專利名稱：一種多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸復(fù)合物及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體為一種抗癌藥物復(fù)合物，尤其是一種多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復(fù)合物及制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
癌癥是嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病之一，有效地治療癌癥一直是世界矚目的研究課題。反義核酸技術(shù)是近年發(fā)展的一種基因治療腫瘤的有效方法，它以腫瘤發(fā)生相關(guān)基因?yàn)榘悬c(diǎn)，通過人工合成的反義寡核苷酸與之特異性互補(bǔ)結(jié)合，抑制靶向基因的表達(dá)而導(dǎo) 致腫瘤細(xì)胞凋亡，具有高選擇性、高效率、低毒性等特點(diǎn)。但是由于單純的反義寡聚核苷酸很難進(jìn)入腫瘤細(xì)胞或被降解而達(dá)不到治療效果。研究表明通過選擇合適的藥物載體輸送，可大大提高治療惡性腫瘤的效果。因此，發(fā)展高效安全的基因載體系統(tǒng)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有重要意義。納米級羥基磷灰石具有良好的生物相容性，生物降解性和生物可吸收性并且無毒副作用，是發(fā)展新一代高效高性能藥物前提，為治療癌癥這一人類重大疾病提供重要的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。近年來納米磷酸鈣的制備方法主要包括水熱合成法、溶膠凝膠法、化學(xué)沉淀法和微乳法等，其中，微乳法的微乳液結(jié)構(gòu)限制了顆粒的大小，使納米微粒的制備成為可能。納米微粒的制備通常是將兩種確定的微乳體系通過混合實(shí)現(xiàn)的。含有反應(yīng)物A，B的兩個(gè)微乳液經(jīng)過混合、相互的碰撞或聚結(jié)、反應(yīng)成核和生長等形成納米微粒。當(dāng)水核內(nèi)的微粒長到最后尺寸，表面活性劑分子將附著在微粒的表面，使微粒穩(wěn)定并防止其進(jìn)一步長大，最終形成的微粒粒徑受到形成的水核大小調(diào)控，控制其達(dá)到合適的尺寸。多孔的磷酸鈣納米粒子在藥物載體上的應(yīng)用具有如下優(yōu)點(diǎn)1)磷酸鈣納米粒子具有良好的生物相容性，對生物體系的毒性??；2)制備的磷酸鈣納米粒子具有有序的孔道，因而具有較大的比表面積，為藥物、蛋白質(zhì)、DNA及核酸等提供了更多的負(fù)載空間，大大提聞負(fù)載量；生存素(survivin)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種凋亡抑制蛋白(IAP)，它主要抑制凋亡中主要的效應(yīng)蛋白酶caspase3和caspase7來介導(dǎo)凋亡的抑制。在多數(shù)惡性腫瘤組織中表達(dá)豐富，但在相應(yīng)正常組織中不表達(dá)，這種選擇性表達(dá)特性使其成為目前惡性腫瘤診斷和治療的新靶點(diǎn)。而針對生存素(survivin)基因作為藥物治療靶點(diǎn)，負(fù)載其反義寡聚核苷酸的多孔磷酸鈣納米粒子藥物復(fù)合物未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，在于提供一種多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復(fù)合物及其制備方法。本發(fā)明的另一目的，在于將上述多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復(fù)合物用于制備治療宮頸癌的藥物。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)解決方案是ー種多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸復(fù)合物，含有生存素反義寡聚核苷酸或者帶熒光標(biāo)記生存素反義寡聚核苷酸，粒徑為30 60nm。ー種多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復(fù)合物的制備，其特征在于包括以下步驟(I)將微乳液I和微乳液II以2000 4000rpm速度攪拌3 7min ;兩者體積比為 I : O. 8 I : I. 2 ;微乳液I以こニ醇丁醚和環(huán)己烷的混合物為溶劑，含有O. 3 O. 5μ g/mL生存素 ASODNs 或 6’-fam-生存素 AS0DNs、l 3mmol/L Na2HPO4 和 O. I O. 25mmol/L 硅酸鈉；こニ醇丁醚與環(huán)己烷體積比為I : 2 I : 4 ;制備方法為，將含有生存素ASODNs或6’-fam-生存素ASODNs、Na2HPO4、成核劑硅酸鈉的水溶液與こニ醇丁醚、環(huán)己烷混合均勻；微乳液II以こニ醇丁醚和環(huán)己烷的混合物為溶劑，含有氯化鈣；微乳液II中氯化鈣含量為2 4mmol/L;こニ醇丁醚與環(huán)己烷體積比為I : 2 I : 4;制備方法為，將氯化鈣水溶液與こニ醇丁醚和環(huán)己烷混合均勻；Na2HPO4與氯化鈣的摩爾比為I : I I : 2 ;生存素ASODNs或6’ -fam-生存素ASODNs與氯化鈣的用量比為150 200 μ g/mmol。(2)繼續(xù)反應(yīng)2 3min，加入分散劑檸檬酸鈉繼續(xù)反應(yīng)10 12min ;檸檬酸在總反應(yīng)體系中含量為O. 005 O. 01mmol/L ；(3)離心取沉淀洗滌。通過上述反相微乳法制備得到的多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復(fù)合物，可介導(dǎo)反義寡聚核苷酸進(jìn)入細(xì)胞，具有較高的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率，尤其是體外Hela宮頸癌細(xì)胞。顯著提高反義核酸促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡效率，增強(qiáng)其抗腫瘤活性，可用于制備抗腫瘤藥物，尤其是治療宮頸癌的藥物。采用上述技術(shù)方案后，本發(fā)明的多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復(fù)合物的制備及應(yīng)用具有以下優(yōu)點(diǎn)I、制備方法簡單、快速，可靠；2、該復(fù)合物具有轉(zhuǎn)染率高、靶向性強(qiáng)，抑制腫瘤細(xì)胞效果明顯；3、對不同的生物體系以多孔磷酸鈣納米粒子為載體輸送不同的靶向性生物分子或藥物為其它腫瘤或疾病的治療提供了一條新途徑。


圖I為多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡糖核苷酸藥物復(fù)合物的 Μ圖，插圖為局部放大的納米粒子。圖2為多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復(fù)合物隨時(shí)間的溶解緩釋響應(yīng)。圖3帶有FAM熒光素標(biāo)記的多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復(fù)合物和Hela細(xì)胞孵育4小時(shí)后流式細(xì)胞儀測定其轉(zhuǎn)染率圖，未處理的Hela細(xì)胞作為對照。圖4為采用噻唑藍(lán)法分別檢測多孔磷酸鈣納米粒子、裸露的反義寡聚核苷酸、多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復(fù)合物對Hela細(xì)胞孵育不同時(shí)間(24、48、72小時(shí))后的細(xì)胞抑制率示意圖，未處理的Hela細(xì)胞作為對照(圖中柱狀圖從左至右依次為未處理的Hela細(xì)胞、裸露的反義寡聚核苷酸、多孔磷酸鈣納米粒子和多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復(fù)合物)。圖5為多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復(fù)合物孵育4小時(shí)的HeLa細(xì)胞生物TEM圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例及其附圖對本發(fā)明作更進(jìn)ー步說明。實(shí)施例I本發(fā)明的多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復(fù)合物的制備，其特征在于包括以下步驟a、將預(yù)先配制的 50 μ L 120 μ g/mL ASODNs 或 6’ -fam-ASODNs 溶液，650 μ L0. 03mol/L Na2HPO4溶液(含0. 004mol/L硅酸鈉作為成核劑)，4mLこニ醇丁醚和IOmL環(huán)己燒混合均勻制成微乳液I,同時(shí)將650 μ L O. 05mol/L CaCl2,4mLこニ醇丁醚和IOmL環(huán)己烷混合均勻制成微乳液II ；b、在室溫條件下，將兩種微乳液在機(jī)械攪拌條件下強(qiáng)力攪拌5分鐘使微乳液達(dá)到平衡后，進(jìn)行快速混合形成微乳混合液。2-3分鐘反應(yīng)后，加入225 μ L0. OOlmol/L檸檬酸鈉作為分散劑繼續(xù)進(jìn)行反應(yīng)10-12分鐘；C、反應(yīng)完成后將微乳混合液轉(zhuǎn)至50mL離心管中在離心機(jī)轉(zhuǎn)速14000rpm下離心15分鐘。離心后，移去離心管中的上清液，將沉淀物用95%こ醇洗滌兩次除去有機(jī)殘液后再用pH7. 4PBS洗滌兩次以除去剰余的こ醇?xì)堃海籨、最后將沉淀物用25mL PBS溶解定容后即可得到分散的反義寡聚核苷酸-多孔磷酸鈣納米粒子(ASODNs-CP)溶液；圖I為本發(fā)明實(shí)施例的多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復(fù)合物的透射電鏡圖，從電鏡圖來看，其粒徑為30 60nm。產(chǎn)品隨時(shí)間的溶解緩釋響應(yīng)如圖2所示。
本發(fā)明采用反相微乳法制備多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸，構(gòu)建成ー種新型多孔磷酸鈣納米粒子反義寡聚核苷酸復(fù)合體。該復(fù)合體作用于體外培養(yǎng)的Hela宮頸癌細(xì)胞，可有效地介導(dǎo)反義核酸進(jìn)入細(xì)胞，具有較高的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率，并且顯著提高反義核酸促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡效率，增強(qiáng)其抗腫瘤活性。實(shí)施例2多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復(fù)合物的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率的測定用帶有FAM熒光素標(biāo)記的反義寡聚核苷酸取代單純的反義寡聚核苷酸制備多孔磷酸鈣納米粒子反義核酸復(fù)合體來考察該藥物復(fù)合物的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率。將帶有FAM熒光素標(biāo)記的多孔磷酸鈣納米粒子反義核酸復(fù)合體加入到對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞中，在37°C 5%CO2飽和溫度下培養(yǎng)4小吋。取未經(jīng)任何處理的對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，作為陰性對照。胰酶消化后，用70%的こ醇固定。用流式細(xì)胞儀檢測它們的轉(zhuǎn)染率，結(jié)果如圖3。該復(fù)合藥物的轉(zhuǎn)染率可以達(dá)到98%以上，說明多孔磷酸鈣納米粒子可以作為一種很好的藥物載體應(yīng)用于生物領(lǐng)域。Hela宮頸癌細(xì)胞的培養(yǎng)
Hela宮頸癌細(xì)胞株購買自中科院細(xì)胞庫。Hela細(xì)胞在含10%小牛血清的MEM培養(yǎng)基，37°C 5% C02飽和溫度下培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)選用對數(shù)生長期細(xì)胞。細(xì)胞抑制率的測定將多孔磷酸鈣納米粒子(CP)，裸露的反義寡聚核苷酸(naked ASODNs)和多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸(CP-ASODNs)分別加入到對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞中，在370C 5% CO2飽和溫度下培養(yǎng)24h。取未經(jīng)任何處理的對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，作為陰性對照，通過噻唑藍(lán)法(MTT)檢測細(xì)胞的抑制率。結(jié)果如圖4所示，與裸露的反義寡聚核苷酸相比，多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復(fù)合物可明顯提高反義寡聚核苷酸的抑制腫瘤細(xì)胞的效率。裸露的反義寡聚核苷酸的腫瘤細(xì)胞抑制率為5%，而多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復(fù)合物的腫瘤細(xì)胞抑制率達(dá)到22%。實(shí)施例3多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復(fù)合物的應(yīng)用除在37°C 5% CO2飽和溫度下培養(yǎng)48h，其余同實(shí)施例2，結(jié)果如圖4。裸露的反義寡聚核苷酸的腫瘤細(xì)胞抑制率為7%，多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復(fù)合物的腫瘤細(xì)胞抑制率達(dá)到40%。實(shí)施例4除在37°C 5% CO2飽和溫度下培養(yǎng)72h，其余同實(shí)施例2，結(jié)果如圖4。裸露的反義寡聚核苷酸對腫瘤細(xì)胞的抑制率為9 %，多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸藥物復(fù)合物的腫瘤細(xì)胞抑制率達(dá)到50%。實(shí)施例5多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸在HeLa細(xì)胞中實(shí)際分布情況。對反義寡聚核苷酸-磷酸鈣納米粒子在HeLa細(xì)胞中實(shí)際分布情況亦可用生物電鏡(Biological TEM)進(jìn)行檢測，用反義寡聚核苷酸-磷酸I丐納米粒子(fam-ASODNs-CP)的轉(zhuǎn)染液對HeLa細(xì)胞進(jìn)行孵育4小時(shí)后，經(jīng)胰蛋白酶消化及生物切片固定后，切片進(jìn)行檢測。黑色箭頭指向的就是合成的ASODNs-CP納米粒子，圖5中亦可以清晰地看出納米粒子可以通過細(xì)胞的內(nèi)吞作用轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，而且部分可以到達(dá)細(xì)胞核的周圍，這是由于反義寡聚核酸對細(xì)胞核的靶向作用，透射電鏡圖表征結(jié)果證實(shí)了制備的ASODNs-CP納米粒子可以轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，部分可到達(dá)細(xì)胞核周圍。以上實(shí)施例僅供說明本發(fā)明之用，而非對本發(fā)明的限制，有關(guān)技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，還可以作出各種變換或變化。因此，所有等同的技術(shù)方案也應(yīng)該屬于本發(fā)明的范疇，應(yīng)由各權(quán)利要求限定。權(quán)利要求
1.一種多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸復(fù)合物，其特征在于，以多孔磷酸鈣納米粒子為載體，負(fù)載生存素反義寡聚核苷酸或者帶熒光標(biāo)記生存素反義寡聚核苷酸，粒徑為 30 60nm。
2.權(quán)利要求I所述多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸復(fù)合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)將微乳液I和微乳液II以2000 4000rpm速度攪拌3 7min； 微乳液I以乙二醇丁醚和環(huán)己烷的混合物為溶劑，含有O. 3 O. 5μ g/mL生存素ASODNs 或 6，-fam-生存素 ASODNsU 3mmol/L Na2HPO4 和 O. I O. 25mmol/L 硅酸鈉；乙二醇丁醚與環(huán)己烷體積比為I : 2 I : 4; 微乳液II以乙二醇丁醚和環(huán)己烷的混合物為溶劑，含有氯化鈣；微乳液II中氯化鈣含量為2 4mmol/L ;乙二醇丁醚與環(huán)己烷體積比為I : 2 I : 4 ; Na2HPO4與氯化鈣的摩爾比為I : I I : 2 ;生存素ASODNs或6’-fam-生存素ASODNs與氯化鈣的用量比為150 200μ g/mmol。
(2)繼續(xù)反應(yīng)2 3min，加入分散劑檸檬酸鈉繼續(xù)反應(yīng)10 12min;檸檬酸在總反應(yīng)體系中含量為O. 005 O. 01mmol/L ； (3)離心取沉淀洗滌。
3.權(quán)利要求2所述多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸復(fù)合物的制備方法，其特征在于，步驟(I)中微乳液I與微乳液II體積比為I : O. 8 I : I. 2。
4.權(quán)利要求2所述多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸復(fù)合物的制備方法，其特征在于，步驟(I)中微乳液I制備方法為，將含有生存素ASODNs或6’ -fam-生存素ASODNs、Na2HPO4、成核劑硅酸鈉的水溶液與乙二醇丁醚、環(huán)己烷混合均勻。
5.權(quán)利要求2所述多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸復(fù)合物的制備方法，其特征在于，步驟(I)中微乳液II制備方法為，制備方法為，將氯化鈣水溶液與乙二醇丁醚和環(huán)己烷混合均勻。
6.權(quán)利要求I所述多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸復(fù)合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求I所述多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸復(fù)合物在制備治療宮頸癌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，公開了一種多孔磷酸鈣納米粒子-反義寡聚核苷酸復(fù)合物以多孔磷酸鈣納米粒子為載體，負(fù)載生存素反義寡聚核苷酸或者帶熒光標(biāo)記生存素反義寡聚核苷酸，粒徑為30～60nm。通過反相微乳法制備的上述復(fù)合物，可介導(dǎo)反義寡聚核苷酸進(jìn)入細(xì)胞，具有較高的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率，尤其是體外Hela宮頸癌細(xì)胞。顯著提高反義核酸促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡效率，增強(qiáng)其抗腫瘤活性，可用于制備抗腫瘤藥物，尤其是治療宮頸癌的藥物，制備方法簡單快速。
文檔編號A61K48/00GK102631686SQ201210114798
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月18日
發(fā)明者侯生磊, 賈能勤, 馬紅美 申請人:上海師范大學(xué)