游離 血紅蛋白（Hb)和血紅素（hemin)分別在25°C (圖3A)和90°C (圖3B)時的熒光發(fā)射光譜 圖。圖3A顯示，T型微反應(yīng)共沉淀法將血紅蛋白固定在類水滑石上，雜化物中血紅蛋白在 25°C時熒光發(fā)射光譜最大波長（λ_)基本穩(wěn)定，與游離血紅蛋白的λ_同處在330nm左 右，但是其熒光強(qiáng)度都比游離血紅蛋白的大，且隨著金屬離子的增加而減弱，表明血紅蛋白 固定后其折疊的肽鏈有一定展開，當(dāng)金屬離子濃度增大時，類水滑石晶形和有序度升高，血 紅蛋白與類水滑石作用力減小，肽鏈展開程度變小，所以其熒光強(qiáng)度變?nèi)酢Ｈ欢鴪D3B顯示， 90°C處理后，Hb-LDH雜化物上的熒光強(qiáng)度隨金屬離子的增加而增強(qiáng)，熒光λ max也隨著金屬 鹽濃度的增大從330nm紅移到了 337nm，這表明經(jīng)高溫處理后肽鏈展開程度變大，更大程度 顯露在親水環(huán)境中，致使其熒光λ _發(fā)生了紅移，但是金屬離子濃度較低時由于血紅蛋白 與類水滑石作用力較強(qiáng)，加熱處理過程中血紅蛋白受到了較好的保護(hù)，肽鏈變化反而較小， 表現(xiàn)出了較弱的熒光強(qiáng)度；相反金屬離子濃度較高時由于血紅蛋白與類水滑石作用力較 弱，加熱處理過程中類水滑石對血紅蛋白的保護(hù)較弱，肽鏈變化反而較大，表現(xiàn)出了較強(qiáng)的 熒光強(qiáng)度。
[0036] 圖4為實(shí)施例1~4所得小粒徑血紅蛋白/類水滑石納米復(fù)合物（a~d)、對比例 1所得血紅蛋白/類水滑石納米復(fù)合物（e)的SEM圖片和實(shí)施例4所得小粒徑血紅蛋白/類 水滑石納米復(fù)合物透射電鏡圖片（f)。可以看出，當(dāng)金屬離子濃度較低時，得到的血紅蛋白 /類水滑石納米粒子通過生物分子膠連接在一起呈海綿狀，當(dāng)金屬離子濃度大于24mmol/L 時，復(fù)合納米粒呈顆粒狀，但它們的粒徑都小于40nm。Hb-LDHT48的TEM顯示，復(fù)合物中類水 滑石納米片呈隨機(jī)排列，與血紅蛋白分子互相嵌插，類水滑石納米片均勻地分散在復(fù)合物 中，其平均厚度小于5nm。
[0037] 實(shí)施例5應(yīng)用效果試驗(yàn)例
[0038] 試驗(yàn)對象：實(shí)施例1-4和對比例1制得的產(chǎn)品，游離血紅蛋白；
[0039] 試驗(yàn)?zāi)康模嚎疾毂景l(fā)明實(shí)施例1-4制得的產(chǎn)品和游離血紅蛋白催化鄰苯二胺的效 果。
[0040] 試驗(yàn)分組：
[0041] 試驗(yàn)1組：實(shí)施例1制得的產(chǎn)品Hb-LDHre;
[0042] 試驗(yàn)2組：實(shí)施例2制得的產(chǎn)品Hb-LDHT12;
[0043] 試驗(yàn)3組：實(shí)施例3制得的產(chǎn)品Hb-LDHm;
[0044] 試驗(yàn)4組：實(shí)施例4制得的產(chǎn)品Hb-LDHw8;
[0045] 對比試驗(yàn)組1 :對比例1制得的產(chǎn)品Hb-LDHc48;
[0046] 對比試驗(yàn)組2 :游離Hb。
[0047] 試驗(yàn)方法：
[0048] 25mL pH = 7的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，在一定溫度下攪拌20min，加入本發(fā) 明試驗(yàn)對象，使其中所含血紅蛋白為I. 〇mg，在90°C溫度條件下進(jìn)行攪拌lOmin，加入77 μ L 濃度為30%的過氧化氫溶液，測定不同反應(yīng)時間溶液在426nm(生成物2, 3-二氨基吩嗪） 處的紫外吸光度。
[0049] 血紅蛋白的轉(zhuǎn)化常數(shù)（Keat):在單位時間內(nèi)每一活性中心或每分子血紅蛋白所能 轉(zhuǎn)換的底物分子數(shù)。本實(shí)驗(yàn)中采用10分鐘內(nèi)的血紅蛋白的轉(zhuǎn)化數(shù)來衡量血紅蛋白的活性。
[0050] 酶活保持率:樣品在某個條件下的活性與Hb在25°C下pH = 7緩沖溶液中 的活性比值。
[0051] 試驗(yàn)結(jié)果：
[0052] 表1 :Hb與Hb-LDH雜化物在90°C水相中對鄰苯二胺的催化活性
[0054] 小結(jié)：通過表2的試驗(yàn)結(jié)果可以看出：
[0055] Hb_LDHT納米雜化物在90 °C反應(yīng)10分鐘后，酶活保持率逐漸降低，但均 遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于游離酶（7.28% );同樣它們的酶活保持率也均優(yōu)于傳統(tǒng)共沉淀法制得的 Hb-LDHc48(21. 44% )。這些結(jié)果表明：血紅蛋白通過T型微反應(yīng)器共沉淀法組裝到類水滑 石無機(jī)納米片上，高溫處理時類水滑石納米片對血紅蛋白起到很好的保護(hù)作用。我們認(rèn)為： 采用T型微反應(yīng)器制備的Hb-LDH雜化物具有粒徑分布范圍窄、分散性高、類水滑石納米片 薄等特點(diǎn)是根本原因。而隨著金屬鹽濃度的逐漸增大，Hb_LDH T納米雜化物高溫時的酶活和 轉(zhuǎn)化常數(shù)Keat都呈下降趨勢，這主要因?yàn)榻饘冫}濃度較低時得到的Hb-LDH 米雜化物呈無 定型或海綿狀，類水滑石基本處于初晶狀態(tài)，與血紅蛋白相互作用力強(qiáng)，保護(hù)作用明顯，加 熱時不容易破壞。而隨著金屬鹽濃度的增加，類水滑石晶粒逐漸變大，與血紅蛋白相互作用 力變?nèi)酰Ｗo(hù)作用削弱，加熱時容易破壞。這一現(xiàn)象同樣從與傳統(tǒng)共沉淀法制得的Hb-LDH w8 樣品的活性數(shù)據(jù)也能得到驗(yàn)證。因此，將生物酶固定在均勻分散的小粒徑層狀納米材料上， 可提1?酶的熱穩(wěn)定性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種小粒徑血紅蛋白/類水滑石納米復(fù)合物，其特征在于所述的血紅蛋白/類 水滑石納米復(fù)合物是以血紅蛋白為生物分子模板，以二價金屬鹽Mg(NO 3)2和三價金屬鹽 Al (NO3) 3混合溶液為金屬離子來源，以氫氧化鈉溶液為堿源，在血紅蛋白模板分子誘導(dǎo)下， 采用T型微反應(yīng)器共沉淀法制得的，其制備方法如下： 分別稱取MgCl2 ? 6H20和AlCl3 ? 9H20,加入去離子水，配制總金屬離子濃度為5~ 50mmol/L的MgCljP AlCl 3混合鹽溶液，向其中加入一定量的血紅蛋白，混合均勻后記為溶 液A ;配制一定濃度的氫氧化鈉溶液，記為溶液B ;打開T型微反應(yīng)器，將溶液A、溶液B分別 加入T型微反應(yīng)器的鹽液管和堿液管中，控制流速，保持反應(yīng)混合液的pH在9. 0左右，在 混合液出口處接收反應(yīng)產(chǎn)物；反應(yīng)混合液在N2保護(hù)條件下，低溫?cái)嚢?4h，結(jié)束后將混合液 12000rpm下離心10min，超純水將沉淀洗滌3次，得血紅蛋白/類水滑石納米復(fù)合物膠狀 物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種小粒徑血紅蛋白/類水滑石納米復(fù)合物，其特征在于制 備方法中所述的MgCljP AlCl 3混合鹽溶液中MgCl 2和AlCl 3的摩爾比為3 :1 ;加入一定量 的血紅蛋白后，使其濃度為0. 2g/L ;配制的氫氧化鈉溶液濃度為0. 02mol/L ;所述T形微反 應(yīng)器的微通道尺寸分別為寬0. 3mm，高0. 2mm，長20mm，流速為10mL/min ;低溫是指0~10°C 的冰鹽浴條件。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種小粒徑血紅蛋白/類水滑石納米復(fù)合物，其特征在于 其形貌呈海綿狀和不定型的小顆粒狀，具有大的比表面積；平均粒徑小于40nm，厚度小于 5nm ;Zeta 電位在 +16mV 到 +30mV 之間。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種小粒徑血紅蛋白/類水滑石納米復(fù)合物，其特征在于血 紅蛋白分子吸附在類水滑石粒子表面，保持了蛋白質(zhì)原有的二級結(jié)構(gòu)。5. -種權(quán)利要求1所述的小粒徑血紅蛋白/類水滑石納米復(fù)合物催化鄰苯二胺的應(yīng) 用，特別是高溫條件下催化鄰苯二胺的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明以血紅蛋白為生物分子模板，以二價金屬鹽Mg(NO3)2和三價金屬鹽Al(NO3)3混合溶液為金屬離子來源，以氫氧化鈉溶液為堿源，在血紅蛋白模板分子誘導(dǎo)下，采用T型微反應(yīng)器共沉淀法制得了小粒徑血紅蛋白/類水滑石納米復(fù)合物。本發(fā)明所述納米復(fù)合物中，血紅蛋白分子均勻地吸附在類水滑石粒子表面，并保持了其蛋白質(zhì)原有的二級結(jié)構(gòu)；其形貌呈海綿狀和不定型的小顆粒狀，具有大的比表面積；平均粒徑小于40nm，厚度小于5nm；Zeta電位在+16mV到+30mV之間；所述血紅蛋白/類水滑石納米復(fù)合物具有很高的熱穩(wěn)定性能，在90℃高溫條件下催化鄰苯二胺時的酶活保持率在31～63.5％之間，遠(yuǎn)高于游離的血紅蛋白的7.28％和大顆粒類水滑石固定血紅蛋白復(fù)合物的21.44％。
【IPC分類】C07K17/14, B01J31/38
【公開號】CN104945511
【申請?zhí)枴緾N201510388739
【發(fā)明人】詹天榮, 蘆思思, 譚正偉, 楊琦
【申請人】青島科技大學(xué)
【公開日】2015年9月30日
【申請日】2015年7月5日