專利名稱：戒毒的反義核酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)，特別是應(yīng)用基因技術(shù)對(duì)藥物或毒品成癮的脫毒藥物。
背景技術(shù)：
目前毒品(海洛因等)依賴后，最常用的脫毒治療藥物是化學(xué)藥物。迄今為止，公認(rèn)最有效的脫毒治療藥物是美沙酮。而美沙酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)和藥理作用與嗎啡近似相同，分子式為C21H27NO·HCl是一種典型的阿片μ受體激動(dòng)劑，屬于合成麻醉性鎮(zhèn)痛藥。早在二十世紀(jì)六十年代Dole和Nyswander最先在美國(guó)試用美沙酮替代治療海洛因成癮。美沙酮是一種藥理活性略高于嗎啡的強(qiáng)效阿片受體激動(dòng)劑。美沙酮本身也是一種能引起成癮的麻醉藥品。美沙酮這種公認(rèn)的最常用和最有效的用于脫毒治療藥物存在著很多問題和副作用。第一，它是一種麻酸品，能引起藥物依賴，即也是一種毒品。第二，它能緩解阿片類藥物(如海洛因等)造成的身體依賴性，但對(duì)精神依賴性無緩解作用。第三，接受美沙酮維持療法中的吸毒人員，依然是對(duì)美沙酮這一種麻醉性鎮(zhèn)痛劑依賴，并且有可能永遠(yuǎn)不能擺脫美沙酮。第四，長(zhǎng)期使用美沙酮存在著安全性問題，有可能造成美沙酮中毒。第五，美沙酮能產(chǎn)生許多副作用。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述，本發(fā)明提供一種無依賴性、不中毒、無副作用、且能解決復(fù)吸問題的戒毒的反義核酸。
藥物或毒品成癮與人體的中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)有密切關(guān)系，中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)參與了幾乎所有成癮藥物或毒品的獎(jiǎng)賞效應(yīng)(Koob GF，TiPS，13177-184，1992)。中腦邊緣系統(tǒng)多巴胺起始于中腦的腹側(cè)被蓋區(qū)的多巴胺能神經(jīng)元；其纖維上行路徑經(jīng)內(nèi)側(cè)前腦束，投射至伏隔核，終于紋床核、隔核、嗅結(jié)節(jié)、額葉皮質(zhì)的顆粒區(qū)，前葉扣帶回以及邊緣葉等皮質(zhì)；有些纖維可遠(yuǎn)至嗅球，杏仁復(fù)合核和梨狀區(qū)皮質(zhì)，甚至投射至更廣泛的大腦皮質(zhì)。正常情況下，中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)像一個(gè)調(diào)節(jié)器或是過濾器，它控制外界傳入的各種刺激信號(hào)，然后通過錐體外系的運(yùn)動(dòng)傳出神經(jīng)轉(zhuǎn)為意向性行為活動(dòng)。大量的研究表明，阿片類藥物(如嗎啡，海洛因等)，精神興奮劑(如可卡因，安非他明，阿撲嗎啡等)，苯二氮卓類，巴比妥類和乙醇等都直接或間接地通過中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)介導(dǎo)各自的獎(jiǎng)賞效應(yīng)。(楊國(guó)棟等，中國(guó)藥物濫用防治雜志，33-6，1997；Hyman SE，Neuron，16901-904，1996；Koob GF，TiPS 13177-184，1992)。
藥物或毒品成癮有賴于中樞神經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程發(fā)生異常變化。具有成癮潛能的藥物或毒品作為細(xì)胞的一種信號(hào)，干擾腦內(nèi)的正常信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，使正常的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞功能發(fā)生改變使其造成異常，從而激活腦內(nèi)獎(jiǎng)賞系統(tǒng)產(chǎn)生各種精神和神經(jīng)效應(yīng)。如阿片類藥物可激動(dòng)阿片受體，進(jìn)而干預(yù)腦內(nèi)獎(jiǎng)賞系統(tǒng)和負(fù)性強(qiáng)化效應(yīng)；可卡因能抑制單胺類神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體；安非他明主要促進(jìn)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，也能抑制遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體；乙醇及鎮(zhèn)靜催眠藥主要影響GABA系統(tǒng)性；大麻類藥物作用于大麻受體；致幻劑夢(mèng)角酸二乙胺可激動(dòng)5-HT2A受體。這些成癮藥物或毒品通過作用于上述不同受體和激動(dòng)或抑制遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，改變其中樞神經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而引起中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)的多巴胺類神經(jīng)元活動(dòng)改變，使得產(chǎn)生獎(jiǎng)賞效應(yīng)，即產(chǎn)生對(duì)藥物或毒品的依賴反應(yīng)(Koob GF，TiPS，13177-184，1992；Nestle，EJ，Neuron，16897-900，1996)。
具有成癮潛能的藥物或毒品產(chǎn)生的藥物依賴性(成癮)不論最初藥物是作用于中樞神經(jīng)細(xì)胞的何種受體，或改變神經(jīng)組織的神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體，其最終發(fā)揮藥物效應(yīng)，產(chǎn)生依賴性，其中主要作用機(jī)理之一是與通過激活和興奮中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)的腦內(nèi)獎(jiǎng)賞系統(tǒng)中的多巴胺系統(tǒng)有關(guān)。因此，凡能阻斷中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)對(duì)依賴藥物的反應(yīng)，能有效地使藥物或毒品的成癮得到解除，便能達(dá)到有效的戒毒作用，特別是能有效地從精神依賴中解脫出來，使其不發(fā)生復(fù)吸。
正常情況下近日鐘基因通過自激振蕩產(chǎn)生近日節(jié)律的生命活動(dòng)與中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)相互作用，特別是神經(jīng)細(xì)胞近日鐘基因通過自激振蕩過程使得多巴胺受體活性改變對(duì)成癮潛能的藥物或毒品反應(yīng)性提高(Nestler EJ，et al，Neuron 11995-1000，1993；Yellman C，et al，Natl Acad Sci USA，944131-4136，1997)。當(dāng)近日鐘基因per1，per2，per3和clock中任意一基因發(fā)生突變或失去表達(dá)功能時(shí)，這種自激振蕩會(huì)受到影響，進(jìn)而使得多巴胺受體對(duì)成癮潛能的藥物或毒品反應(yīng)性下降甚至消失，其結(jié)果使得藥物或毒品成癮者對(duì)藥物或毒品的依賴性消失，達(dá)到脫毒的效果。
基于上述研究，本發(fā)明研制出一種反義核酸，用來調(diào)節(jié)人的近日鐘基因的表達(dá)，使人體的大腦組織中的近日鐘基因?qū)χ心X邊緣多巴胺系統(tǒng)的多巴胺受體活性改變，使該中樞獎(jiǎng)賞通路受影響，從而阻止其對(duì)成癮潛能的藥物或毒品的反應(yīng)性，使藥物或毒品成癮得到緩解或消失，最終達(dá)到藥物或毒品成癮者完全脫毒，特別是通過阻斷中腦邊緣系統(tǒng)這一中樞獎(jiǎng)賞通路使成癮藥物或毒品產(chǎn)生的特殊心理體驗(yàn)和精神感受，即稱為“正性強(qiáng)化作用”，將完全消失，也就使精神成癮性消失。從而實(shí)現(xiàn)戒毒。
本發(fā)明的戒毒的反義核酸，其反義核酸的全部序列或部分序列與人類近日鐘基因per1、per2、per3、clock的有義鏈、無義鏈或mRNA中的至少一個(gè)的全部序列或部分序列相同，或者反義核酸的全部序列或部分序列與人類近日鐘基因per1、per2、per3、clock的有義鏈、無義鏈或mRNA中的至少一個(gè)的全部序列或部分序列互補(bǔ)。
上述的反義核酸是在反義核酸上加入至少一個(gè)核苷酸、或者減少至少一個(gè)核苷酸、或者改變至少一個(gè)核苷酸，或者修飾化學(xué)基團(tuán)的結(jié)構(gòu)。
上述的化學(xué)基團(tuán)是主鏈、或堿基、或糖環(huán)，上述的結(jié)構(gòu)是一級(jí)結(jié)構(gòu)、或立體結(jié)構(gòu)、或構(gòu)象結(jié)構(gòu)。
核酸互補(bǔ)的原則是堿基A對(duì)T，G對(duì)C或者A對(duì)U，G對(duì)C。如果要制作一段核酸與目的核酸結(jié)合，那么制作的核酸中必須要有全部或部分堿基序列與目的核酸片段中的全部或部分序列互補(bǔ)。例如，需要制作一段核酸能夠與人類近日鐘基因per1結(jié)合，就需要該段核酸的部分或者全部序列與人類近日鐘基因per1的全部或部分序列互補(bǔ)。以人類近日鐘基因per1中第6961號(hào)堿基到7021號(hào)堿基為例，6961 acaaactctc agagcccatccccacccagc agttccattg cctacagcct cctgagtgcc7021，根據(jù)堿基互補(bǔ)的原則堿基A對(duì)T，G對(duì)C或者A對(duì)U，G對(duì)C需要制作tgtttgagag tctcgggtag gggtgggtcg tcaaggtaacggatgtcgga ggactcacgg核酸或者uguuugagag ucucggguag gggugggucg ucaagguaacggaugucgga ggacucacgg核酸與人類近日鐘基因per1中第6961號(hào)堿基到7021號(hào)堿基互補(bǔ)。一段核酸只需要包括上述兩段核酸中的一段或都包括，則可以與人類近日鐘基因per1結(jié)合。同理，可以任意選擇人類近日鐘基因per1中一段核酸為目的，制作一段與其序列互補(bǔ)的核酸。任意一段核酸只要包括該段核酸即可以與人類近日鐘基因per1結(jié)合。一段核酸中可以包括一段或者幾段與目的核酸互補(bǔ)的核酸片段。其中的互補(bǔ)核酸片段在17個(gè)堿基以上就具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的絕對(duì)結(jié)合特異性，但一般在15個(gè)堿基左右就可以保證結(jié)合的特異性。這種特異性的結(jié)合不僅可以是核酸針對(duì)人類近日鐘基因per1中的有義鏈，無義鏈，啟動(dòng)子或增強(qiáng)子；還可以是核酸針對(duì)人類近日鐘基因per1轉(zhuǎn)錄生成的mRNA。同樣可以制作核酸來特異性結(jié)合其它人類近日鐘基因如per1，per2，per3或clock基因的有義鏈、無義鏈、啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，及人類近日鐘基因如per1，per2，per3或clock基因轉(zhuǎn)錄生成的mRNA。這種核酸可以是普通的DNA或RNA核酸，也可以是帶有酶活性的DNA或RNA核酸，這一類核酸一般被稱為反義核酸。
為了延長(zhǎng)反義核酸在體內(nèi)的半衰期，提高其穿透細(xì)胞膜的能力，提高其生物活性，改變其在人體內(nèi)的分布等目的可以對(duì)制作的反義核酸進(jìn)行化學(xué)修飾。這種化學(xué)修飾可以是針對(duì)制作的整條反義核酸也可以是一條反義核酸的一部分。常見的核酸化學(xué)修飾方法有核糖基修飾，磷酸骨架的改性，核酸與嵌入劑偶聯(lián)或核酸與反應(yīng)基偶聯(lián)，堿基改性等。對(duì)核酸進(jìn)行化學(xué)修飾的方法在相應(yīng)的藥物化學(xué)專著或其它著作中有詳細(xì)的論述。因此制作的針對(duì)人類近日鐘基因per1，per2，per3和clock基因或其轉(zhuǎn)錄生成的mRNA的反義核酸不僅可以是普通的結(jié)構(gòu)，亦可以是經(jīng)過結(jié)構(gòu)改造的核酸。該反義核酸不僅可以是包括普通常見的堿基，也可以出于使用上的原因包括不常見的或人工制造的堿基。該反義核酸不僅可以是具有普通的磷酸骨架，也可以是由肽為骨架的核酸——肽核酸PNAS。經(jīng)過化學(xué)修飾的核酸在立體結(jié)構(gòu)和構(gòu)象上可以有所改變?？偠灾?，本發(fā)明的反義核酸可以是普通的及未經(jīng)修飾的，也可以是經(jīng)過化學(xué)修飾的。本發(fā)明的反義核酸可以與人類近日鐘基因per1，per2，per3或clock基因的有義鏈，無義鏈，啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，及人類近日鐘基因per1，per2，per3或clock基因轉(zhuǎn)錄生成的mRNA中的至少一個(gè)互補(bǔ)結(jié)合。本文的反義核酸其既可以從cDNA文庫中篩選克隆，亦可以人工合成獲得。
本發(fā)明的反義核酸可以是反義DNA、反義RNA、DNA核酶、RNA核酶中的一種。
上述的反義DNA是以靶基因人類近日鐘基因per1，per2，per3和clock基因或它們轉(zhuǎn)錄所得的mRNA序列為模板制作一段與其互補(bǔ)的DNA。反義DNA可以是per1反義DNA、per2反義DNA、per3反義DNA、clock反義DNA中的一種，其序列分別為，per1反義DNA5’cactcaggaggctgtaggacaatgga 3’，per2反義DNA5’gtggacatgagcagtggctccag 3’，per3反義DNA5’atggttgtccaagaaatgaaaaa 3’，clock反義DNA5’cactgcacagtcagatgctagtga 3’。
上述的反義RNA是以靶基因人類近日鐘基因per1，per2，per3和clock基因或它們轉(zhuǎn)錄所得的mRNA序列為模板制作一段與其互補(bǔ)的RNA。反義RNA可以是per1反義RNA、per2反義RNA、per3反義RNA、clock反義RNA中的一種，其序列分別為；per1反義RNA5’uccauugccuacagccuccugagugc 3’，per2反義RNA5’cuggagccacugcucauguccac 3’，per3反義RNA5’uuuucauuucuuggacaaccau 3’，clock反義RNA5’ucacuagcaucugacugugcagug 3’。
帶有酶活性的反義DNA核酸通常被稱為DNA核酶，帶有酶活性的反義RNA核酸通常被稱為RNA核酶。
上述的DNA核酶是以靶基因人類近日鐘基因per1，per2，per3和clock基因或它們轉(zhuǎn)錄所得的mRNA序列為模板，在有能被催化的結(jié)構(gòu)位點(diǎn)(R·Y；R＝A or G，Y＝C or U/T)為酶催化作用點(diǎn)，以兩側(cè)的DNA或RNA序列為結(jié)合區(qū)域，設(shè)計(jì)制作具有酶催化功能的DNA，當(dāng)其在體內(nèi)與靶基因的DNA或mRNA結(jié)合后，可催化切割使其裂解，造成使靶基因不能表達(dá)，甚至失去功能。DNA核酶中也只有部分核酸序列是與靶基因的DNA或mRNA序列互補(bǔ)。DNA核酶也應(yīng)有與目的核酸酶切位點(diǎn)兩側(cè)核酸序列結(jié)合的區(qū)域，即DNA核酶酶活性區(qū)域兩側(cè)的核酸序列應(yīng)與相應(yīng)酶切位點(diǎn)兩側(cè)的核酸序列互補(bǔ)?；パa(bǔ)的核酸堿基數(shù)一般應(yīng)在15～20個(gè)左右。DNA核酶可以是per1DNA核酶、per2DNA核酶、per3DNA核酶、clock DNA核酶中的一種，其序列分別為，per1DNA核酶5’tggactcaggctagctaacaacgatgccactt 3’，per2DNA核酶5’tgctcaggctagctacaacgagtccac 3’，per3DNA核酶5’tcttggaggctagctacaacgaaaccat 3’，clock DNA核酶5′ctcttcaggctagctacaacgatactaagg 3′。
上述的RNA核酶是以靶基因人類近日鐘基因per1，per2，per3和clock基因或其轉(zhuǎn)錄所得的mRNA序列為模板，然后在有能被核酶催化裂解的結(jié)構(gòu)位點(diǎn)(5’-NUH-3’；N＝C，G，U，A；H＝C，U，A)以及兩側(cè)的核酸序列為基礎(chǔ)，制作具有酶催化功能的RNA(根據(jù)制作的RNA的結(jié)構(gòu)分為發(fā)夾狀RNA核酶，錘頭狀RNA核酶等)。RNA核酶中部分核酸序列與靶核酸的序列互補(bǔ)，為結(jié)合區(qū)，其他部分為酶催化區(qū)不互補(bǔ)。尤其應(yīng)當(dāng)注意的是RNA核酶應(yīng)有與目的核酸酶切位點(diǎn)兩側(cè)核酸序列結(jié)合的區(qū)域，即RNA核酶酶活性區(qū)域兩側(cè)的核酸序列應(yīng)與相應(yīng)酶切位點(diǎn)兩側(cè)的核酸序列互補(bǔ)?；パa(bǔ)的核酸堿基數(shù)一般應(yīng)在15～20個(gè)左右。當(dāng)RNA核酶在體內(nèi)與靶核酸結(jié)合后，催化靶核酸發(fā)生裂解而失活，即靶基因表達(dá)被抑制。RNA核酶可以是per1RNA核酶、per2RNA核酶、per3RNA核酶、clockRNA核酶中的一種，其序列分別為，per1RNA核酶5’cucccagaugcugaugagucgugagacgaaacgauggugg 3’，per2RNA核酶5’ucccucugaugagacggugacgucgaaacuuugug 3’，per3RNA核酶5’cauuucuugcugaugagcaggugacugcgaaacaaccau 3’，clock RNA核酶5’uagcaucucugaugagucgugagacgaaacugugcagug 3’，。
本發(fā)明的反義核酸，是一種基因戒毒藥物，用于藥物或毒品成癮的脫毒。用于戒毒時(shí)可以使用一種反義核酸，可以同時(shí)使用幾種或多種反義核酸。本發(fā)明的反義核酸不僅可以單獨(dú)使用，也可以與其它物質(zhì)同時(shí)使用。
反義核酸具有能選擇性地使靶基因功能改變的作用。反義核酸的作用機(jī)制有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后加工和調(diào)節(jié)翻譯過程。反義核酸的作用機(jī)制依賴于它本身的序列特征。它本身的序列特征決定了它的作用目標(biāo)，針對(duì)何種目標(biāo)決定了它的作用機(jī)制。1、反義核酸調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄當(dāng)反義核酸的作用目標(biāo)為基因的DNA鏈，它可以與基因的DNA鏈相結(jié)合調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄。2、反義核酸調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后加工當(dāng)反義核酸的作用目標(biāo)為基因轉(zhuǎn)錄所得的前體mRNA，它可以與前體mRNA結(jié)合調(diào)節(jié)其加工。3、反義核酸調(diào)節(jié)翻譯過程當(dāng)反義核酸的作用目標(biāo)為基因轉(zhuǎn)錄的mRNA，它可以與mRNA結(jié)合調(diào)節(jié)其翻譯。反義核酸以哪一種機(jī)制起作用，起何種作用取決于該反義核酸的序列特征。
本發(fā)明的反義核酸能使人類近日鐘基因per1，per2，per3和clock中的至少一個(gè)表達(dá)改變。也可以使人類近日鐘基因per1，per2，per3或clock基因中的幾個(gè)或全部同時(shí)表達(dá)改變。本發(fā)明的反義核酸能針對(duì)靶基因的DNA或mRNA或雙鏈DNA合成一段與其互補(bǔ)的核酸，當(dāng)其與靶基因的DNA或mRNA或雙鏈DNA相結(jié)合時(shí)能改變靶基因表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)基因戒毒治療。
本發(fā)明的反義核酸是通過導(dǎo)入腦組織中去阻止近日鐘基因per1，per2，per3和clock中任意一基因表達(dá)，從而使近日鐘基因參與調(diào)控以多巴胺能傳導(dǎo)為主的側(cè)被蓋一伏膈核一前額葉皮層通路——中樞獎(jiǎng)賞通路受到影響，進(jìn)而使得毒品產(chǎn)生的藥物作用被阻斷。其結(jié)果使得由毒品引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用，特別是使得身體和心理對(duì)毒品依賴的反應(yīng)完全消失，最終達(dá)到脫毒作用。將反義核酸導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行治療的方法有多種，通常已有如物理的方法和生物方法，包括脂質(zhì)體介導(dǎo)法、受體介導(dǎo)法、基因槍技術(shù)和病毒介導(dǎo)法等。本發(fā)明在實(shí)施例中優(yōu)選但不僅限于脂質(zhì)體介導(dǎo)法。需要特別指出的是，本發(fā)明中的治療方法和采用的反義核酸主要是針對(duì)腦部，尤其但不限于下丘腦中的人類近日鐘基因per1，per2，per3和clock。將反義核酸導(dǎo)入腦內(nèi)治療部位的方法有鞘內(nèi)注射，亦可以采用微型泵將反義核酸輸注于腦室內(nèi)，也可以用腦室內(nèi)注射的方法。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中優(yōu)選了腦室內(nèi)注射將反義核酸導(dǎo)入治療部位。
反義核酸導(dǎo)入細(xì)胞可以采用已有的脂質(zhì)體包裹的方法，采用脂質(zhì)體包裹可以提高反義核酸導(dǎo)入細(xì)胞的效率。用脂質(zhì)體將反義核酸包裹后，可將包裹好的脂質(zhì)體采用合適的方式如采用腦室內(nèi)注射法導(dǎo)入受體治療部位。
RNA核酶可以采取用脂質(zhì)體直接包裹后注射入體內(nèi)。另外可以合成一段與RNA核酶序列互補(bǔ)的DNA，即其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為RNA核酶。將此段DNA重組于適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒載體上，如已有的pcDNA質(zhì)粒等。此段DNA還可以采用已有的重組方法重組于其它載體上，例如病毒載體，如腺病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。重組好的質(zhì)粒在用適當(dāng)?shù)闹|(zhì)體包裹好后，將脂質(zhì)體用適宜的方法導(dǎo)入治療部位。
本發(fā)明以上述反義核酸為基因藥物去阻斷近日鐘基因per1，per2，per3和clock中至少一基因的表達(dá)。首先以BALB/C小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，分別通過注射嗎啡或可卡因造成對(duì)阿片類(包括鴉片，嗎啡，海洛因等)或精神興奮劑(如可卡因，安非他明等)藥物成癮的動(dòng)物模型，然后分別給予上述反義核酸進(jìn)行基因治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用這種基因藥物治療技術(shù)能有效地使成癮動(dòng)物從對(duì)嗎啡或可卡因的依賴中解脫出來。
由于本發(fā)明所采用的反義核酸，其設(shè)計(jì)合成是參照人與小鼠近日鐘基因per1，per2，per3和clock的DNA或mRNA序列中完全同源區(qū)域的序列所設(shè)計(jì)而成。因此，這些反義核酸同樣能阻斷人的這些基因表達(dá)，阻斷藥物或毒品成癮的環(huán)節(jié)。通過這樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明依據(jù)人的近日鐘基因或人與動(dòng)物近日鐘基因的同源區(qū)域中的DNA或mRNA序列合成一段與其完全互補(bǔ)或部分互補(bǔ)的反義核酸，到達(dá)體內(nèi)就能有效地與靶基因結(jié)合，使靶基因表達(dá)失活或抑制。同理其他幾種反義核酸亦能發(fā)揮同樣作用，造成靶基因——per1，per2，per3和clock基因失活或抑制，達(dá)到戒毒作用。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較，具有如下的明顯優(yōu)點(diǎn)和顯著效果。
本發(fā)明的反義核酸以人類的近日鐘基因per1，per2，per3和clock，以這些近日鐘基因中任意一個(gè)基因以及表達(dá)產(chǎn)物即以DNA，mRNA作為作用對(duì)象使其功能改變，能使得上述基因表達(dá)失活或表達(dá)功能下降，從而使得這些基因參與調(diào)節(jié)的中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)的腹側(cè)被蓋區(qū)——伏隔核這一中樞獎(jiǎng)賞系統(tǒng)受到影響，結(jié)果使得藥物或毒品成癮者對(duì)藥物或毒品產(chǎn)生的依賴反應(yīng)消失，從而達(dá)到脫毒的作用。因此，本發(fā)明的戒毒的反義核酸用于戒毒時(shí)具有脫毒不產(chǎn)生依賴性、不中毒、無副作用、能解決復(fù)吸難題，從而達(dá)到徹底根治毒品成癮的優(yōu)點(diǎn)，而且具有不會(huì)在戒毒過程中造成新的成癮的優(yōu)點(diǎn)。
下面，再用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方法作詳細(xì)地說明。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明根據(jù)人和小鼠的近日鐘基因per1，per2，per3和clock的DNA或mRNA序列，(人類近日鐘基因per1，per2，per3和clock，其序列可在NIH的網(wǎng)站上查得)找出人與小鼠同源基因序列區(qū)域，如人的近日鐘基因與小鼠的近日鐘基因中可找到數(shù)十個(gè)同源序列段，然后分別合成如下針對(duì)同源序列段的反義核酸。
per1反義DNA5’cactcaggaggctgtaggacaatgga 3’，per2反義DNA5’gtggacatgagcagtggctccag 3’，per3反義DNA5’atggttgtccaagaaatgaaaaa 3’，clock反義DNA5’cactgcacagtcagatgctagtga 3’，per1反義RNA5’uccauugccuacagccuccugagugc 3’，per2反義RNA5’cuggagccacugcucauguccac 3’，per3反義RNA5’uuuucauuucuuggacaaccau 3’，clock反義RNA5’ucacuagcaucugacugugcagug 3’，per1DNA核酶5’tggactcaggctagctaacaacgatgccactt 3’，per2DNA核酶5’tgctcaggctagctacaacgagtccac 3’，per3DNA核酶5’tcttggaggctagctacaacgaaaccat 3’，clock DNA核酶5′ctcttcaggctagctacaacgatactaagg 3′。
per1RNA核酶5’cucccagaugcugaugagucgugagacgaaacgauggugg 3’，per2RNA核酶5’ucccucugaugagacggugacgucgaaacuuugug 3’，per3RNA核酶5’cauuucuugcugaugagcaggugacugcgaaacaaccau 3’，clock RNA核酶5′uagcaucucugaugagucgugagacgaaacugugcagug 3′，。
本實(shí)施例采用通常的脂質(zhì)體介導(dǎo)法分別將上述反義核酸導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。其中所用的脂質(zhì)體均為L(zhǎng)IPOFECTAMINETMReagent，購自GIBCO BRL公司。
1.將反義核酸轉(zhuǎn)染入神經(jīng)細(xì)胞1.1方法將上述各反義核酸分別作為基因藥物，用脂質(zhì)體包裹(下列各表中的反義核酸均已經(jīng)用脂質(zhì)體包裹)，分別導(dǎo)入普通體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞后培養(yǎng)。然后采用免疫組織化學(xué)方法，觀測(cè)所期望阻斷基因所表達(dá)出來的相應(yīng)蛋白質(zhì)，如PER1，PER2，PER3，CLOCK的表達(dá)水平。
1.2結(jié)果表1反義核酸對(duì)神經(jīng)細(xì)胞近日鐘基因表達(dá)的影響


+++為強(qiáng)陽性反應(yīng)，-為陰性反應(yīng)。
從表1可見，未轉(zhuǎn)導(dǎo)入反義核酸的神經(jīng)細(xì)胞免疫組化呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，即有這些細(xì)胞能表達(dá)合成近日鐘基因編碼的蛋白質(zhì)。而本發(fā)明以人類或小鼠的近日鐘基因?yàn)樽饔冒悬c(diǎn)設(shè)計(jì)合成出來的反義核酸能有效地阻斷人的近日鐘基因表達(dá)，因此在免疫組化檢測(cè)分析中，其表現(xiàn)出陰性反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)入反義核酸的神經(jīng)細(xì)胞幾乎不表達(dá)被阻斷的靶基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)，而僅加入純脂質(zhì)體，即加入脂質(zhì)體中無反義核酸所培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞，并不能阻斷上述基因的表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)生相應(yīng)蛋白質(zhì)。用免疫組化檢測(cè)，神經(jīng)細(xì)胞上述基因表達(dá)產(chǎn)物均表現(xiàn)為陽性。
1.3結(jié)論表1說明導(dǎo)入的反義核酸能阻斷或降低神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)基因的表達(dá)。
2.使用反義核酸對(duì)小鼠進(jìn)行戒毒治療2.1方法170只BALB/C小鼠，22～25g，隨機(jī)分成17組，每組10只雌雄各半，每只動(dòng)物腹腔注射嗎啡50mg/kg，每日三次連續(xù)注射七天以造成嗎啡依賴性動(dòng)物模型。在第五天時(shí)分別向腦內(nèi)注射脂質(zhì)體包裹的上述反義核酸.其中第一組動(dòng)物僅注射純脂質(zhì)體作為對(duì)照組，每日注射二次，共注射兩天。然后以鹽酸鈉洛酮4mg/kg，催促戒斷反應(yīng)，觀測(cè)和評(píng)估戒斷癥狀，注射了反義核酸各組動(dòng)物所觀測(cè)到的或斷癥狀與純脂質(zhì)體組的差異，用t檢驗(yàn)分析其統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異。
2.2結(jié)果結(jié)果發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)注射了反義核酸的小鼠的藥物依賴出現(xiàn)的戒斷癥狀較之注射純脂質(zhì)體的小鼠有著明顯的改善，見表2。
表2以近日鐘基因人與小鼠同源序列區(qū)域設(shè)計(jì)合成的反義核酸對(duì)嗎啡依賴小鼠的戒斷癥狀的影響(x±s)

*P＜0.01與純脂質(zhì)組小鼠的相應(yīng)值比較。
當(dāng)小鼠對(duì)嗎啡等藥物產(chǎn)生依賴性后，用鈉洛酮去催癮性會(huì)誘發(fā)嗎啡等藥物的依賴反應(yīng)，如跳躍頻頻，因此在表2中的純脂質(zhì)體跳躍次數(shù)高達(dá)15分鐘25次以上；同時(shí)不斷的出現(xiàn)“濕狗”樣抖動(dòng)、打洞等逃避行為；另外呼吸加深加快，體重下降等反應(yīng)。所以表2的純脂質(zhì)體組的動(dòng)物這些參數(shù)均比給予了反應(yīng)核酸治療處理的值高。當(dāng)給予反義核酸治療時(shí)，動(dòng)物的藥物依賴反應(yīng)明顯改善.
2.3結(jié)論說明反義核酸能有效的阻止動(dòng)物對(duì)嗎啡類藥物(或毒)的成癮反應(yīng)。
3.使用反義核酸阻斷小鼠對(duì)可卡因的反應(yīng)3.1方法通過研究表明當(dāng)其小鼠或人類近日鐘基因per1，per2，per3，或clock任意一基因表達(dá)被阻斷時(shí)，均會(huì)造成對(duì)中腦邊緣多巴胺能系統(tǒng)的功能調(diào)節(jié)的影響，從而阻斷與毒品依賴有直接關(guān)系的中樞獎(jiǎng)賞通路。
精神興奮劑(可卡因、安非他明等)的作用也是通過中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)產(chǎn)生精神依賴性。為了檢測(cè)分析，當(dāng)阻斷近日鐘基因per1，per2，per3，或clock任意一基因表達(dá)后，能否有效地達(dá)到治療精神興奮劑所致的藥物或毒品依賴性。通過以下的實(shí)驗(yàn)來證明。
可卡因?qū)π∈蟮幕顒?dòng)性的影響實(shí)驗(yàn)選用BALB/C小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物170只，隨機(jī)分成17組，每組10只，雌雄各半，其中第一組對(duì)照組腦內(nèi)注射純脂質(zhì)體。其他各組分別注射脂質(zhì)體包裹介導(dǎo)的per1，per2，per3，或clock基因的反義DNA，反義RNA，RNA核酶和DNA核酶。這些反義DNA，反義RNA，RNA核酶或DNA核酶的設(shè)計(jì)合成，完全按人與小鼠相應(yīng)基因的同源序列而設(shè)計(jì)，見文末圖5所示。注射這些反義核酸目的是使腦內(nèi)的這些基因表達(dá)失活。每日注射兩次，每次注射為0.03ml，連續(xù)注射兩天。第三天，動(dòng)物注射可卡因30mg/kg，然后觀測(cè)10分鐘的活動(dòng)性。小鼠的活動(dòng)性指標(biāo)由以下幾方面確定①站立運(yùn)動(dòng)記錄給藥10分鐘內(nèi)小鼠以后腿站立運(yùn)動(dòng)的次數(shù)；②來回移動(dòng)記錄給藥10分鐘內(nèi)小鼠在觀察盒中從一端來回移動(dòng)到另一端的來回移動(dòng)的次數(shù)，每次移動(dòng)的距離在35cm。各組記錄到的上述指標(biāo)與純脂質(zhì)體對(duì)照組間的差異，用配對(duì)t檢驗(yàn)分析其統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3.2結(jié)果通過實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果表明，當(dāng)小鼠給予反義核酸后，能有效阻止小鼠近日鐘基因per1，per2，per3，或clock的表達(dá)，從而阻斷精神興奮劑——可卡因引起的興奮作用。因此，當(dāng)可卡因作用于給予反義核酸的小鼠時(shí)，小鼠的活動(dòng)度較純脂質(zhì)體組小鼠的活動(dòng)度小得多，見表3。
表3用反義核酸阻止小鼠近日鐘基因表達(dá)后對(duì)可卡因所致小鼠活動(dòng)性的影響(x±s)

*P＜0.05與純脂質(zhì)體組小鼠相應(yīng)的活動(dòng)性指標(biāo)比較。
3.3結(jié)論表3中小鼠的活動(dòng)性參數(shù)站立運(yùn)動(dòng)和來回移動(dòng)的頻率，在未阻斷近日鐘基因表達(dá)的小鼠明顯比阻斷近日鐘基因表達(dá)高，即可卡因能引起小鼠興奮性增加，當(dāng)近日鐘基因表達(dá)被阻斷后，這種可卡因的興奮作用被打斷。因此，用反義核酸阻斷近日鐘基因表達(dá)時(shí)可有效地阻斷精神興奮劑——可卡因等對(duì)中樞神經(jīng)的作用。
4.使用反義核酸治療小鼠對(duì)毒品的精神依賴。
4.1方法采用條件性位置偏愛試實(shí)驗(yàn)研究小鼠在受到有依賴潛能的藥物或毒品作用時(shí)，發(fā)生的行為效應(yīng)。對(duì)于能引起的效應(yīng)的刺激來說，根據(jù)受試者表現(xiàn)出接近或遠(yuǎn)離反應(yīng)而將其分為獎(jiǎng)賞性刺激與懲罰性刺激兩種。根據(jù)巴甫洛夫的條件反射學(xué)說，如果把獎(jiǎng)賞罰刺激與某個(gè)特定的非獎(jiǎng)賞性中性刺激(例如，某特定環(huán)境)反復(fù)相聯(lián)系之后，在不給藥的情況下動(dòng)物依舊在曾給藥的環(huán)境中停留較長(zhǎng)時(shí)間。這種時(shí)間的增加是由于那個(gè)特定環(huán)境能夠吸引動(dòng)物，具有條件性強(qiáng)化作用而造成的，條件性位置偏愛效應(yīng)就是因此而建立的。
條件性位置偏愛效應(yīng)實(shí)驗(yàn)選用的實(shí)驗(yàn)箱是隔音箱，中間隔由隔板將其一分為二，一側(cè)是黑盒，一側(cè)為白盒。白盒底部是由微動(dòng)開關(guān)組成，它與電池和電子鐘形成串聯(lián)，當(dāng)小鼠進(jìn)入白盒時(shí)重量增加使微動(dòng)開關(guān)接通電池的電源通過導(dǎo)線與電子鐘接通，電子鐘啟動(dòng)開始記時(shí)，當(dāng)動(dòng)物離開白盒，開關(guān)斷開，則電子鐘電源被切斷，電子鐘停止這樣反復(fù)，電子鐘將小鼠在白盒中停留的時(shí)間準(zhǔn)確的記錄下來。
選用BALB/C小鼠340只，隨時(shí)機(jī)分為34組，第一、二組給予純脂質(zhì)體，并第一組給予嗎啡，第二組給予可卡因；第三～第十八組分別給予反義DNA，反義RNA，RNA核酶，DNA核酶，如圖5所示，將作為嗎啡藥物作用組；第十九～第三十四組分別給予反義DNA，反義RNA，RNA核酶，DNA核酶，將作為可卡因作用組。
條件性位置偏愛實(shí)驗(yàn)分成三個(gè)階段預(yù)測(cè)試階段，訓(xùn)練階段和測(cè)試階段。
預(yù)測(cè)試階段將偏愛盒中間隔板打開，將小鼠放入中間地帶，讓其在偏愛盒中自由15分鐘，每天一次，連續(xù)3天，第四天記錄各種小鼠在白盒和黑盒的平均停留時(shí)間，確定小鼠的天然偏愛傾向。
訓(xùn)練階段將偏愛實(shí)驗(yàn)盒隔板封閉，形成黑白二盒，對(duì)照組動(dòng)物連續(xù)6天皮下注射生理鹽水，隔天放入伴藥盒(白盒)或黑盒。嗎啡組和可卡因組動(dòng)物隔天皮下注射相應(yīng)的嗎啡50mg/kg或可卡因30mg/kg，放入伴藥盒，另一天皮下注射生理鹽水放入另一側(cè)，動(dòng)物每次在盒中停留時(shí)間是1/2小時(shí)。
測(cè)試階段在訓(xùn)練完成后的第二天進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試前將隔板打開，使大鼠能夠在黑白盒內(nèi)自由移動(dòng)，記錄動(dòng)物不給藥狀態(tài)下在白盒內(nèi)的停留時(shí)間，記錄時(shí)間15分鐘。
4.2結(jié)果通過測(cè)試結(jié)果發(fā)現(xiàn)給予反義核酸的處理的小鼠對(duì)于偏愛停留時(shí)間明顯較給予純脂質(zhì)體組的動(dòng)物的時(shí)間短，見表4。
表4反義核酸對(duì)小鼠的嗎啡、可卡因精神依賴反應(yīng)的影響(x±s)

*P＜0.05與純脂質(zhì)體的相應(yīng)值比較；#P＜0.05與本組給藥前的值比較。表中的數(shù)值表示實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在條件性位置偏愛盒——伴藥盒(白盒)中停留的時(shí)間，以15分鐘內(nèi)在白盒中停留時(shí)間，以秒表示。表中前為給毒品前所觀察到的小鼠偏愛停留時(shí)間，后為給予毒品后的結(jié)果。
4.3結(jié)論從表4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用反義核酸阻斷小鼠近日鐘基因per1，per2，per3，和clock任意一基因表達(dá)后，能有效地阻斷阿片類(如海洛因、嗎啡、鴉片等)和精神興奮劑(可卡因、安非他明等)成癮藥物或毒品所引起的精神依賴性。
結(jié)論通過研究、上述實(shí)驗(yàn)說明，采用本發(fā)明的反義核酸對(duì)人體的近日節(jié)律基因per1，per2，per3，clock作用，使其任意一個(gè)基因功能發(fā)生改變時(shí)，能達(dá)到有效戒毒。<110>四川大學(xué)王正榮<120>戒毒的反義核酸<160>16<210>1<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>針對(duì)per1基因的反義DNA<400>1cactcaggaggctgtaggacaatgga<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>針對(duì)per2基因的反義DNA<400>2gtggacatgagcagtggctccag<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>針對(duì)per3基因的反義DNA<400>3atggttgtccaagaaatgaaaaa<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>針對(duì)clock基因的反義DNA<400>4cactgcacagtcagatgctagtga<210>5<211>26<212>RNA<213>人工序列<220><223>針對(duì)per1基因的反義RNA<400>5uccauugccuacagccuccugagugc<210>6<211>23<212>RNA<213>人工序列<220><223>針對(duì)per2基因的反義RNA<400>6cuggagccacugcucauguccac<210>7<211>22<212>RNA<213>人工序列<220><223>針對(duì)per3基因的反義RNA<400>7uuuucauuucuuggacaaccau<210>8<211>24<212>RNA<213>人工序列<220><223>針對(duì)clock基因的反義RNA<400>8ucacuagcaucugacugugcagug<210>9<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>針對(duì)per1基因的DNA核酶<400>9tggactcaggctagctaacaacgatgccactt<210>10<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>針對(duì)per2基因的DNA核酶<400>10tgctcaggctagctacaacgagtccac<210>11<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>針對(duì)per3基因的DNA核酶<400>11tcttggaggctagctacaacgaaaccat<210>12<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>針對(duì)clock基因的DNA核酶<400>12ctcttcaggctagctacaacgatactaagg<210>13<211>40<212>RNA<213>人工序列<220><223>針對(duì)per1基因的RNA核酶<400>13cucccagaugcugaugagucgugagacgaaacgauggugg<210>14<211>35<212>RNA<213>人工序列<220><223>針對(duì)per2基因的RNA核酶<400>14ucccucugaugagacggugacgucgaaacuuugug<210>15<211>39<212>RNA<213>人工序列<220><223>針對(duì)per3基因的RNA核酶<400>15cauuucuugcugaugagcaggugacugcgaaacaaccau<210>16<211>39<212>RNA<213>人工序列<220><223>針對(duì)clock基因的RNA核酶<400>16uagcaucucugaugagucgugagacgaaacugugcagug
權(quán)利要求
1.一種戒毒的反義核酸，其特征在于反義核酸的全部序列或部分序列與人類近日鐘基因per1、per2、per3、clock的有義鏈、無義鏈或mRNA中的至少一個(gè)的全部序列或部分序列相同，或者反義核酸的全部序列或部分序列與人類近日鐘基因per1、per2、per3、clock的有義鏈、無義鏈或mRNA中的至少一個(gè)的全部序列或部分序列互補(bǔ)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的戒毒的反義核酸，其特征在于所說的反義核酸是在反義核酸上加入至少一個(gè)核苷酸、或者減少至少一個(gè)核苷酸、或者改變至少一個(gè)核苷酸，或者修飾化學(xué)基團(tuán)的結(jié)構(gòu)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的戒毒的反義核酸，其特征在于所說的化學(xué)基團(tuán)是主鏈、或堿基、或糖環(huán)，所說的結(jié)構(gòu)是一級(jí)結(jié)構(gòu)、或立體結(jié)構(gòu)、或構(gòu)象結(jié)構(gòu)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的戒毒的反義核酸，其特征在于所說的反義核酸是反義DNA、反義RNA、DNA核酶、RNA核酶中的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的戒毒的反義核酸，其特征在于所說的反義DNA是per1反義DNA、per2反義DNA、per3反義DNA、clock反義DNA中的一種，其序列分別為，per1反義DNA5’cactcaggaggctgtaggacaatgga 3’，per2反義DNA5’gtggacatgagcagtggctccag 3’，per3反義DNA5’atggttgtccaagaaatgaaaaa 3’，clock反義DNA5’cactgcacagtcagatgctagtga 3’。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的戒毒的反義核酸，其特征在于所說的反義RNA是per1反義RNA、per2反義RNA、per3反義RNA、clock反義RNA中的一種，其序列分別為；per1反義RNA5’uccauugccuacagccuccugagugc 3’，per2反義RNA5’cuggagccacugcucauguccac 3’，per3反義RNA5’uuuucauuucuuggacaaccau 3’，clock反義RNA5’ucacuagcaucugacugugcagug 3’。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的戒毒的反義核酸，其特征在于所說的DNA核酶是per1DNA核酶、per2DNA核酶、per3DNA核酶、clock DNA核酶中的一種，其序列分別為，per1DNA核酶5’tggactcaggctagctaacaacgatgccactt 3’，per2DNA核酶5’tgctcaggctagctacaacgagtccac 3’，per3DNA核酶5’tcttggaggctagctacaacgaaaccat 3’，clock DNA核酶5′ctcttcaggctagctacaacgatactaagg 3′，。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的戒毒的反義核酸，其特征在于所說的RNA核酶是per1RNA核酶、per2RNA核酶、per3RNA核酶、clock RNA核酶中的一種，其序列分別為，per1RNA核酶5’cucccagaugcugaugagucgugagacgaaacgauggugg 3’，per2RNA核酶5’ucccucugaugagacggugacgucgaaacuuugug 3’，per3RNA核酶5’cauuucuugcugaugagcaggugacugcgaaacaaccau 3’，clock RNA核酶5′uagcaucucugaugagucgugagacgaaacugugcagug 3′，。
全文摘要
本發(fā)明的戒毒的反義核酸，涉及醫(yī)學(xué)，特別是應(yīng)用基因技術(shù)對(duì)藥物或毒品成癮的脫毒藥物。旨在解決已有化學(xué)戒毒藥的依賴性、中毒、副作用問題和復(fù)吸問題。本反義核酸的全部序列或部分序列與人類近日鐘基因per
文檔編號(hào)A61P25/00GK1445235SQ02113469
公開日2003年10月1日 申請(qǐng)日期2002年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月18日
發(fā)明者王正榮 申請(qǐng)人:四川大學(xué), 王正榮