專利名稱：：核苷酸和低聚核苷酸前體藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及設(shè)計(jì)、合成并評(píng)價(jià)核苷、核苦酸和低聚核苷酸前體藥物類似物。本發(fā)明的化合物、組合物和方法在治療乙型肝炎病毒(HBV)感染和與HBV有關(guān)的肝臟疾病方面非常有效。具體的化合物和組合物涉及新型抗HBV試劑疏代磷酸二核苷酸和硫代磷酸三核苷酸的S-烷基酯。該化合物和結(jié)合物可以單獨(dú)給藥或與其他抗-HBV試劑結(jié)合給藥。
背景技術(shù)：
：由乙型肝炎病毒(HBV)造成的急性或慢性的肝臟感染構(gòu)成世界范圍的公眾健康危機(jī)，感染了將近20億人口，其中在美國(guó)包括170萬人(世界衛(wèi)生組織報(bào)道)。據(jù)估計(jì)，全世界有3億5千萬慢性HBV攜帶者。根據(jù)疾病控制中心，每年將近3到7百萬人死于與感染有關(guān)的并發(fā)癥，例如，肝硬化和肝細(xì)胞癌變。大量接受肝移植的病人還持續(xù)需要抗-HBV治療。HBV被認(rèn)為是一種重要的病原，能夠?qū)е潞芏嗳祟惏┌Y。HBV感染還導(dǎo)致暴發(fā)型肝炎，這是一種致命的疾病，在此疾病中肝臟被破壞。慢性肝炎感染導(dǎo)致慢性持續(xù)的肝炎、衰竭、肝硬化、肝癌和死亡。HBV感染的流行病學(xué)與人類免疫缺陷性病毒(HIV)的流行病學(xué)十分相似。許多HIV攜帶者同時(shí)感染了HBV。但是HBV比HIV病毒容易感染100倍。盡管目前已經(jīng)認(rèn)可三種抗HBV藥物進(jìn)行臨床應(yīng)用，但是由于抗藥性的快速出現(xiàn)和與治療有關(guān)的劑量限制的毒性，臨床需要遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有得到滿足。被認(rèn)可能夠臨床應(yīng)用的藥物包括a干擾素、一種遺傳工程蛋白質(zhì)和核苷類似物，例如，拉米夫定(lamivudine)和恩他卡韋(entacavir)。另一種被認(rèn)可的抗HBV藥物是阿德福韋雙特戊酰氧基曱酯(adefovirdipivoxil),這被認(rèn)為是一種單核苷酸磷酸酯類似物。已經(jīng)發(fā)展了大量合成的核苦作為抗-HBV試劑。例如，BCH-189(2，3，-雙脫氧-3，-硫代胞苷)的(-)對(duì)映異構(gòu)體，作為拉米夫定(lamivudine)或3-TC被認(rèn)知，在Liotta等人的美國(guó)專利第5,530,116中要求保護(hù)這種對(duì)映異構(gòu)體。Liotta等人的美國(guó)專利第5,5814,639和5,914,331號(hào)中要求保護(hù)FTC或p-2-羥基曱基-5-(5-氟代胞嘧啶-l-基)-1，3-氧硫雜環(huán)戊烷。另外，還參見Furman等人的《抗微生物試劑和化療》，2688-2692,1992。美國(guó)專利第5,565438號(hào)、5,567,688號(hào)和5,587,362號(hào)公開了L-FMAU或T-氟代-5-曱基-p-L-呋喃阿拉伯糖基尿嘧咬。美國(guó)專利第5,641,763和5，142,051號(hào)公開了阿德福韋或(9-[2畫(膦酸-曱氧基)乙基]腺嘌呤還可以叫做PMEA。相應(yīng)的前體藥物是阿德福韋雙特戊酰氧基曱酯(adefovirdipivoxil),這種前體藥物是一種口服起作用的抗-HBV劑。美國(guó)專利第5,444,063號(hào)和第5,684,010號(hào)公開了J3-D-l,3-二氧戊烷核苷對(duì)映異構(gòu)體治療HBV方面的應(yīng)用。Iyer等人的美國(guó)專利第6,881,831號(hào)公開了包括兩種或兩種以上通過核苷內(nèi)連接健相連接的脫氧核糖核苷和/或核糖核苦單體的化合物，用于HBV治療。在已經(jīng)遞交的申請(qǐng)WO08/40164、WO/95/07287和WO00/09531中要求保護(hù)不同結(jié)構(gòu)的L核苷作為抗HBV試劑。其他的要求保護(hù)的抗HBV試劑包括(1)p-D-3，疊氮-2,3-雙脫氧-5-氟代胞嘧咬(Mahmoudian，PharmResearch8，1198-203,1991);(2)2'-卩-D-F-2，,3，-雙脫氧核苷類似物，Tsai等人，BiochemPharmacol.48，1477-1481,1994;(3)5-carboximido、或者5-氟代-2,3不飽和的或3，-修飾的嘧咬核苦。除了阿德福韋，一些核苷酸類似物也被要求保護(hù)為抗HBV試劑。這包括9[1-磷酸曱氧基環(huán)丙基)甲基鳥噪呤]、PMCG和雙新戊酰基氧基前體藥物、PMCDG和三氟曱基類似物、MCC-478。作為評(píng)論，參見lyer等人，CurrentOpinioninPharmacol5,520-528,2005。環(huán)核苦酸磷酸類似物和前體藥物衍生物也是具有抗HBV活性的核苷類似物。其相應(yīng)的磷酸酰胺鹽前體藥物類似物通過酯酶催化轉(zhuǎn)化為磷酸鹽衍生物。參見lyer等人，CurrentOpinioninPharmacol5，520-528,2005。使用化學(xué)修飾的藥物作為前體藥物的觀點(diǎn)在許多不同的藥物制藥發(fā)展過程中一種已經(jīng)建立起來的范例。前體藥物策略對(duì)藥物的物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行短暫的修飾，從而(a)改善化學(xué)穩(wěn)定性、(b)改變水溶解性、(c)改進(jìn)生物利用率、(d)靶向具體的組織、(e)加速增效藥物結(jié)合、(f)克服首過代謝效應(yīng)、(g)作為親水性藥物的親脂性載體，和(h)作為持續(xù)藥物傳遞的化學(xué)補(bǔ)給站。已經(jīng)使用了一些前體藥物策略來改善生物利用率，從而提高肝臟組織分布狀態(tài)并改善抗病毒效力。例如，將磷酸基修改為相應(yīng)的氨基酸氨基磷酸酯會(huì)導(dǎo)致更有效的抗病毒能力(Gudmundsson等人，核苷、核苷酸，231929-1937，2004.Cahard等人，MiniReviewsMedChem.(藥物化學(xué)微觀評(píng)論)，4,371-381,2004.)核香的甘油基磷酸鹽和磷脂前體藥物也進(jìn)行了一定的發(fā)展(Hostetler等人，AntimicrobAgentsandChemotherapy(抗微生物劑和化學(xué)療法)，44,1064-1069，2000)從而改善了口服給藥的生物利用率。S-?；璐一?SATE)和環(huán)狀水楊酰基衍生物(曱基異丙基環(huán)己烯酮)是核苷和核苷酸前體藥物其他的例子(Peyrottes等人，MiniReviewsMedChem.(藥物化學(xué)微觀評(píng)論)，4,395-408，2004)和Meier等人，MiniReviewsMedChem.(藥物化學(xué)微觀評(píng)論)，4,383-394,2004.其他的前體藥物策略包括4-?；〈沫h(huán)l，3-丙基酯(HepDirect類似物)，這種化合物經(jīng)歷過肝臟酶的氧化分裂，從而釋放活性核苷酸內(nèi)切酶(Erion等人，J.Am.Chem.Soc，126,5154-5163,2004)?？偟膩碚f，在核苷成為HBV聚合酶抑制劑之前，需要將所有的核苷磷酸化成為核苷單磷酸鹽、核苷雙磷酸鹽、和核苷三磷酸鹽。因此，核苷可以被認(rèn)為是一種需要在體內(nèi)活化的前體藥物。由于絕大多數(shù)核苷耙向病毒聚合酶并按照相似的機(jī)理起作用，所以有可能快速的出現(xiàn)阻力或發(fā)生有害事件，例如，由于抑制人y聚合酶而出現(xiàn)的線粒體毒性。與抗病毒治療相伴隨的另一個(gè)問題是治療停止后病毒的復(fù)發(fā)。利用例如適體技術(shù)、反義技術(shù)、核糖酶技術(shù)、RNA千擾技術(shù)和免疫刺激技術(shù)，前體藥物策略還可以在低聚核苷酸(18-30mers)中應(yīng)用，這正在發(fā)展為可能的新型治療劑種類。[作為評(píng)論，參見(a)Szymkowski,D.E.DrugDisc.Today1996,J,415;(b)Uhlma皿E.;PeymanA.Chem.Rev.1990,90,543Cc)UhlenbechO.C.Nature1987，328，596;(d)ZamoreP.D.Science,2002,296,1265;(e)Manoharan,M.Curr.Op.Chem.Biol.2004,S,570;(f)Iyer,R.P.;Kuchimanchi，S.;Pandey，R.K.藥物的未來，2003,28，51;(g)Uhlmann，E.;Vollmer，J.C紙Opin.DrugDiscov.Devel.2003,6，204]。作為一種強(qiáng)電荷的、大分子量的化合物，低聚核苷酸對(duì)于細(xì)胞經(jīng)過被動(dòng)擴(kuò)散的滲透作用具有一些不希望的物理化學(xué)性質(zhì)。因此，低聚核苷酸前體藥物類似物的設(shè)計(jì)主要集中在使用生物可逆的親脂性基團(tuán)局部遮擋低聚核苷酸帶負(fù)電荷骨架。已經(jīng)合成了許多這樣的前體藥物類似物且已經(jīng)在體外表現(xiàn)出生物可逆性。然而，雖然最初一個(gè)或兩個(gè)核苷酸的去屏蔽作用能夠快速發(fā)生，但是完全的去屏蔽作用要花幾小時(shí)甚至幾天完成。例如，Iyer等人制備了混合PO-PS低聚核苷酸的S-酰氧基烷基衍生物，并發(fā)現(xiàn)，在體外，這種衍生物可以轉(zhuǎn)換回其母體低聚核苷酸，盡管這一轉(zhuǎn)換是緩慢的。對(duì)于低聚核苷酸前體藥物已經(jīng)使用了類似的SATE前體藥物策略。但是，并沒有說明他們的改善低聚核苷酸藥物動(dòng)力學(xué)或提高生物活性的體內(nèi)功效。另外，沒有關(guān)于低聚核苷酸前體藥物體內(nèi)口服生物利用率研究的報(bào)道也沒有體內(nèi)生物活性實(shí)驗(yàn)的報(bào)道。較短的低聚核苦酸鏈(小于8-mers)與20-mer低聚核苷酸相比具有較少的電荷數(shù)和較小的分子量，且有希望成為一種新型的具有有效治療和診斷效果的分子。實(shí)際上，近來的報(bào)告指出，單、雙、三和短鏈低聚核苷酸具有重要的生物活性，可以開發(fā)其醫(yī)療方面的應(yīng)用。然而，口服、透皮、及其他非侵入性、具有良好的病人適用性的給藥系統(tǒng)的缺乏，和低效率的細(xì)胞滲透率，成為這種分子治療性發(fā)展的重要障礙。
發(fā)明內(nèi)容為了發(fā)展雙核苷酸和三核苦酸口服生物可利用的類似物，對(duì)一種二核苷酸模型的s-功能化不帶電荷的前體核苦衍生物進(jìn)行了合成和評(píng)估。根據(jù)目標(biāo)酶揭露潛在功能性的能力來設(shè)計(jì)前體核苷從而在體內(nèi)顯示母體核苷酸。本申請(qǐng)?jiān)谶@里公開了對(duì)治療HBV尤其有用的多種化合物的設(shè)計(jì)、合成、穩(wěn)定性、生物可逆性、和細(xì)胞毒性研究。本發(fā)明提供了一種式(I)的前體核苷<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>(I)或其外消旋物、對(duì)應(yīng)異構(gòu)體、非對(duì)應(yīng)異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體、互變異構(gòu)體，其中，X-缺失、O、NH、NR、S;Xi=缺失、O、NH;A=缺失、芳基、芳烷基；n=0，1，2，3,4,5;R-烷基、取代的烷基、環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、雜環(huán)基、O-烷基、O-雜芳基、類固醇；Ri、Rz獨(dú)立地是H、OH、O-烷基、烷基、取代的烷基、環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、雜環(huán)基、O-芳基、O-雜芳基芳基、雜環(huán)基；R3選自氫、烷基、取代的烷基、C(0)-烷基、C(0)O-烷基、C(O)芳基、C(0)O-芳基、C(0)NH-烷基、和C(O)NH-芳基；Y和Z分別獨(dú)立地是O和S;Bj和B2分別獨(dú)立的是腺噤呤、鳥噤呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、或修飾的核苷；加=1到40。根據(jù)本發(fā)明的前體藥物或其包含這種化合物的藥學(xué)上可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的制劑在預(yù)防和治療HBV傳染及其他由HBV所引起情況時(shí)時(shí)有效的，這里所述的由HBV所引起的情況例如肝炎、肝硬化、急性肝炎、暴發(fā)型肝炎、慢性肝炎、及其他肝臟疾病。本發(fā)明的化合物和制劑還可以預(yù)防性的使用來防止HBV感染的患者體內(nèi)的疾病惡化。這里還公開了一種用于治療宿主體內(nèi)HBV感染的方法，其中所述宿主包括人，該方法包括給藥有效量的本發(fā)明前體藥物，包括其藥學(xué)上有活性的鹽，給藥過程可以是單獨(dú)給藥也可以與另一種或其他抗HBV試劑結(jié)合給藥，或者與另一種或其他抗HBV試劑順序給藥。本發(fā)明優(yōu)選的前體藥物包括雙核苷酸和三核苷酸，所述雙核苷酸和三核苷酸包括但不限于，3誦dApsU2,_OMe,3'dApsA7deaza和3'-dApsTpsC及其類似物，其中，"ps"是指硫代磷酸核苷內(nèi)酯鍵。在本文中，申請(qǐng)人最近已經(jīng)報(bào)道了某些雙核苷疏代磷酸酯(PS)、三核苷硫代磷酸酯(PS)和氨基磷酸酯類似物，這些化合物在體內(nèi)和體外都顯示出有效的抗-HBV活性。雖然PS類似物的二聚物和三聚物是帶負(fù)電荷的小分子，在小鼠中進(jìn)行的35iS'-標(biāo)記化合物的研究顯示這些化合物不是可以口服使用的。口服生物利用率的缺乏可能由于許多因素，包括(a)胃中的酸性環(huán)境能夠使核苷酸大量降解，(b)骨架上的負(fù)電荷抑制核苷酸穿過腸粘膜屏障的滲透作用，和(c)在胃腸道中存在的多種消化酶能夠降解化合物。已知較長(zhǎng)的和較短的低聚核苷酸鏈都是不能口服使用的，那么就具有較短的核苷酸的化合物來講，化合物的電荷，而不是化合物的大小在決定生物利用率方面是更為重要的因素，而且，掩蔽骨架上的負(fù)電荷可以有效的提供可口服使用的核苷酸化合物。通過下面對(duì)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案的更為具體的描述，以及所附附圖中的解釋，本發(fā)明前面所講到的及其他目標(biāo)、特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)將會(huì)變得更為顯而易見，在附圖中，不同附圖中相似的參考標(biāo)記是指相同的部分。附圖沒有必要按照規(guī)模繪制或突出重點(diǎn)，只需要按照能夠說明本發(fā)明原理的方式繪制。圖1是一種典型的前體核苷的31PNMR痕量圖。圖2是一種散布圖，表現(xiàn)了使用本發(fā)明組合物進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。具體實(shí)施例方式在第一實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物是上述式I所表示的化合物，或其外消旋物、對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)應(yīng)異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體、互變異構(gòu)體。在第二實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物是下述式II所表示的化合物，或其外消旋物、對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)應(yīng)異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體、互變異構(gòu)體。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>其中m是l、2或3;并且R、X、A、n、R!、R2、B!和B2如之前的定義。在第三實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物是下述式m所表示的化合物，或其外消旋物、對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)應(yīng)異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體、互變異構(gòu)體。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>其中R、X、A、n、B,和B2如之前的定義。在第四實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物是下述式IV所表示的化合物，或其外消旋物、對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)應(yīng)異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體、互變異構(gòu)體。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>(IV)其中R4選自氫、氫、C(0)-烷基、C(0)O-烷基、C(0)-芳基、C(O)O-芳基、C(O)NH-烷基、和C(O)NH-芳基；并且Rs、R3、X、X,、A和n如之前的定義。在第五實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物是下述式V所表示的化合物，或其外消旋物、對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)應(yīng)異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體、互變異構(gòu)體。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>(V)其中R、R3、R4、X、X。A和n如之前的定義。在第六實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物是下述式VI所表示的化合物，或其外消旋物、對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)應(yīng)異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體、互變異構(gòu)體。其中R、R3、X、X。A和n如之前的定義。按照本發(fā)明，代表性的化合物選自由式Al的化合物(1)-(8)所組成的組中其中表1中分別限定了R、XpRs和R4.表l<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>根據(jù)本發(fā)明，代表性的化合物選自由式Bl的化合物(9)-(16)所組成的組中Bl其中表2中分別限定了R、X,、R3和R4.表2<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>這里急需研究出一種抗HBV藥物，這種抗HBV藥物是一種新型的化學(xué)體，具有新型的作用機(jī)理，可以與其他藥物聯(lián)合使用。本發(fā)明的雙核苷酸和三核苷酸類似物作為抗HBV治療劑是有效的，且代表為一種抗病毒藥物新發(fā)現(xiàn)的范例，這種范例與傳統(tǒng)的核苷類抗HBV試劑是不同的。Iyer等人發(fā)表的美國(guó)專利第6,881,831號(hào)描述了一些具有抗HBV活性的雙和三核苷酸，該專利的內(nèi)容通過引證在此全部并入本文。許多這些化合物也具有抗HBV抗性抹的活性(Iyer等人，Antimicrob.AgentsandChemotherapy(抗微生物試劑和化學(xué)療法)，48,2199-2205，2004)并且二核苷酸3-dApsU2，_OMe(與尿嘧啶通過一種疏代磷酸酯鍵連接的3-脫氧腺噤呤，尿嘧啶在2位上的糖被曱氧基基團(tuán)修飾)在HBV感染的轉(zhuǎn)基因老鼠模型中顯示了優(yōu)秀的抗HBV活性(Iyer等人，Antimicrob.AgentsandChemotherapy(抗微生物試劑和化學(xué)療法)，48，2199-2205，2004)。一些研究說明，在老鼠和人肝臟線粒體中，3-dApsU2,—oMe及其他雙核苷酸和三核苷酸不會(huì)體外進(jìn)行重要新陳代謝。這一結(jié)果支持了一種假設(shè)，即，3-dApsU2,—oMe及其他雙核香酸和三核苷酸的抗病毒活性是由于完整的核苷酸結(jié)構(gòu)而不是由于其代謝物。這與傳統(tǒng)的抗病毒核苷不同，傳統(tǒng)的抗病毒核苷需要代謝活化并且需要轉(zhuǎn)化成三璘酸鹽衍生物來起作用。在旱獺中進(jìn)行的3-dApsU2'-OMe的藥代動(dòng)力學(xué)研究表示，在靜脈注射(IV)給藥之后，可以觀察到顯著3-dApsU2，-oMe血漿水平，其半衰期大約是1小時(shí)。二核苷酸3-dApsU2，.oMe作為完整的材料從尿中排出，這也表明缺少在肝臟中的新陳代謝。這一觀測(cè)結(jié)果與使用人肝微粒體觀察到的3-dAPsU2,.OMe在體外沒有明顯的新陳代謝一致，從而支持了一種假設(shè)，即3-(1八？81;2,.0咖的抗病毒活性是由于其完整的核苷酸結(jié)構(gòu)，而不是由于它的代謝物。這與傳統(tǒng)的抗病毒核香不同，傳統(tǒng)的抗病毒核苷需要代謝活化并且需要轉(zhuǎn)化成三磷酸鹽衍生物來起作用。對(duì)小鼠進(jìn)行35-標(biāo)記的雙和三核苷酸的IV給藥表明，在吸收之后，化合物迅速地從中央室分布到血管外的組織中。該化合物在肝臟和腎臟正大量的集中，在其他組織中只觀察到很少劑量。該化合物的消除仿佛是緩慢的，這些研究表明，在吸收之后該化合物在肝臟中發(fā)生顯著的分布。由于肝臟是HBV的靶器官，這一研究顯示雙核苷酸和三核苷酸能夠容易的進(jìn)入肝細(xì)胞。二核苷酸3-dApsU2,.oMe在轉(zhuǎn)基因的老鼠模型中的有效的抗病毒活性可以被上述研究所支持。使用Caco-2細(xì)胞進(jìn)行的雙核苷酸和三核苷酸的體外細(xì)胞滲透作用研究表明這些帶電荷的分子不會(huì)發(fā)生腸吸收。由于Caco-2細(xì)胞或多或少地能夠預(yù)計(jì)口服生物利用率，該研究表明雙核苷酸和三核苷酸不能通過被動(dòng)擴(kuò)散從腸粘膜中吸收，除非使用一種新型的制劑或藥物傳遞系統(tǒng)。口服生物利用率的缺乏可能由于許多因素，包括(a)胃中的酸性環(huán)境能夠使核苷酸大量降解，(b)骨架上的負(fù)電荷能夠抑制核苷酸穿過腸粘膜屏障的滲透作用，和(C)在胃腸道中存在的多種消化酶能夠降解化合物。已知較長(zhǎng)的和較短的低聚核苷酸鏈都是不能口服使用的，那么就具有較短的核普酸的化合物來講，化合物的電荷，而不是化合物的大小在決定生物利用率方面是更為重要的因素，而且，掩蔽骨架上的負(fù)電荷可以有效的提供可口服使用的核苷酸化合物。本領(lǐng)域可以理解的是，一般而言，核香具有較差的口服生物利用率，因此，使用前體藥物衍生作用作為提高口服生物利用率的策略。Imbach等人要求保護(hù)的美國(guó)專利第6,875,751號(hào)揭示2'-脫氧-P-L-核香的3'-氨基酸前體藥物可以作為L(zhǎng)-核苷的改進(jìn)的可口服使用的前體藥物。同樣地，也可以對(duì)核苷使用SATE前體藥物策略。然而，就核苷酸和二核苷酸來說，問題是在他們的結(jié)構(gòu)中含有高度酸不穩(wěn)定的噤呤和嘧啶基團(tuán)。因此，盡管掩蔽這些分子的負(fù)電荷可以通過增加親脂性來幫助他們?cè)诩?xì)胞內(nèi)擴(kuò)散，但是他們是否會(huì)在胃粘膜中穩(wěn)定足夠長(zhǎng)的時(shí)間從而口服吸收仍是未知數(shù)。代表性地，例如，二核苷酸3-dApsU2、oMe在人工胃液中快速的降解，半衰期小于IO分鐘。已知這種降解過程由首先質(zhì)子化堿基的氮，隨后對(duì)糖環(huán)進(jìn)行脫噪呤作用和分裂而發(fā)生。因此，給定3-dApsU2，.0Me對(duì)酸調(diào)節(jié)的降解作用的敏感性，并不能由此推斷掩蔽骨架上的電荷是否可以防止它們降解，增加它們?cè)谖杆嵝原h(huán)境中的穩(wěn)定性，并由此促進(jìn)口服吸收。此外，已知口服生物利用率不僅僅與在胃粘膜中的穩(wěn)定性有關(guān)系。例如，即使具有提高的穩(wěn)定性，也仍然不知道這種相對(duì)大分子量的雙和三核苷酸前體藥物(分子量>700道爾頓)是否能夠被運(yùn)輸穿過粘膜屏障。實(shí)際上，人們對(duì)這種可以通過主動(dòng)輸送機(jī)制促進(jìn)這些新型化合物傳輸穿過粘膜的具體轉(zhuǎn)運(yùn)裝置是否存在知之甚少。按照里賓斯基原則(Lipinski'srule)(Lipinski,C.A.，Adv.DrugDel.Rev.23,3,1997),通過凈皮動(dòng)擴(kuò)散用于口月艮吸收的藥物分子應(yīng)該具有小于500道爾頓的分子量、不超過5個(gè)氳鍵供體(OH和NH基團(tuán))、不超過IO個(gè)氫鍵受體(值得注意的是氮和氧)、分子量低于500，LogP值低于5。實(shí)際上，雙和三核苷酸前體藥物都是具有較高分子量的化合物，因此在很多方面不能滿足用于口腔吸收的里賓斯基標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明的這種雙和三核苷酸前體藥物在環(huán)和堿基中具有新型修飾或取代作用。由于酯酶或其他酶發(fā)揮活性需要特殊的結(jié)構(gòu)和拓樸學(xué)條件，因此，不能預(yù)計(jì)這種雙核苷酸和三核苷酸前體藥物是否可以作為這些酶的底物。另外，由于這里描述的許多化合物是同分異構(gòu)混合物，并且由于酶是具有立體識(shí)別能力的，因此不能確定是否單獨(dú)的異構(gòu)體們的這些性質(zhì)使人們很少將其考慮為藥物候選物。因此，盡管前體藥物的概念是已知的且對(duì)于制備許多化合物，包括核苷和單核苷酸的前體藥物存在許多策略，但是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員仍不能推知或明顯的預(yù)料到雙核苷酸和三核苷酸類似的前體藥物可能具有口服生物利用率并因此可以發(fā)展成為可口服使用的藥物。本發(fā)明提供了這樣的組合物。方案1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>在一個(gè)實(shí)施例中，要求保護(hù)許多s-功能化的、不帶電荷的前體藥物衍生物。根據(jù)目標(biāo)酶去屏蔽潛在的功能性的能力設(shè)計(jì)前體藥物衍生物，從而在體內(nèi)顯示母體核苷酸。作為代表性的實(shí)施例，方案1中描述了二核苷酸衍生物l-3的通式結(jié)構(gòu)及其酯酶調(diào)節(jié)的向母體二聚物4轉(zhuǎn)換的預(yù)期機(jī)制，且包括(a)S-(酰氧基烷基)疏代磷酸鹽類似物1。酰氧基烷基類似物，例如抗生素氨爺青霉素戊酰氧基曱酯和氨下青霉素曱戊酯，以及最近批準(zhǔn)的抗HBV試劑阿德福韋雙特戊酰氧基甲酯都是可以臨床使用的、可口服使用的酯前體藥物類似物。在吸收之后，該前體藥物到母體分子的轉(zhuǎn)換被認(rèn)為是通過在血漿和/或肝中的酯酶調(diào)節(jié)的水化作用進(jìn)行的，同時(shí)伴隨著曱醛和羧酸的釋放，(b)iS-環(huán)氧?；璐姿狨ヮ愃莆?。道諾紅菌素、阿霉素、芥末磷酸二氨、阿西維辛、和聚乙二醇-道諾紅菌素共軛物是已知的，且進(jìn)行了廣泛的體內(nèi)體夕卜評(píng)估[Bundgaard，H.InBio-reversiblecarriersindrugdesign(藥物i殳計(jì)中的生物可逆性載體).TheoryandApplication(理論和應(yīng)用).Roche,E.B.編輯.；Pergamon出版NewYork，1987;pp13-94;對(duì)于更好的評(píng)論，參見Oliyai,R.;Stella,V.J.Annu.RevPharmacol.Toxicol.1993,32，521;Papot,S.;Tranoy，I.;Tillequin，F(xiàn).;Florent,J.-C;Gesson，J.-P.Curr.Med.Chem.2002,2，155]。雖然反應(yīng)性的亞曱基苯醌中間體在這些前體藥物的水解過程中瞬時(shí)釋放，但通過這種半苯醌中間體快速獲得的水分子能夠使其轉(zhuǎn)換成無毒的苯曱醇類物質(zhì)，從而最小化所有細(xì)胞性傷害。利用這個(gè)基本原理，設(shè)計(jì)本發(fā)明的某些核苷酸類似物或前體核苷，包括酯類似物(酯類似物具有長(zhǎng)鏈烷氧基，長(zhǎng)鏈烷氧基能夠使該分子具有更好的親油性)和酰胺類似物，和(c)設(shè)計(jì)具有末端官能團(tuán)3的S-烷基衍生物從而在酶調(diào)節(jié)的水解過程中，顯示出潛在的親核基團(tuán)，該親核基團(tuán)是并列的，能夠使親電子的a碳與硫代磷酸鹽基團(tuán)起作用，從而釋》文母體二核香酸。本發(fā)明的前體藥物或還涉及某些核香酸、二核苷酸、三核苷酸和低聚核苷酸的衍生物和共軛物。該共軛物可以具有不同的化學(xué)和結(jié)構(gòu)類型，且可以與核苷酸的羥基、氨基、磷酸鹽或硫代磷酸酯骨架或其他核苷和低聚核苷酸中的官能團(tuán)通過酯、酰胺、異氰酸鹽、尿素、疏脲、氨基曱酸鹽或其他類型的共價(jià)鍵相連。假設(shè)之前描述的酶促作用的性質(zhì)是不可預(yù)知的，某些共軛物可以或不可以在體內(nèi)或體外化學(xué)或酶催化重新生成母體核苷酸，因此生物活性可以存在于共扼物中或在母體核苷酸中或在兩者中皆存在。具體地說，之前已經(jīng)識(shí)別了一些雙核苷酸、三核苷酸和四核苷酸以及他們的類似物可以作為抗HBV試劑(美國(guó)專利第10/146,175號(hào)和C1P)。從此，本發(fā)明報(bào)到的衍生物和共軛物也適用于上述申請(qǐng)所引用的化合物。3-dApsU2，-oMe的所有前體藥物都是Rp、Sp異構(gòu)體的混合物，所述Rp、Sp異構(gòu)體衍生自3-dApsU2,.0Me的同分異構(gòu)體Rp、Sp化合物。相似的論點(diǎn)也適用于三和四核普酸。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，共軛基團(tuán)代表一種"掩蔽基團(tuán)"，"R"可以與式(A)的骨架相連，其中R-方案1所顯示的通式結(jié)構(gòu)的酰氧基烷基、芳基、和雜芳酯、碳酸鹽、氨基甲酸鹽、酰胺等等。雜環(huán)優(yōu)選優(yōu)選包含5、或6-個(gè)包含氧、氮、或硫的環(huán)原子，不含其他環(huán)或與其他環(huán)融合。掩蔽帶電荷的骨架可以增加核苷酸對(duì)胃腸道(具有多種消化酶)酸性和堿性環(huán)境的穩(wěn)定性，因此促進(jìn)口腔吸收。例如，帶負(fù)電的磷二酯或硫代磷酸連接鍵的存在被認(rèn)為對(duì)核酸酶調(diào)節(jié)的多聚核苷酸退化是必不可少的。然而，通過制備一種S-烷基化衍生物掩蔽該負(fù)電荷，可以抑制化學(xué)試劑和酶調(diào)節(jié)的多聚核苷酸降解作用，從而增加多聚核普酸的穩(wěn)定性。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，該共軛基團(tuán)可以是一種能夠促進(jìn)藥物穿過生物障礙的運(yùn)輸?shù)挠H脂性基團(tuán)，所述生物障礙例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞的雙分子脂膜或細(xì)菌細(xì)胞壁。這種親脂性基團(tuán)的例子包括但不限于，聚乙二醇(PEG)、膽固醇、膽酸、磷脂等等。這種親脂性基團(tuán)與糖羥基、核苷堿基或核苷內(nèi)磷酸酯和硫代磷酸連接鍵在一個(gè)或一個(gè)以上位點(diǎn)相連接，如化合物(B)所示雙核苷硫代磷酸的膽酸類似物的結(jié)構(gòu)、3'dApsU2，-oMe或者在結(jié)構(gòu)式中。二核苷酸結(jié)合的氨基酸、和在糖羥基處的肽、在核苷堿基處的肽和在核苷內(nèi)硫代磷酸連接鍵處的肽的典型結(jié)構(gòu)通過化合物(C-I)表示出來在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，共軛基團(tuán)可以是一種能夠促進(jìn)該核苷酸主動(dòng)運(yùn)輸穿過多種細(xì)胞屏障的基團(tuán)。這種基團(tuán)可以是天然的或合成的，包括氨基酸、肽、和多肽。在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，共軛基團(tuán)可以促進(jìn)藥物對(duì)特定的組織或器官的靶向性。這種基團(tuán)包括單克隆抗體或其他的具有在確定的耙組織中定位性質(zhì)的天然產(chǎn)物。方案2和3分別表示了結(jié)合三核苷酸的兩個(gè)天然產(chǎn)物的例子，所述兩個(gè)天然產(chǎn)物是姜黃色素和乙酰水楊酸。如同所示，共軛基團(tuán)可以通過糖羥基或核苷堿基氨基耦合。通過國(guó)際上普遍接受的線條圖慣例表示核苷單元。在下面的實(shí)施例中，用常規(guī)結(jié)構(gòu)和相應(yīng)的線條圖格式表示了一種2'-取代的核糖核苷。能夠產(chǎn)生a或卩N-或a或卩C-核香的附著于Bl和B2上的糖單元包括但不限于，呋喃糖、脫氧吹喃核糖、核糖和阿拉伯糖。在這里使用的術(shù)語(yǔ)"芳基"是指具有一個(gè)或兩個(gè)芳環(huán)的單環(huán)或多環(huán)碳環(huán)系統(tǒng)，所述芳環(huán)包括但不限于苯基、萘基、四氫萘基、茚滿基、茚基等等。在這里使用的術(shù)語(yǔ)"雜芳基"涉及一種單或多環(huán)的(例如，二、或三環(huán)的，或更多環(huán)的)芳基或具有五到十個(gè)環(huán)原子的環(huán)基，在環(huán)原子中，一個(gè)或一個(gè)以上環(huán)原子選自，例如，S、O和N;沒有環(huán)原子、一個(gè)或兩個(gè)環(huán)原子是獨(dú)立選自例如，S、O和N的額外的雜原子；而剩余的環(huán)原子是碳，其中環(huán)內(nèi)包含的任何一種N或S可以任選地被氧化。雜芳基包括，但不僅限于，吡啶基、吡。秦基、嘧啶基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、異噁哇基、噻二唑、噁二唑、苯疏基、呋喃基、喹啉基、異唾啉基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、喹喔啉基、等等。根據(jù)本發(fā)明，這里描述的任何一種芳基、取代的芳基、雜芳基和取代的雜芳基可以是任何一種芳基基團(tuán)。芳基基團(tuán)可以是取代的或未被取代的。在這里使用的術(shù)語(yǔ)"烷基"涉及飽和的、直鏈或含有支鏈的烴基基團(tuán)，分別包含一到六個(gè)或一到十二個(gè)碳原子。d-C6烷基基團(tuán)的例子包括，但不僅限于，曱基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、新戊基和正己基基團(tuán)；Q-d2烷基基團(tuán)的例子包括，但不僅限于，乙基、丙基、異丙基、正己基、辛基、癸基、十二烷基基團(tuán)。術(shù)語(yǔ)"芳烷基"或"芳基烷基"包含芳基取代的烷基，例如苯曱基、二苯甲基、三苯曱基、苯乙基、和二苯基乙基。在這里使用的術(shù)語(yǔ)"雜環(huán)"涉及一種5-元、6-元或7-元的非芳香族環(huán)或二或三環(huán)基團(tuán)融合的系統(tǒng)，其中(i)每個(gè)環(huán)包含一到三個(gè)雜原子，獨(dú)立的選自氧、硫和氮，(ii)每個(gè)5-元環(huán)具有0到1個(gè)雙鏈且每個(gè)6-元環(huán)具有0到2個(gè)雙鏈，(iii)氮和硫雜原子可以任選地被氧化，(iv)氮雜原子可以任選地被季銨化，(iv)上述任何一種環(huán)可以任選地與一種苯環(huán)融合，和(v)其他的環(huán)原子是可以被任選氧取代的碳原子。典型的雜環(huán)烷基基團(tuán)包括，但不僅限于，[1,3]二氧戊環(huán)、吡咯烷基、吡唑啉基、p比哇烷基、咪峻淋酮、咪唑烷基、哌啶基、咪喚、噁哇烷基、異噁唑烷基、嗎啉基、噻唑烷基、異噻唑啉基、喹喔啉基、噠溱基、和四氫呋喃。這種雜環(huán)基團(tuán)可以進(jìn)一步被取代。在這里使用的術(shù)語(yǔ)"環(huán)烷基"表示一種通過除去單一氫原子產(chǎn)生的單環(huán)或多環(huán)飽和碳環(huán)化合物的單價(jià)基團(tuán)。例子包括但不限于，環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、二環(huán)[2.2.1]庚基、和二環(huán)[2.2.2]辛基。在這里使用的術(shù)語(yǔ)"取代芳基"、"取代烷基"、"環(huán)烷基"涉及其上一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)及以上的氫原子被取代基所置換的如之前所定義的芳基、烷基和環(huán)烷基基團(tuán)，所述取代基包括但不限于，-F、-Cl、-Br、-I、-OH、保護(hù)的羥基、-N02、-CN、-NH2、保護(hù)的氨基、-NH-C,-C12-烷基、->^-(:2-(:12-烯基、-:^11-(:2-(:12-烯基、->^-(:3-(:12-環(huán)烷基、-NH-芳基、-NH-雜芳基、-NH-雜環(huán)烷基、-二烷基氨基、-二芳基氨基、二雜芳基氨基、-0-<:1-(:12-烷基、-0《2-(:12-烯基、-0-<:2-<:12-烯基、-0-<:3-(:12-環(huán)烷基、-o-芳基、-o-雜芳基、-o-雜環(huán)烷基、-ccco-q-Cu-烷基、《(0)-<:2-(:12-烯基、-c(o)-C2-c!2-烯基、-c(o)-C3-c。-環(huán)烷基、-C(O)-芳基，-C(O)-雜芳基、-C(0)-雜環(huán)烷基、-CONH^-CONH-d-Cu-烷基、-CONH-C2-C,2-烯基、-CONH-(:2-(:12-烯基、-CONH-C3-C12-環(huán)烷基、-CONH-芳基、-CONH-雜芳基、-CONH-雜環(huán)烷基、-OC02-C廣C!2隱》克基、-OCQ2-C2-C!2-婦基、-OC02-C2國(guó)C!2-歸基、-OC02-C3-C!2-環(huán)烷基、-0(202-芳基、-OC02-雜芳基、-00)2-雜環(huán)烷基、-OCONH2、-OCONH-d-C!2-烷基、-OCONH-(:2-(:12畫烯基、-OCONH-CVd2-烯基、-OCONH-CVd2-環(huán)烷基、-OCONH-芳基、-OCONH-雜芳基、-ocoNH-雜環(huán)烷基、^11(:(0)畫(1-(:12-烷基、->^<:(0)-(:2-(:12-烯基、-nhc(o)-C2-d2-烯基、->^(:(0)-(:3-(:12-環(huán)烷基、-nhc(o)-芳基、隱NHC(O)-雜芳基、-NHC(O)-雜環(huán)烷基、-NHC02-C'-C12-烷基、-NHC02-C2隱d2隱烯基、-NHC02-C2-C12-;#|、-NHC02-C3-C12-環(huán)烷基、-NHC02-芳基、-NHC02-雜芳基、-NHC02-雜環(huán)烷基、-NHC(0)NH2、-NHC(O)NH-C廣C!2-烷基、-NHC(0)NH-C2-C,2-烯基、-NHC(0)NH-C2-Cn-烯基、-NHC(0)NH-CrC,2-環(huán)烷基、-NHC(O)NH-芳基、-NHC(O)NH-雜芳基、-NHC(O)NH-雜環(huán)烷基、NHC(S)NH2、-NHC(S)NH陽(yáng)C廣Cu國(guó)烷基、-^[11(:(3)1^11-(:2-(:12畫烯基、-NHC(S)NH-C2-d2-烯基、-NHC(S)NH-C3-C,2-環(huán)烷基、-NHC(S)NH-芳基、-NHC(S)NH-雜芳基、-NHC(S)NH-雜環(huán)烷基、-NHC(NH)NH2、-NHCXNI^NH-d-dr烷基、-NHC(NH)NH-C2-C。-烯基、-NHC(NH)NH-C2-C。-烯基、^11(:^11)]^11-(:3-(:12-環(huán)烷基、-NHC(NH)NH-芳基、-NHC(NH)NH-雜芳基、-NHC(NH)NH-雜環(huán)烷基、-^^<:(>1)-(:1-(:12-烷基、-NHC(NH)-C2-C!2畫烯基、國(guó)NHC(NH)-C2-C!2-烯基、-NHC(NH>C3-C,2國(guó)環(huán)烷基、-NHC(NH)-芳基、-NHC(NH)-雜芳基、-NHC(NH)-雜環(huán)烷基、-C(NH)NH-C廣C2-烷基、-C(NH)NH-C2-C,2-烯基、-0^11)1^1-(:2-(:12-烯基、陽(yáng)C(NH)NH-C3-d2-環(huán)烷基、-C(NH)NH-芳基、-C(NH)NH-雜芳基、誦C(NH)NH-雜環(huán)烷基、-S(O)-C廣C!2-烷基3-S(0)-C2-d2誦烯基、國(guó)s(o)-C2-c2-烯基、-8(0)-(:3-。12-環(huán)烷基、-s(o)-芳基、-s(o)-雜芳基、-S(O)-雜環(huán)烷基-S02NH2、-S02NH-C廣d2隱烷基、-S02NH-C2-C2曙烯基、-S02NH-C2-dr烯基、-S02NH-C3-C2-環(huán)烷基、-S02NH-芳基、-S02NH-雜芳基、-S02NH-雜環(huán)烷基、-NHS02-Cj-Cl2-烷基、-NHS02誦C2-d2-烯基、-1^102-(:2-(:12-烯基、曙NHS02-C3-d2畫環(huán)烷基、-NHS(V芳基、-NHS(V雜芳基、-NHSCV雜環(huán)烷基、-CH2NH2、-CH2S02CH3、-芳基、-芳基烷基、-雜芳基、-雜芳基烷基、-雜環(huán)烷基、-0-(:12-環(huán)烷基、聚烷氧基烷基、聚烷氧基-曱氧基曱氧基、-曱氧基乙氧基、隱SH5-S-C廣C,2誦烷基、-S-CVd2-烯基、-S-C2-C!2-烯基、-S-C3-c12-環(huán)烷基、-s-芳基、-s-雜芳基、-s-雜環(huán)烷基、或曱基硫代曱基?？梢岳斫?，芳基、雜芳基、烷基等等可以進(jìn)一步被取代。在這里使用的術(shù)語(yǔ)"類固醇"涉及任意一種天然存在的或合成的脂肪可溶解的有機(jī)化合物，在四環(huán)中具有基本上17個(gè)碳原子，包括固醇和膽汁酸、腎上腺激素和性激素、某些天然藥物例如洋地黃化合物、和某些維生素的前體。類固醇結(jié)構(gòu)的例子包括但不限于，膽固醇、二氬膽固醇、Sa-環(huán)-S-a-膽甾烷-S-P-醇、膽酸、膽固醇基曱酸鹽、膽甾烷基甲酸。在這里使用的術(shù)語(yǔ)"修飾核苷"涉及任何一種包括修飾的雜環(huán)堿基、修飾的糖基團(tuán)、或其結(jié)合的核苷。在一些實(shí)施方案中，修飾的核苷是一種這里所述的非天然的嘧咬或噤呤核香。修飾核苷的例子包括但不限于，2'-取代的核糖核苷、一種阿拉伯糖核苷或一種2'-脫氧-2'-氟代阿拉伯糖、去氮基腺嘌呤、去氮基鳥噪呤。方案2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage32</formula>方案3r—O—"a"a,u，HO"3.r'S，卜2r—o'R—O>u，陽(yáng)NH.。IH3Crcc叉H3C、實(shí)施例實(shí)施例1.反應(yīng)物和方法在這里報(bào)道的是用于合成并評(píng)價(jià)所選擇的前體藥物(前體核苷酸)及其結(jié)合的典型的實(shí)施例。這里顯示了具有適當(dāng)?shù)男揎椀亩塑账?-dApsU2、OMe的代表性數(shù)據(jù)，這也可以用于本發(fā)明要求保護(hù)的其他化合物。在目前的研究中，使用固相亞磷酰胺化學(xué)作用(Beaucage,S.L.;Iyer,R.P.Tetrahedron1993,49，1925)與一種特別制造的LOTUS反應(yīng)器⑧(Padmanabhan,S.;CougWin,J.E.;Iyer,R.P.TetrahedronLett.2005,46，343;Iyer,R.P.;Coughlin，J.E.;Padmanabhan,S.Org.Prep.Proc.Intl,2005,37,205)結(jié)合，大規(guī)模地(一百萬的裝載有核苷的可控多孔玻璃(CPG)支持)合成3-dApsU2,_。Me(5)的硫代磷酸類似物的RP,SP混合3/0,,、NJN/P/物。使用我們最近發(fā)現(xiàn)的對(duì)固體支持物的超速官能化和裝載過程制備這種dA-連接的可控多孔玻璃(CPG)支持。為了進(jìn)行核苷內(nèi)雙核苷亞磷酸鹽耦合的產(chǎn)品的磺化作用，使用一種3H-1,2-苯并二疏醇-3-酮-l，l,-二氧化物溶液(0.4M在干燥的CH3CN中)(Iyer,R.P.;Regan，J.B.;Egan，W.;Beaucage,S.L.J.Am.Chem.Soc.1990,112,1253)。在反應(yīng)、色譜純化和冷凍干燥之后，獲得純度>96%的RP，SP5的鈉鹽(-60:40混合物)，使用"P和iHNMR對(duì)其定性。表3給出了在這里進(jìn)行設(shè)計(jì)、合成和評(píng)價(jià)的S5特異性前體藥物的結(jié)構(gòu)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage35</formula>適當(dāng)取代的2-烴曱氧基苯基(雜芳基)衍生物可以通過體內(nèi)酯水解作用于傳遞任意具有藥理學(xué)活性的藥物，包括一種分子內(nèi)環(huán)化作用。進(jìn)一步地，通過用相應(yīng)的石典代或溴代衍生物7a-j在水、丙酮或曱醇中化學(xué)選擇性的S-烷化Rp，Sp-5可以以50到70%的產(chǎn)率合成前體藥物或前體核普酸衍生物6a-j,隨后進(jìn)行檢查和色譜純化。前體核苷酸的合成前體核苷酸6a的代表性制備方法。向二核苷酸鈉鹽(50毫克，0.082毫摩爾)在水中(1毫升)的溶液中加入碘曱基特戊酸鹽(7a(表4),85毫克，0.35毫摩爾)在丙酮(2毫升)中的溶液。在黑暗中攪拌此反應(yīng)過夜并用幾毫克亞硫酸氫鈉濃縮。通過柱型色層分離法純化粗品并將6a洗提到二氯曱烷/曱醇(90/10)的混合物中。在真空中濃縮產(chǎn)生色譜純的白色固體(31PNMR,28.7，27.9Sppm)。使用相似的方法制備所有類似物(表4)。中間產(chǎn)物結(jié)構(gòu)<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>通過R-OH與〔31/6&.￡120反應(yīng)制備；163ROH與SOBr2/DCM;ROH與SOCI2/DMF/K1她通過二碘代丁烷和鹽酸鈉的反應(yīng)獲得由商業(yè)途徑獲得轉(zhuǎn)化為觀察到的母體5;⑧半衰期涉及酯的水解，且沒有發(fā)生進(jìn)一步向5的轉(zhuǎn)化；在血清中前體核苷酸在24小時(shí)之后保持不變；由于化合物在DMSO中不溶所以沒有確定從相應(yīng)的羥基ib合物中直4妻合成需要的中間產(chǎn)物7a-j(Hayat，S.;Rahman,A-U,Khan,K.M.;Choudhary,M.I.;Maharvi，G.M.;Ullah，Z.;Bayer,E.Synth.Commun.2003，33,2531;Fernandez,L;Garcia,B.;Munoz,S.;Pedro,R.jdelaSalud，R.Synlett.1993,489)，或從相應(yīng)的氯代衍生物中通過交換反應(yīng)合成需要的中間產(chǎn)物7a-j(參見方案4)。方案4<formula>formulaseeoriginaldocumentpage37</formula>6a-j每個(gè)前體核苷酸類似物的31PNMR在28到34ppm范圍內(nèi)(表示硫代磷酸三酯基團(tuán)的特征)顯示兩個(gè)峰值，相當(dāng)于~55:45比率的RP，SP異構(gòu)體(參見圖1)。37。C下，在位于磷酸鹽緩沖液中的兔血清中進(jìn)行該前體核苷酸生物可逆性的評(píng)價(jià)。為了監(jiān)控前體核苷酸向二核苷酸5的轉(zhuǎn)化，在不同的時(shí)間點(diǎn)取出等分的培養(yǎng)物，處理并用反向高效液體色語(yǔ)分析。據(jù)發(fā)現(xiàn)，類似物6a和6b可以容易的轉(zhuǎn)變?yōu)槟阁w5，且半衰期(t\n)分別為60分鐘和30分鐘。同時(shí)，6a和6b向母體5的完全轉(zhuǎn)化在大約3小時(shí)內(nèi)完成。在磷酸鹽緩沖液(0.1M,pH7.2)中直到24小時(shí)類似物6a和6b都是穩(wěn)定的。此外，在混合物中的RP，SP異構(gòu)體水解期間，沒有證椐證明任何一種重要的立體區(qū)另ij或脫硫作用。有趣的是，6a和6b都能抵抗豬肝酯酶(PLE)和牛胰糜蛋白酶(數(shù)據(jù)未顯示)的水解作用，因此證明本類似物在胃腸道具有重要的半衰期，能夠促進(jìn)完整前體核苷酸的口腔吸收。這一觀測(cè)結(jié)果與相應(yīng)前體核苷酸Rp，SpTT-PS二聚物的情況相反，Rp，SpTT-PS二聚物的重要的立體區(qū)別是明顯的，且在血清和PLE中具有較慢的水解速率(Iyer，R.P.;Yu,D.;Agrawal，S.Bioorg.Med.Chem.Lett.1995,4，2471)。由于T-OMe-尿嘧啶(C3'-endo)與胸腺嘧咬(C2，-endo)的不同的糖折疊方式，6a和6b的總構(gòu)造有可能與相應(yīng)的TT二聚物前體核苷酸具有顯著的區(qū)別。因此，6a和6b中的酯基對(duì)于酯酶親核位點(diǎn)的攻擊更為穩(wěn)定。此外，當(dāng)作為凍干粉末在-20。C下儲(chǔ)藏時(shí)所有類似物的穩(wěn)定性是不確定的。我們4妄下來調(diào)查在不同的細(xì)胞系，例如MDBK、Vero、和HFF中該前體核苷酸衍生物的細(xì)胞毒性曲線。如方案4所示，除6c之外絕大多數(shù)類似物具有CC5()>1000wM，在這些細(xì)胞系中對(duì)于這些化合物顯示高度的安全曲線。實(shí)施例2.3，dAtsU2，rwJ々S-異丙基羰基氣基甲基疏代磷酸衍生物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage38</formula>經(jīng)過兩個(gè)步驟制備靶向化合物6k。步驟l.碘曱基異丙基碳酸鹽的制備向無水碘化鈉(克，40毫摩爾)在無水乙腈(20毫升)的溶液中在20分鐘內(nèi)逐滴加入在無水的乙腈(10毫升)中的氯曱基異丙基碳酸鹽(2.9g，19毫摩爾)。用鋁箔蓋住反應(yīng)混合物(避光保存)，在室溫下攪拌整夜。過濾分離固體，用乙腈洗滌，在降低的壓力下濃縮濾液。將剩余物溶于水(10毫升)中并在乙醚(25毫升)中提取有機(jī)相。用亞硫酸氫鈉(5%,IO毫升)洗滌乙醚提出物，之后用鹽水(10毫升)洗滌。用無水硫酸鈉干燥有機(jī)層，過濾，濃縮并在高度干燥的真空中干燥。產(chǎn)量為2,72克(58%)。H-畫RS1.3(d，6H)，4.95(m,IH),5.95(s，2H).步驟2.二核苷酸，3'-ApsU2，OMe的烷基化。在攪拌下向二核苷酸(60毫克，0.098mmo1)的水溶液中加入祺曱基異丙基碳酸鹽(80毫克，0.0166毫摩爾，3.33eq)的丙酮(1毫升)溶液。再補(bǔ)充加入丙酮(1毫升)得到一種透明溶液，從而避免烷化劑油質(zhì)小球的分離。攪拌用鋁箔蓋住的反應(yīng)混合物3小時(shí)，再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)環(huán)境下濃縮并隨后在高真空中濃縮，得到作為白色固體的反應(yīng)混合物。先使用氯仿然后用包含2%到最終包含8%曱醇的氯仿進(jìn)行硅柱型色層分離法純化。包含主要成分的部分被結(jié)合、濃縮并在高度真空條件下干燥過夜。按照幾乎定量的產(chǎn)率(68毫克)分離所需純的產(chǎn)品6k;31P-NMR(MeOH-d4)527.7，28.6。實(shí)施例3.3'dApsU7，m^的iS-曱基膽酸酯61的制備步驟l.氯代乙基脫氧膽酸鹽的合成。向在乙醇(4毫升)中的脫氧膽酸(120毫克，0.306毫摩爾)中加入碳酸銫(53毫克，0.160毫摩爾)在水(3毫升)中的溶液。攪拌反應(yīng)混合物30分鐘并在先在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)之下除去乙醇，然后再高度真空條件下除去乙醇。冷凍干燥剩余物從而得到作為白色粉末的銫鹽。在室溫下向銫鹽在N，N-二曱基曱酰胺(DMF,3毫升)的溶液中加入溴氯甲烷(10毫升)并用鋁箔蓋住反應(yīng)混合物，在室溫下攪拌24小時(shí)。除去溶劑并在二氯曱烷(20mL)中提取反應(yīng)混合物，用水(5毫升)、鹽水(5毫升)洗滌并在用無水硫酸鈉干燥之后除去溶劑，產(chǎn)生氯曱基化合物(IOO毫克，74%)。在不需要進(jìn)一步純化的情況下就可以使用這一化合物，從而轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的碘甲基衍生物。步驟2,輿曱基脫氧膽酸鹽的制備。向碘化鈉(304毫克，2.03毫摩爾)在無水乙腈(3毫升)的溶液中慢慢地加入氯曱基酯(438毫克，0.99毫摩爾)在乙腈(6毫升)和二氯曱烷(2毫升)的混合物中的溶液。在室溫下攪拌避光的反應(yīng)混合物48小時(shí)。濃縮之后，在二氯曱烷U5毫升)中提取該反應(yīng)混合物，用水(5毫升)、亞硫酸氫鈉(5%，5毫升)洗滌有機(jī)層，最后用鹽水(5毫升)洗滌。用無水硫酸鈉干燥，除去溶劑之后獲得粗產(chǎn)品，用硅柱型色層分離法純化該粗產(chǎn)品，得到碘化合物(110毫克，21%)。步驟3.碘曱基脫氧膽酸鹽的耦合。向3'dApsU2'OMe(50毫克，0.082毫摩爾)在水(400毫升)中的溶液中加入碘曱基脫氧膽酸鹽(110毫克，2.066毫摩爾)在丙酮(3毫升)中的溶液。通過加入更多的丙酮(~6毫升)溶解分離的固體，并將反應(yīng)混合物攪拌過夜。在真空條件下濃縮并用氯仿和包含甲醇(2到10%)的氯仿進(jìn)行硅柱型色層分離法純化。結(jié)合、濃縮并在高度真空下干燥所得部分，得到需要的產(chǎn)品61(40毫克,49%);31P-NMR(MeOH)S28.2,29.1。實(shí)施例4.3'dApsU，。的N-(t-丁氧基羰基)-L-苯丙氨酸類似物6m的制備<formula>formulaseeoriginaldocumentpage40</formula>碘曱基N-(t-丁氣基羰基)-L-苯丙氨酸。向捵甲基N-(t-丁氧基羰基)-L-苯基甘氨酸(663毫克，2.49毫摩爾)在乙醇(3毫升)的溶液中加入碳酸銫(427毫克，1.31毫摩爾)在水(2毫升)中的溶液。在停止放出氣體之后，攪拌反應(yīng)混合物1小時(shí)。除去溶劑并冷凍干燥從而獲得銫鹽。向銫鹽(270毫克，0.82毫摩爾)在N,N-二曱基曱酰胺(DMF,2毫升)中的溶液中加入溴氯曱烷(5毫升)并攪拌整夜，同時(shí)用鋁箔蓋住該反應(yīng)混合物/過濾分離的固體，用二甲基曱酰胺(2毫升)洗滌該固體，且在高度真空條件下濃縮濾液。通過薄層色譜法(Hex:EtOAc4:l)確定該產(chǎn)品是純的。不進(jìn)行進(jìn)一步純化將這些中間產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化成碘化合物。向碘化鈉(196毫克，1.31毫摩爾)在無水乙腈(3毫升)中的溶液中加入在無水的乙腈(1毫升)中氯曱基笨丙氨酸衍生物(206毫克，0.656毫摩爾)。在室溫下攪拌該反應(yīng)混合物，避光，過夜。過濾、用二曱基曱酰胺(3毫升)洗滌該固體，并在真空中濃縮該濾液。在二氯甲烷(10毫升)和水(5毫升)中提取該剩余物，用碳酸氬鈉(5%,5毫升)和鹽水(飽和的，5毫升)洗滌該有機(jī)層。用無水的疏酸鈉干燥有機(jī)層，并濃縮產(chǎn)生所需磺化合物(199毫克，75%)。3'dApsU2'oMe的烷基化。向3'dApsU2'OMe(44毫克，0.072毫摩爾)在水(400微升)中的溶液中加入在丙酮(800微升)中的碘化物(IOO毫克，0.25毫摩爾)，且將該反應(yīng)混合物攪拌過夜。在真空條件下濃縮該反應(yīng)混合物、冷凍干燥并使用氯仿和包含氯仿和甲醇(2%到10%)的混合物進(jìn)行硅柱型色層分離法純化。收集餾份，結(jié)合，濃縮并在高度真空條件下干燥，產(chǎn)生t-Boc保護(hù)的苯基丙氨酸耦合產(chǎn)品6m(40毫克，65%);31P國(guó)NMR(MeOH-d4)S28.7,27.9。實(shí)施例5.3'dApsU^^的4-乙酰氨基苯甲基衍生物6n的制備4-乙酰氨基苯甲基醇的制備。向4-乙酰氨基苯甲醛(IO克，61.3毫摩爾)在曱醇(100毫升)中的溶液中在室溫下分步加入氫化硼鈉(800毫克)。攪拌反應(yīng)混合物過夜，并用4:1己垸乙酸乙酯作為洗脫液進(jìn)行薄層色語(yǔ)檢查反應(yīng)進(jìn)程。起始物料的消失表明還原過程完成，且在一種旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮反應(yīng)混合物。剩余物分別放入水(25毫升)和乙酸乙酯(4X50毫升)中，用鹽水(25毫升)洗滌該有機(jī)層。用無水硫酸鈉干燥乙酸乙酯層并除去溶劑，產(chǎn)生淺黃固體醇8.6克(85%)，在高度真空條件下干燥。NMR(DMSO-d6):82.0(s，3H),4.5(d2H)，5.2(t，IH)，7.25(d,2H)，7.55(d,2H),9.95(s，1H).<formula>formulaseeoriginaldocumentpage42</formula>4-乙酰氨基苯曱基碘化物的制備。向無水的二曱基甲酰胺(5毫升)冷卻的溶液中加入亞碌^酰氯(0.2毫升，2.8毫摩爾)。攪拌該混合物10分鐘并加入K1(2.49g，15毫摩爾)在無水二曱基曱酰胺(12毫升)中的溶液，隨后加入醇(0.165克，1毫摩爾)。在冰浴中攪拌該反應(yīng)混合物3小時(shí)，并在室溫下攪拌整夜。將該反應(yīng)混合物注入冰-水(25毫升)中并用乙醚(3X25毫升)提取。用鹽水洗滌乙醚層，用無水硫酸鈉干燥并濃縮除去溶劑。獲得作為澄清黃色固體的產(chǎn)品(138毫克，50%)(薄層色鐠Hex:EtOAc(l:l)。HNMR(CDC13):S2.17(s，3H)54.45(s,2H)37.17(br.s5IH)，7.33(d，2H)，7.43(d,2H)。還用碘化銫和三氟化硼醚化物在乙腈中以改善的產(chǎn)率(~75%)制備此化合物。按照之前對(duì)膽酸類似物所述的方法進(jìn)行4-乙酰氨基苯曱基碘化物與3'dApsU2"Me的耦合。實(shí)施例6.3'dApsU^:^的4-苯氨基丁基類似物6o的合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage42</formula>4-苯氨基丁基碘化物的制備在0-5'C下，向冷的無水二曱基曱酰胺(5毫升)中加入亞硫酰氯(0.2毫升)并攪拌該混合物15分鐘。加入碘化鉀(2.4克，5毫摩爾)在無水二曱基曱酰胺(8毫升)中的溶液，隨后加入4-苯氨丁醇(193毫克，1毫摩爾)在無水二曱基曱酰胺(2毫升)中的溶液。該有顏色的反應(yīng)混合物被攪拌過夜。通過倒入水凍水(~10毫升)活化反應(yīng)混合物并用乙醚(3X15毫升)提取。最終，用水，鹽水洗滌該乙醚層并用無水疏酸鈉干燥。使用己烷和乙酸乙酯的混合物(4:1)進(jìn)行柱型色層分離法純化過濾并除去溶劑之后獲得的粗產(chǎn)品，產(chǎn)生油狀的碘化合物。45。/。；'HNMR(CDCI3):S1.77(m,2H)，1.93(m,2H)，3.23(t，2H)，3.55(q，2H)，6.26(br.s,IH),7.48(m,3H)57.75(m,2H).該4-苯氨基丁基碘化物與3'dApsU2，0Me的耦合作用按照之前所述的獲得標(biāo)題化合物6o的方式進(jìn)行。實(shí)施例7.3'dApsU^M^的5-苯曱酰氣基戊基類似物的合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage43</formula>5-笨曱酰氧基戊基-1-醇的制備安息香酸(l克)、1，5-戊二醇(5毫升)和/7-曱苯磺酸(110毫克)的混合物在油浴中加熱至IO(TC過夜。將此反應(yīng)混合物冷卻到室溫，注入水(50毫升)并用EtOAc(2X25毫升)提取，用碳酸鈉(5%，20毫升)洗滌，隨后用鹽水(15毫升)洗滌。用無水硫酸鈉干燥有機(jī)層，過濾并濃縮，產(chǎn)生幾乎純的產(chǎn)品(U5g,67%);5-苯甲酰氧基-1-碘戊烷的制備。36%產(chǎn)率，&NMR(CDC13):51.57(m,2H)，1.85(m，4H),3.22(t,2H),4.33(t,2H),7.44(m,2H),7.57(m，IH)，8.04(m,2H)。如前所述進(jìn)行5-苯曱酰氧基-l-碘戊烷與3'dApsU2,OMe的耦合。5-苯甲酰氧基丁基-l-醇的制備在制備5-苯曱酰氧基戊基-l-醇的方法中使用1,4-丁二醇制備所述化合物，產(chǎn)率為73%。實(shí)施例8.3'dApsU，，fWp的4-乙酸基苯曱基類似物6q的合成步驟1.4-乙酸基苯曱基醇的制備在冰浴中，向冷卻的4-羥千乙醇(1.95g，14毫摩爾)在乙酸乙酯(25毫升)中的懸浮液中加入三乙胺(2.1毫升，14.9毫摩爾)，同時(shí)攪拌。從漏斗中逐滴加入乙酰氯(U毫升，15.5毫摩爾)在乙酸乙酯(12毫升)中的溶液。攪拌反應(yīng)混合物整夜。過濾固體，用乙酸乙酯洗滌，并在濃縮剩余物之后，使用己烷并逐漸地過渡為40%乙酸乙酯進(jìn)行柱型色層分離法純化。產(chǎn)率為40%。^畫NMR(CDC13),S2.02(br.s,IH)，2.29(s,3H),4.65(s,2H),7.07(d,2H),7.36(d，2H).步驟2.4-乙酸基苯甲基碘化物的制備向4-乙酸基苯甲基醇(0.332克，2毫摩爾)和碘化銫(0.571克，2.2毫摩爾)在無水乙腈(10<formula>formulaseeoriginaldocumentpage44</formula>毫升)的溶液中，在氮?dú)鈼l件下，加入在乙腈(5毫升)中的三氟化硼醚化物(0.28毫升，2.2毫摩爾)。攪拌過夜之后，向反應(yīng)混合物中注入水凍水(20毫升)并過濾分離的固體，用水洗滌，之后用己烷洗滌。在高度真空條件下干燥。產(chǎn)率為0.39g,71%;薄層色語(yǔ)，hexanes:EtOAC(4:1)。NMR(CDC13):S2.3(s，3H),4.35(s,2H),7.05(d,2H)57.5(d,2H).步驟3.3'dApsU2,。Me的4-乙酸基苯曱基類似物的合成如前所述進(jìn)行3'dApsU2.。Me與4-乙酸基苯曱基碘化物的烷基化作用。實(shí)施例9.細(xì)胞毒性試驗(yàn):在96孔板上使用PromegaCellTiter96非放射性細(xì)胞增殖試—瞼試劑盒與96-孔板閱讀程序(ThermoMax，Molecular裝置)，并使用MDBK、Vero、和HFF細(xì)胞系(從ATCC處獲得)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)MTT試驗(yàn)。使用了許多參照物，包括核香類似物3TC、AZT、和ddC以及不含有藥物的媒介物。使用SDS作為陽(yáng)性細(xì)胞毒素對(duì)照物。^r驗(yàn)所有的前體核苦酸，該前體核苷酸4安照100pM、300pM和1000pM分成3份。在24小時(shí)的細(xì)胞與檢測(cè)物質(zhì)培養(yǎng)之后，進(jìn)行MTT試驗(yàn)。表5顯示了一些數(shù)據(jù)。表5"P-NMR和逸擇的前體藥物的細(xì)胞毒性數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>實(shí)施例10.前體藥物的生物可逆性評(píng)i^介如下進(jìn)行生物可逆性研究通過在IOO微升二曱亞砜中溶解2毫克類似物來制備每個(gè)類似物的貯備溶液。用90nL磷酸鹽緩沖液(0.1M，pH7.0)稀釋10nL等分樣品和lOOpL等分的兔血清。在37。C下在水浴中培養(yǎng)該混合物。在不同的時(shí)點(diǎn)除去等分樣品，用200pL曱醇稀釋終止反應(yīng)。然后離心培養(yǎng)物，在speedvac系統(tǒng)中濃縮上清液并在注射入高效液體色語(yǔ)之前用20(HiL0.1M乙酸銨緩沖液稀釋。使用裝備有OOEgradient控制器的Waters儀器和一種具有Millennium軟件的996光導(dǎo)二極管陣檢測(cè)器進(jìn)行反向高效液體色譜分析。X-terraMSC182.5pm,2.1X20毫米柱，在30分鐘內(nèi)緩沖液A(0.1MNH4OAc)和緩沖液B(80:20,CH3CN:NH4OAc)的操作梯度由100%A變化到80%B。前體藥物的保留時(shí)間從16分鐘變化到18分鐘，其中Rp,Sp二核苷酸5的保留時(shí)間是13.5、13.8分鐘。代表性地例如，氨基酸衍生的前體藥物6m和碳酸鹽衍生物6k在3小時(shí)的血清治療中幾乎完全轉(zhuǎn)化為3'dApsU2,oMe。其他前體藥物的轉(zhuǎn)化成其母體二核苷酸的速率是不同的。在試驗(yàn)條件下，一些前體藥物并不轉(zhuǎn)換成其母體。實(shí)施例11.穩(wěn)定性檢驗(yàn)了37。C下在人工胃液(SGF)和人工腸液(SIF)中前體藥物的穩(wěn)定性。按照?qǐng)?bào)道的方法制備人工胃液和人工腸液，且前體藥物分別與人工胃液和人工腸液一起在37。C下培養(yǎng)1小時(shí)。使用反向高效液體色譜處理并分析。人們發(fā)現(xiàn)，母體二核苷酸3'dApsU2'OMe在人工胃液中是不穩(wěn)定的，在大約15分鐘內(nèi)分解，但在人工腸液中相對(duì)穩(wěn)定。所有的前體藥物在人工胃液中都是穩(wěn)定的，半衰期在從1到3小時(shí)范圍內(nèi)。在人工腸液中，S-乙酰氧基烷基前體藥物被轉(zhuǎn)變成母體二核苷酸，半衰期大約為1小時(shí)。實(shí)施例12.口服生物利用率在CD-I老鼠中測(cè)定該前體藥物的口服生物利用率。將每種代表性的前體藥物6a、6k、61溶于水中，并口服給藥給幾組小鼠。在此研究中使用體重在20到30克之間的雄性Swiss-Webster老鼠(CharlesRiverLabs)。在指定的時(shí)間點(diǎn)，5、15、30、60、和120分鐘，殺死老鼠，通過心臟刺孔收集血液。除去肝、腎、胃、十二指腸、空腸、回腸和腦，在干冰中冷凍直至使用。從血液中通過離心作用分離血漿，并通過反向高效液體色語(yǔ)分析藥物含量。通過分析高效液體色i普決定每個(gè)前體藥物和/或母體3'dApsU2'oMe的水平。按照均化作用在1%SDS中，在有0.1MNaOAc參與的情況下處理組織樣品(主要是肝)。向PALL50K濃縮器中加入均勻混合物并以3000rpm的速率離心2小時(shí)。在反向高效液體色謙柱(2.1X20mmX-Terra柱)上運(yùn)行樣品，流速Iml/min，30分鐘內(nèi)梯度由100%A(0.1MNH4OAc)變?yōu)?00%B(乙腈0.1MNH4OAC,80:20)。就血液來說，在早期時(shí)間點(diǎn)可以檢測(cè)到前體藥物，而在后期的時(shí)間點(diǎn)，主要觀察到母體二核普酸3'dApsU20Me。就肝來說，主要觀察到3'dApsU20Me。這些觀察結(jié)杲與前體藥物的口腔吸收隨后發(fā)生由酶調(diào)節(jié)的前體藥物向3'dApsU20Me的轉(zhuǎn)化一致。4艮可能的，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)化前體藥物成3'dApsUtoMe的酶是可以在血液和組織中發(fā)現(xiàn)的酯酶。在血漿和肝中，口服生物利用率的估計(jì)值在5到15%范圍內(nèi)。實(shí)施例13.這些前體藥物的體內(nèi)抗HBV活性在HBV感染的轉(zhuǎn)基因老鼠模型中評(píng)價(jià)確定的前體藥物。使用年齡在78到108天的感染上HBV的雄性轉(zhuǎn)基因老鼠。開始，以300到400毫克/公斤體重的單次劑量評(píng)價(jià)前體藥物6a和6k,通過口服每日給藥，持續(xù)14天。給藥在檸檬酸中的該化合物，使用阿德福韋雙特戊酰氧曱酯作為陽(yáng)性參照物。使用收到煤介物的對(duì)照組作為陰性參照物。治療之后，殺死小鼠，使用DNA印跡(Southernblot)分析法分析肝組織的HBVDNA。使用Kruskall-Wallis非參數(shù)的ANOVA統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)所得數(shù)據(jù)，并在圖2中顯示出曲線。與未處理的對(duì)照物相比，前體藥物6a和6k使肝HBVDNA降低21og，這一結(jié)果是統(tǒng)計(jì)上顯著的，p值為0.01到0.001。實(shí)施例14.在轉(zhuǎn)基因老鼠中口服給藥化合物6a和6k對(duì)乙型肝炎病毒的效果用人乙型肝炎病毒感染雌性和雄性轉(zhuǎn)基因老鼠(founder1.3.32)。感染之后，對(duì)動(dòng)物口服給藥化合物6a或6k，或一種0.05M檸檬酸安慰劑，pH值為2.0，每日一次，給藥14日?；衔?a的劑量是400毫克/公斤/天，化合物6k的劑量是300毫克/公斤/天。以10毫克/公斤/天的劑量給藥陽(yáng)性對(duì)照、ADV。表6和表7中概括所得數(shù)據(jù)。與安慰劑々某介物相比，統(tǒng)計(jì)顯著性表示為承P〈0.05，承*P<0.01，***P<0.001。按照國(guó)際免疫診斷的標(biāo)準(zhǔn)化試驗(yàn)，使用PaulEhrlich國(guó)際單位(PEIU)報(bào)告血清HBeAg、PEI的測(cè)量值。該研究還確定在高劑量使用時(shí)，不具有明顯的毒性。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>這里引用的專利和科學(xué)文獻(xiàn)建立起本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以使用的知識(shí)。在這里引用的所有的美國(guó)專利和公開的或未公布的美國(guó)專利申請(qǐng)通過引證在此并入本文。在這里引用的所有7>開的外國(guó)專利和專利申請(qǐng)通過引證在此并入本文。在這里引用的所有其他公開參考文件、文件、稿件和科學(xué)文獻(xiàn)通過引i正在此并入本文盡管本發(fā)明已經(jīng)通過其優(yōu)選的實(shí)施方案進(jìn)行了具體的顯示和描述，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不脫離本發(fā)明所附權(quán)利要求書范圍的情況下，可以在形勢(shì)和細(xì)節(jié)方面進(jìn)行多種變化。權(quán)利要求1.一種式(I)的前體核苷或其外消旋物、對(duì)應(yīng)異構(gòu)體、非對(duì)應(yīng)異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體、互變異構(gòu)體，其中，X＝缺失、O、NH、NR、S；X1＝缺失、O、NH；A＝缺失、芳基、芳烷基；n＝0，1，2，3，4，5；R＝烷基、取代的烷基、環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、雜環(huán)基、O-烷基、O-雜芳基、類固醇；R1、R2獨(dú)立地是H、OH、O-烷基、烷基、取代的烷基、環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、雜環(huán)基、O-芳基、O-雜芳基芳基、雜環(huán)基；R3選自氫、烷基、取代的烷基、C(O)-烷基、C(O)O-烷基、C(O)芳基、C(O)O-芳基、C(O)NH-烷基、和C(O)NH-芳基；Y和Z分別獨(dú)立地是O和S；B1和B2分別獨(dú)立的是腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、或修飾的核苷；m＝1到40。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的前體核苷酸，用式(II)所表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>(id其中，m是l、2或3;且R、X、X卜A、n、R,、R2、R3,B!和B2如權(quán)利要求1中的定義。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的前體核苦酸，用式(III)所表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>(iii)其中，R、X、Xt、A、n、R3、B，和B2如權(quán)利要求1中的定義,4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的前體核苦酸，用式(IV)所表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中，R4選自氫、氬、C(O)-烷基、C(0)O-烷基、C(O)-芳基、C(0)O-芳基、C(O)NH-烷基、C(O)NH-芳基；且R、R3、X、X,、A、和n如權(quán)利要求1中的定義。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的前體核苦酸，具有式(Al),選自表1的化合物1-8:表1:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中R、X。113和114是表1中所描述的<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>6.根據(jù)權(quán)利要求1的前體核苷酸，由式(v)所表示:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>(V)其中，R、R3、R4、X和X!、A和n如之前權(quán)利要求1的定義7.根據(jù)權(quán)利要求6的化合物，具有式B1，選自表2的化合物9-16:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中R、X,、R3、R4分別如表2中每個(gè)實(shí)施例的描述表2<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>8.根據(jù)權(quán)利要求1的前體核苷酸，由式(VI)所表示:9.在需要這種治療的患者體內(nèi)治療HBV的方法，包括對(duì)所述患者給藥一種治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物。10.在需要這種治療的患者體內(nèi)治療HBV的方法，包括對(duì)所述患者給藥一種與其他試劑相結(jié)合的治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求i所述的化合物。11.在需要這種治療的感染抗藥性HBV林的患者體內(nèi)治療HBV的方法，包括對(duì)所述患者單獨(dú)給藥一種治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，或與其他試劑相結(jié)合給藥。12.—種藥物組合物，包括與一種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑相結(jié)合的治療有效量的權(quán)利要求1所述化合物。13.在需要這種治療的患者體內(nèi)治療HBV的方法，包括對(duì)所述患者給藥一種治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物組合物。全文摘要本發(fā)明公開了式(I)化合物該化合物表現(xiàn)抗病毒活性。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包括上述化合物的藥物組合物，用于對(duì)需要抗-HBV治療的主體給藥。本發(fā)明還涉及通過給藥包含本發(fā)明化合物的藥物組合物治療主體內(nèi)HBV感染的方法。文檔編號(hào)C07H21/00GK101437397SQ200680050929公開日2009年5月20日申請(qǐng)日期2006年12月13日優(yōu)先權(quán)日2005年12月13日發(fā)明者R·P·依耶,S·帕德瑪那博漢申請(qǐng)人:斯普林銀行