一種小粒徑血紅蛋白/類(lèi)水滑石納米復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及一種小粒徑血紅蛋白/類(lèi)水滑石納米復(fù)合物；本發(fā)明還涉及所述納米 復(fù)合物的制備方法及其催化鄰苯二胺的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 蛋白質(zhì)與無(wú)機(jī)納米粒子的組裝在生物催化、生物醫(yī)學(xué)診斷和生物傳感器等領(lǐng)域具 有廣泛的基礎(chǔ)和應(yīng)用研宄價(jià)值。生物無(wú)機(jī)界面組裝涉及到范德華力、疏水親合作用、靜電相 互作用和氫鍵等作用。雖然無(wú)機(jī)納米粒子固定蛋白質(zhì)后會(huì)提高它們的性能，但被固定的蛋 白質(zhì)可能由于一些不合適的界面組裝條件而變性失活。為了使固定的蛋白質(zhì)保持其原有的 二級(jí)結(jié)構(gòu)和生物活性，尋找生物相容性好、活性位點(diǎn)多的無(wú)機(jī)納米材料顯得尤為重要。
[0003] 類(lèi)水滑石是一類(lèi)二維納米陰離子粘土，又叫層狀雙金屬氫氧化物（Layered Double Hydroxides, LDH)，組成通式可表不為[Μ^+Μ/νΟΗ)；^+(An0x/n · mH20,其中 M(OH)6 八面體共用棱而呈現(xiàn)開(kāi)放的片層堆積結(jié)構(gòu)，每個(gè)八面體單元由六配位的中心金屬離子M和 位于頂點(diǎn)的OH-形成，由于部分M2+被M 3+取代會(huì)使片層帶結(jié)構(gòu)正電荷，層間存在可交換 的陰離子使電荷達(dá)到平衡。與其他無(wú)機(jī)材料相比，類(lèi)水滑石不僅容易被人工合成，原料來(lái) 源非常豐富，而且具有表面積大、離子交換容量高、插層空間和電荷密度可調(diào)、生物相容性 好、熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性高等特點(diǎn)，是氨基酸、DNA、核苷單磷酸酯、多糖、蛋白質(zhì)、多肽和 酶等生物分子良好的綠色固定材料 [Liu C X，Hou W G, Li L F, Li F, Liu S J. Synthesis and characterization of 5-fluorocytosine intercalated Zn - Al layered double hydroxide. J. Solid State Chem., 2008, 181, 1792-1797.]。但研宄表明，類(lèi)水滑石上述性能 及應(yīng)用與其粒徑大小和粒徑分布范圍有著密切關(guān)系[Choy J-H，Kwak S-Y，Park J-S，Jeong Y-J, Portier J. Intercalative Nanohybrids of Nucleoside Monophosphates and DNA in Layered Metal Hydroxide. J. Am. Chem. Soc. , 1999, 121, 1399 - 1400.]，其中小粒徑均一分 散的類(lèi)水滑石納米粒子能更好地固定生物分子，并能保持其結(jié)構(gòu)和生物活性，提高其潛在 的應(yīng)用價(jià)值。
[0004] 傳統(tǒng)共沉淀法合成類(lèi)水滑石納米粒子時(shí)，可通過(guò)調(diào)節(jié)金屬離子濃度、過(guò)飽和度、滴 料方式等方法對(duì)成核過(guò)程施加影響。由于鹽和堿的混合通過(guò)攪拌方式實(shí)現(xiàn)，通?；旌虾懿?充分，反應(yīng)界面小，存在濃度梯度，反應(yīng)速度和擴(kuò)散速度慢，即先期形成晶核的生長(zhǎng)與后期 晶核的形成共存，導(dǎo)致產(chǎn)物的粒徑分布較大，難以控制粒徑大小，且有聚集現(xiàn)象。目前制備 單分散、尺寸可調(diào)的類(lèi)水滑石納米粒子的方法主要有：向晶化介質(zhì)中加入有機(jī)溶劑，改變 固-液界面張力，制備小粒徑納米粒子；采用微乳液反膠團(tuán)法，通過(guò)控制微乳反應(yīng)器的水核 半徑控制晶粒大小；采用成核和晶化過(guò)程分開(kāi)法制備粒徑分布范圍窄的類(lèi)水滑石納米顆 粒。但是這些方法要么增加了新的原料，要么步驟繁瑣，操作復(fù)雜，與綠色化學(xué)的要求仍有 很大距離。利用T-形微反應(yīng)器限域效應(yīng)和反應(yīng)物間快速充分混合的特性，便可以有效克服 傳統(tǒng)方法的不足，通過(guò)簡(jiǎn)便的實(shí)驗(yàn)操作，得到粒徑分布范圍窄，顆粒較小，分散性好納米粒 子[Ying Y, Chen G W, Zhao Y C, et al. A high throughput methodology for continuous preparation of monodispersed nanocrystals in microfludic reactors. Chem Eng J, 2008, 135:209-215. ] 〇
[0005] 生物分子模板誘導(dǎo)法是制備生物無(wú)機(jī)雜化物的常用方法之一。一般情況下，生物 分子首先與金屬陽(yáng)離子結(jié)合，形成蛋白質(zhì)-金屬離子配合物的形式，金屬離子在生物分子 上作為成核位點(diǎn)，在生物分子誘導(dǎo)和模板作用下與陰離子反應(yīng)生成生物分子-無(wú)機(jī)納米雜 化物。如Ge Jun等以牛血清蛋白為誘導(dǎo)分子，先通過(guò)蛋白分子中的氨基與Cu2+形成配位 鍵，所得配合物作為無(wú)機(jī)納米初晶成核的位點(diǎn)，在生物分子誘導(dǎo)下，磷酸根慢慢與Cu 2+結(jié)合 生長(zhǎng)成了生物分子納米初晶的聚集體，聚集體表面的磷酸銅初晶在生物分子的誘導(dǎo)下可控 生長(zhǎng)，形成了單獨(dú)的花瓣，最后生物分子誘導(dǎo)小花瓣形成了花瓣分支，同時(shí)它作為分子膠將 這些花辦連接起來(lái)[Ge J, Lei J, Zare R N. Protein - inorganic hybrid nanoflowers. Nature Nanotechnology. 2012, 7(7) :428-432.]。所得生物酶-無(wú)機(jī)納米復(fù)合粒子的生物 催化活性得到了明顯提高。因此，生物分子模板誘導(dǎo)法制備有機(jī)無(wú)機(jī)納米粒子具有粒徑和 形貌可控、比表面積大、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)。但目前還未見(jiàn)以氧化還原蛋白質(zhì)為生物分子 模板，采用T型微反應(yīng)器共沉淀法制備小粒徑蛋白質(zhì)/類(lèi)水滑石納米復(fù)合物及其生物催化 方面的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0006] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足以及本領(lǐng)域研宄和應(yīng)用的需求，本發(fā)明的目的是提供一種小 粒徑血紅蛋白/類(lèi)水滑石納米復(fù)合物及其制備方法和催化鄰苯二胺的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明所提供的一種小粒徑血紅蛋白/類(lèi)水滑石納米復(fù)合物，是以血紅蛋白為生 物分子模板，以二價(jià)金屬鹽Mg (NO3)2和三價(jià)金屬鹽Al (NO3)3混合溶液為金屬離子來(lái)源，以氫 氧化鈉溶液為堿源，在血紅蛋白模板分子誘導(dǎo)下，采用T型微反應(yīng)器共沉淀法制得的，其制 備方法如下：
[0008] 分別稱(chēng)取MgCl2 · 6H20和AlCl3 · 9H20,加入去離子水，配制總金屬離子濃度為5~ 50mmol/L的MgCljP AlCl 3混合鹽溶液，向其中加入一定量的血紅蛋白，混合均勻后記為溶 液A ;配制一定濃度的氫氧化鈉溶液，記為溶液B ;打開(kāi)T型微反應(yīng)器，將溶液A、溶液B分別 加入T型微反應(yīng)器的鹽液管和堿液管中，控制流速，保持反應(yīng)混合液的pH在9. 0左右，在 混合液出口處接收反應(yīng)產(chǎn)物；反應(yīng)混合液在N2保護(hù)條件下，低溫?cái)嚢?4h，結(jié)束后將混合液 12000rpm下離心10min，超純水將沉淀洗滌3次，得血紅蛋白/類(lèi)水滑石納米復(fù)合物膠狀 物。
[0009] 其制備方法中所述的MgCldP AlCl 3混合鹽溶液中MgCl 2和AlCl 3的摩爾比為3 : 1 ;血紅蛋白加入量控制在使其濃度為0. 2g/L ;配制的氫氧化鈉溶液濃度為0. 02mol/L ;所 述T形微反應(yīng)器的微通道尺寸分別為寬0· 3mm，高0· 2mm，長(zhǎng)20mm，流速為10mL/min ;低溫是 指0~10 °C的冰鹽浴條件。
[0010] 所述的一種小粒徑血紅蛋白/類(lèi)水滑石納米復(fù)合物，其形貌呈海綿狀和不定型的 小顆粒狀，具有大的比表面積；平均粒徑小于40nm，厚度小于5nm ;Zeta電位在+16mV到 +30mV之間。
[0011] 所述的一種小粒徑血紅蛋白/類(lèi)水滑石納米復(fù)合物，血紅蛋白分子均勻地吸附在 類(lèi)水滑石粒子表面，并保持了蛋白質(zhì)原有的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
[0012] 所述的小粒徑血紅蛋白/類(lèi)水滑石納米復(fù)合物催化鄰苯二胺的應(yīng)用，特別是高溫 條件下催化鄰苯二胺的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明以血紅蛋白為生物分子模板，以二價(jià)金屬鹽Mg(NO3)2和三價(jià)金屬鹽 Al (NO3) 3混合溶液為金屬離子來(lái)源，以氫氧化鈉溶液為堿源，在血紅蛋白模板分子誘導(dǎo)下， 采用T型微反應(yīng)器共沉淀法制備了一種小粒徑血紅蛋白/類(lèi)水滑石納米復(fù)合物，本發(fā)明與 現(xiàn)有技術(shù)相比，主要的有益效果和優(yōu)點(diǎn)在于：
[0014] 1)本發(fā)明所述的血紅蛋白模板分子誘導(dǎo)下，T型微反應(yīng)器共沉淀制備小粒徑血紅 蛋白/類(lèi)水滑石納米復(fù)合物的方法，具有粒徑小、粒徑分布范圍窄、比表面積