—9噬菌體形成單位(plaque-formingunits,pfu)/ml，再經(jīng)常規(guī)的高速離心方法可純化至1X1010—Vu/ml。分別獲得表達(dá)s麗A590、s函A592、sh腿651、shRNA653的腺病毒，以及對(duì)照攜帶shRNA((-)siControl)的腺病毒。實(shí)施例12重組PDX-1shRNA腺病毒制劑所述的重組PDX-1shRNA腺病毒制劑的配制如表1。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>實(shí)施例13重組PDX-1shRNA腺病毒體外抗腫瘤效應(yīng)觀察采用含10%胎牛血清的畫EM培養(yǎng)液，按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)法于5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人胰腺癌Pane-1細(xì)胞和MiaPaca-2細(xì)胞，采用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)人卵巢癌SK0V3細(xì)胞，人肝癌S廳C7721細(xì)胞，人乳腺癌MDA-MB-435s細(xì)胞和人胃癌SGC7901細(xì)胞(人卵巢癌SK0V3細(xì)胞、人胰腺癌MiaPaca-2、Panc-1細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；人肝癌S顧C(jī)7721細(xì)胞、人胃癌SGC7901細(xì)胞購(gòu)自中科院北京細(xì)胞中心；人乳腺癌高轉(zhuǎn)移MDA-MB-435s細(xì)胞購(gòu)自鄭州大學(xué)。細(xì)胞培養(yǎng)所需高糖DMEM培養(yǎng)液，高糖1640培養(yǎng)液，非必需氨基酸，L-谷氨酰胺，雙抗(細(xì)胞培養(yǎng)用青霉素-鏈霉素)均購(gòu)自Invitrogen公司)。將上述培養(yǎng)的細(xì)胞分別進(jìn)行如下處理A)利用590腺病毒制劑分別感染上述6種細(xì)胞，同時(shí)以等量的表達(dá)無意義的shRNA((-)siControl)的腺病毒制劑作為陰性對(duì)照，感染后觀察細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果見圖9，圖10和圖11。在圖9中，空白對(duì)照孔、陰性對(duì)照組由于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，培養(yǎng)基顏色呈酸性改變(呈淺黃色)，而PDX-1基因阻斷組(陽性感染孔)因PDX-1基因阻斷導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，因而培養(yǎng)基顏色呈正常培養(yǎng)基顏色(呈淺紅色)。圖IO和圖11顯微鏡觀察顯示當(dāng)給予相同滴度病毒感染后，陰性對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，鋪滿平板。而PDX-1基因阻斷組(陽性感染組)腫瘤細(xì)胞大部分或近乎全部凋亡。上述體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，陽性組的腫瘤細(xì)胞近乎100%調(diào)亡，而對(duì)陰性組和空白組的腫瘤細(xì)胞影響很小。B)RT-PCR和WesternBlot分析PDX-1的表達(dá)阻斷效應(yīng)。此外，發(fā)明人還培養(yǎng)乳腺癌MDA-MB-435S細(xì)胞，前列腺癌pc-3細(xì)胞，乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，肺癌A549細(xì)胞，宮頸癌hela細(xì)胞，肝癌7721細(xì)胞，比較觀察采用590腺病毒制劑和shRNA((-)siControl)腺病毒處理后細(xì)胞的變化。結(jié)果見圖12。由圖12可見，對(duì)照shRNA((-)siControl)腺病毒處理組對(duì)于乳腺癌MDA-MB-435S細(xì)胞，前列腺癌pc-3細(xì)胞，乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，肺癌A549細(xì)胞，宮頸癌hela細(xì)胞，肝癌7721細(xì)胞的生長(zhǎng)無明顯抑制，而590腺病毒制劑處理組可顯著抑制乳腺癌MDA-MB-435S細(xì)胞，前列腺癌pc-3細(xì)胞，乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，肺癌A549細(xì)胞，宮頸癌hela細(xì)胞，肝癌7721細(xì)胞的生長(zhǎng)。實(shí)施例14重組PDX-1shRNA腺病毒體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)觀察6周齡雌性裸鼠，購(gòu)自河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。5乂106個(gè)人胰腺癌細(xì)胞系MiaPaCa-2、卵巢癌細(xì)胞系SK0V3于PBS中在右側(cè)肋腹(flanking)皮下注射給裸鼠。腫瘤在數(shù)周內(nèi)可達(dá)100-500mm3，表示模型建立成功。將荷瘤鼠隨機(jī)分三組，第一組為治療組，第二組為病毒對(duì)照組，第三組為PBS對(duì)照組，于腫瘤接種部位內(nèi)分別注0.lml的lX109pfu590腺病毒制劑、0.lml的lX109pfu651腺病毒制劑、lX109pfushRNA((-)siControl)的腺病毒和PBS，測(cè)量腫瘤體積，計(jì)算抑瘤率以及相關(guān)機(jī)制研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在注射590腺病毒制劑和651腺病毒制劑后，治療組小鼠的腫瘤體積顯著減小，且對(duì)于小鼠未見有毒性影響；而病毒(-)siControl對(duì)照組以及PBS對(duì)照組小鼠的腫瘤體積非但沒有減小，還有一定的增加。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<H0〉鄭州威瑞生物技術(shù)有限公司<120〉一種抗腫瘤的腺病毒制劑<130>056423<160〉18<170〉Patentlnversion3.3〈210>1〈2n〉1527〈212>DNA<213>智人(HomoSapies)<400〉1aaagcgagcaagctcccgactgaacggcgaagcgaggcccagcccccgccgccccccggaaccttcaccacggagggagcggatgaagtccggagccggatgg柳aggatcatgttgEiaggaaaaaggacggagcctgacgccgccccctgccgcctggaaccEicgatggagcagagggggcaattgcgcagttggggctttgtagtatcacatccctggctgggccgsggaMacagtggggtggcgctcccggctccggagcagtacggcgccggaggccgccgccgcatctccccgccacctcccgcgsgccgggctaccaaagctggagaacaaggttcctattccttgaccgagggaggacaaggcsggactgccggaggtgctccttagcgcg柳ggcaggacctaggaggagggcccacctcccgcgggtatggggccctcccctcctacagaaactgtacgtaccttaatgagtcctcctcgggagtgggcggctcccggtacgcggccattcagcgccacacccgttcctacgaggtgcgctcagctcggtcctggsggcacgcgtggacggscgcgcaaac犯gtacaagac3C3tcaaagcgcggcggccgtgacctgtgccgcccgtcgccacagcgctgctcctgccccgggcgttagaccgaaggatgccggcattttagtgatgcactccacccstacacattctgccataas3tgtUg3gtcttcctc犯cgccacacctcccggtgccgcagctttagcccccctgcctggcgccctcccccctcgccgctcccccaagcccaaccgaaggccagtgcggcctacactctcacggccagatctggUgcgggacagcccggcg鄉(xiāng)3ctgcccccgtcctccagcgtgctgaggggcggaccacccggggaaaacccggccUccggactggattggttgggacctgggaaggctccgccattcttaagtgccaaatccaatcccggcaaggacccagtgcctgtacgggcgcgctgcgacgacccccccgcccgcccgtccagctgggcaggcggcgcgcgcacaggcgccgggtgccsaaaccgctgtcgggggtgcttctggcgtgccgcccgacgcgcctcggttcaaccactccctggcagtgctctctcagcgttgtttgttttagagaagctaacacacactcgggcgaccccgtgaaatccccggctccgccgcagccatgcgcgttccatgggccgccgcggtggcgcgggcccttcccctttcccatgcctacgctgctgctagagcgagctggctgcgcatgaagtggcggggtcgctgccgccgcgagggccgcccggccgcaggcgccgaggagtgaatggggcgcgcatgtgcgccattggUggctgttgcgccggctxttccagcgggg犯ccctttaagttg3tgCC3gt60120180240300360420480540600660720780840900960102010801140120012601320腦144015001527〈210〉2<211〉283〈212〉PRT〈213〉智人(HomoSapies)<400>2MetAsnGlyGluGluGinTyrTyrAlaAlaThrGinLeuTyrLysAsp151015ProCysAlaPheGinArgGlyProAlaProGluPheSerAlaSerPro202530ProAlaCvsLeuTyrMetGlyArgGinProProProProProProHis354045ProPheProGlyAlaLeuGlvAlaLeuGluGinGlySerProProAsp505560lieSerProTyrGluValProProILeuAlaAspAspProAlaValAla65707580HisLeuHisHisHisLeuProAlaGinLeuAlaLeuProHisProPro859095AlaGlyProPheProGluGlyAlaGluProGlyValLeuGiuGluPro100105110AsnArgValGinLeuProPheProTrpMetLysSerThrLysAlaHis115120125AlaTrpLysGlyGinTrpAlaGlyGlyAlaTyrAlaAlaGluProGlu130135140GluAsnLysArgThrArgThrAlaTyrThrArgAlaGinLeuLeuGlu145150LeuGluLysGluPheLeuPheAsnLys165ValGluLeuAlaValMetLeuAsnLeu180185TrpPheGinAsnArgArgMetLysTrp195200ArgGlyGlyGlyThrAlaValGlyGly210215GinAspCysAlaValThrSerGlyGlu225230ProProProProGlyGlyAlsValPro245ArgGluGlyArgLeuProProGlyLeu260265SerValAlaProArgArgProGinGlu275280<210>3〈211〉19〈212>腿<213>智人(HomoSapies)<400〉3agttcctattcaacaagta<210>4<211>19<212>廳<213>智人(HomoSapies)<400>4agttcctattcaacaagta<210>5<211>19〈212>DNA<213>智人(HomoSapies)<400>5cttgaccgagagacacatc〈210〉6<211〉19<212〉腿〈213〉智人(HomoSapies)<400>6tgaccgagagacacatcaa<210>7〈211〉18<212〉腿〈213〉人工序列〈400〉7actaccgttgtataggtg<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><221〉misc_feature〈223〉引物—155160TyrlieSerArgProArgArg170175ThrGluArgHislieLyslie190LysLysGluGluAspLysLys205GlvGlyValAlaGluProGlu220GluLeuLeuAlaLeuProPro235240ProAlaAlaProValAlaAla250255SerAlsSerProGinProSer270ProArg19191919<400>8agccggaggagaacaagc<210>9<211>20〈212〉DNA<213>人工序列<220〉<221>miscfeature<223〉引物—<400>9ttcaacatgacagccagctc<210>10<211>18〈212〉DNA<213>人工序列〈220〉<221>raisefeature<223>引物—<400>10a.gccggaggagaacaagc<210〉11〈211〉20<212>DNA<213>人工序列<220〉<221>miscfeature<223>引物<400〉11ttcaacatgacagccagctc<210>12〈211>24<212〉腿<213>人工序列<220〉<221〉miscfeature<223>引物—<400〉12gga.a,ccaattcagtcgacga<210>13<211〉24<212〉DNA<213〉人工序列<220><221>miscfeature〈223〉引物一<400>13gctgggtctagaccaagctt<210>14〈211〉21<212>隨<213〉人工序列<220><221>miscfeature<223>小干玩RNA<400〉14ag叫ccuauucaacaaguauu21<210>15<211>21<212〉■<213>人工序列<220〉<221〉misc—feature<223>小干玩RNA<400〉15uuccuauucaacaaguacauu21<210>16<211>21〈212〉RNA<213〉人工序列<220〉<221〉raise—feature<223>小千玩RNA〈400〉16cuugaccgagagacacaucuu21<210>17<211>21〈212〉隨〈213〉人工序列<220><221〉misc—feature<223>小千玩RNA<400>17ugaccgagagacacaucaauu21<210〉18<211>20<212〉腿〈213〉人工序列〈220〉<221〉misc—feature<223>小+玩RNA〈400〉18acuaccguuguauagguguu20權(quán)利要求1.一種可抑制PDX-1表達(dá)的構(gòu)建物，其特征在于，所述的構(gòu)建物具有以下式I結(jié)構(gòu)Seq正向-X-Seq反向式I，式I中，Seq正向?yàn)榭膳cPDX-1基因上任一區(qū)域基本互補(bǔ)且與PDX-1基因以外的人基因均不互補(bǔ)的核苷酸序列，Seq反向?yàn)榕cSeq正向基本互補(bǔ)的核苷酸序列，或者，Seq反向?yàn)榭膳cPDX-1基因上任一區(qū)域基本互補(bǔ)且與PDX-1基因以外的人基因均不互補(bǔ)的核苷酸序列，Seq正向?yàn)榕cSeq反向基本互補(bǔ)的核苷酸序列，X為位于Seq正向和Seq反向之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seq正向和Seq反向不互補(bǔ)，式I所示的結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，形成式II所示的二級(jí)結(jié)構(gòu)式II中，Seq正向、Seq反向和X的定義如上述，||表示在Seq正向和Seq反向之間形成的氫鍵。2.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述的Seq^或Seq^選自下組:(a)具有SEQIDNo:3所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列；(b)具有SEQIDNo:4所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列；(c)具有SEQIDNo:5所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列；或(d)具有SEQIDNo:6所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。3.—種重組載體，其特征在于，所述的載體中含有權(quán)利要求l所述的構(gòu)建物。4.一種重組的腺病毒，其特征在于，所述的腺病毒的基因組中含有一重組表達(dá)盒，所述的重組表達(dá)盒含有權(quán)利要求1所述的構(gòu)建物。5.如權(quán)利要求4所述的腺病毒，其特征在于，所述的重組表達(dá)盒從5'至3'依次含有以下元件RNA聚合酶III啟動(dòng)子；權(quán)利要求l所述的構(gòu)建物；和終止子。6.權(quán)利要求4所述的腺病毒的用途，其特征在于，用于制備治療PDX-1基因高表達(dá)相關(guān)疾病的藥物。7.如權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述的PDX-1基因高表達(dá)相關(guān)疾病是腫瘤。8.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述的腫瘤選自鱗狀細(xì)胞癌；基底細(xì)胞癌；移行細(xì)胞癌；腺癌；胃泌素瘤；膽管細(xì)胞癌；肝細(xì)胞腺瘤；肝細(xì)胞癌；腎細(xì)胞癌；黑色素瘤；纖維肉瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；橫紋肌肉瘤；畸胎瘤；血管肉瘤；Kaposi肉瘤；淋巴管肉瘤；骨瘤；骨肉瘤；成骨肉瘤；軟骨肉瘤；腦脊膜瘤；非霍奇金淋巴瘤；霍奇金淋巴瘤；白血病。9.一種藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物包含有效量的權(quán)利要求4所述的腺病毒；和與所述腺病毒相容的載體。10.—種治療腫瘤的方法，其特征在于，所述方法包括給予腫瘤患者有效量的權(quán)利要求4所述的腺病毒。全文摘要本發(fā)明公開了一種可通過抑制PDX-1表達(dá)而抑制腫瘤的siRNA以及基于所述siRNA序列設(shè)計(jì)的重組腺病毒。本發(fā)明還提供了含有所述腺病毒的藥物組合物。本發(fā)明所述的重組腺病毒具有產(chǎn)生滴度高、不整合到宿主基因組、安全性高的優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)C07H21/04GK101348512SQ20071004409公開日2009年1月21日申請(qǐng)日期2007年7月20日優(yōu)先權(quán)日2007年7月20日發(fā)明者韓志強(qiáng)申請(qǐng)人:鄭州威瑞生物技術(shù)有限公司