專利名稱：一種檢測轉(zhuǎn)bar基因作物的核酸恒溫擴增試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基于BAR基因序列和核酸免疫試紙條的一種快速檢測轉(zhuǎn)BAR基因作物 的方法，尤指在反應(yīng)結(jié)束后無需任何儀器、而直接用核酸免疫試紙條簡單快速的對結(jié)果進 行判定的檢測轉(zhuǎn)BAR基因作物的核酸恒溫擴增方法和試劑盒。已有的專利是利用熒光PCR 對BAR基因進行檢測，需要昂貴的儀器設(shè)備，而且不利于現(xiàn)場快速檢測。我們通過選擇BAR 基因的一段特異性序列設(shè)計引物，利用恒溫擴增方法，而且采用核酸免疫試紙條對結(jié)果進 行檢測，反應(yīng)結(jié)束后直接用核酸免疫試紙條對結(jié)果進行檢測，無需任何特殊儀器，結(jié)果判讀 直觀、明確、快速，而且操作簡單、快速。適用于對轉(zhuǎn)BAR基因作物的簡單、快速檢測，可用于 檢測機構(gòu)實驗室對于進出口商品的標(biāo)識復(fù)驗，轉(zhuǎn)基因育種研究單位對轉(zhuǎn)基因作物田間快速 篩查等，屬于檢驗檢疫領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因技術(shù)使開發(fā)農(nóng)作物新品種的時間大為縮短，研究人員利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育 出了抗除草劑、抗干旱、耐鹽堿、抗重金屬和抗病蟲害、營養(yǎng)價值高的品種，這對于提高糧食 產(chǎn)量、減少收獲后損失以及增加農(nóng)產(chǎn)品營養(yǎng)價值具有重要作用。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，越 來越多的轉(zhuǎn)BAR基因作物新品種被培育出來。多個國家和地區(qū)相繼批準(zhǔn)了轉(zhuǎn)BAR基因作物 進入商業(yè)化生產(chǎn)，種植面積急劇擴大。然而轉(zhuǎn)BAR基因作物在帶來巨大社會和經(jīng)濟效益的 同時也存在許多問題，主要集中在轉(zhuǎn)基因食品的安全性及對生態(tài)環(huán)境的安全性方面。轉(zhuǎn)基因食品對人類健康及生態(tài)環(huán)境的潛在影響日益受到人們的普遍關(guān)注，轉(zhuǎn)基因 食品的安全性不容忽視。世界各國都在加強對轉(zhuǎn)基因食品的管理，歐盟、日本、加拿大都已 制定了對轉(zhuǎn)基因食品進行標(biāo)簽標(biāo)識管理的法規(guī)，歐盟(EC)49/2000號條例規(guī)定食品中含有 超過的轉(zhuǎn)基因成分時，必須在標(biāo)簽上做出標(biāo)識。為了加強對農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的安全管理，保障人體健康，規(guī)范轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的銷售 行為，引導(dǎo)和保護消費者的知情權(quán)，2002年中國農(nóng)業(yè)部頒布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識管理辦 法》，2006年通過了《中華人民共和國農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全法》，明確規(guī)定在中國境內(nèi)銷售列入標(biāo) 識的轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品，必須進行是否含有轉(zhuǎn)基因成分的標(biāo)識。轉(zhuǎn)基因作物標(biāo)識管理必 須以有效的檢測方法為基礎(chǔ)。因此，建立針對轉(zhuǎn)BAR基因作物快速檢測方法具有十分重要 的現(xiàn)實意義。目前國際上，對轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品采取的主要檢測方法是建立在核酸水平上的PCR檢 測，包括競爭 PCR (competitive PCR)、實時定量 PCR (Real-time PCR)、PCR-ELISA 方法；建 立在蛋白質(zhì)水平上的Western印記、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)和免疫試紙條的檢測方 法。由于這些方法存在操作步驟繁瑣，檢測時間較長；不適合于現(xiàn)場實時檢測和跟蹤檢測； 檢測成本過高；對檢驗人員的知識、操作水平和儀器水平要求過高等不足之處，方法較難普 及。Notomi等在2000年首次報道一種新的DNA擴增方法即DNA環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法 (loop-mediated isothermal amplification, LAMP) LAMP 法不需要常規(guī) PCR 必需的反復(fù)升溫解鏈過程，可在60 65°C恒溫條件下持續(xù)擴增，擴增效率高，幾十分鐘可達IO9 IOki 個拷貝，因此不需特殊設(shè)備，檢測時間更短、敏感性更高；同時6條特異性引物識別靶基因 的8個特定區(qū)域，特異性更高，因此在轉(zhuǎn)基因檢測上明顯優(yōu)于PCR。本發(fā)明首次基于BAR基因序列和核酸試紙條建立LAMP技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)BAR基因作 物的檢測，提供了針對轉(zhuǎn)BAR基因作物的BAR引物序列、試劑盒和檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是提供一組特異性強、靈敏度高的檢測轉(zhuǎn)BAR基因作物的核 苷酸序列。本發(fā)明的另一個目的是提供快速、準(zhǔn)確、便于結(jié)果判定，易于控制污染的檢測轉(zhuǎn) BAR基因作物的檢測試劑盒(基于核酸試紙條)。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案選擇BAR基因特定保守序列作為靶區(qū)域，在多重序列比對的基礎(chǔ)上，進行引物設(shè) 計。一組檢測轉(zhuǎn)BAR基因作物的核苷酸序列，如下1)5，-CGACCTCGTCCGTCTGCG-3，(SEQ ID NO 1)2)5，-CTGTGCCTCCAGGGACTTC-3，(SEQ ID NO 2)3)5，-TTGCGTGCCTTCCAGGGGCTTGGAGCGCTATCCCTGG-3，(SEQ ID NO 3)4)5，-ACGGCCGAGTCGACCGTGT-AGCAGGTGGGTGTAGAGC-3，(SEQ ID NO 4)5)5，-CCACCTCGGCGACGAG-3，(SEQ ID NO 5)6)5，-CACCAGCGGACGGGACT-3，(SEQ ID NO 6)其中序列1)和2)分別為BAR檢測的外引物F3和B3，序列3)和4)為BAR檢測的 內(nèi)引物FIP和BIP，序列5)和6)為BAR檢測的探針Df和Db，分別標(biāo)記熒光素和生物素。我們采用LAMP檢測技術(shù)建立了轉(zhuǎn)BAR基因作物檢測方法，對反應(yīng)的各種條件進行 了優(yōu)化，其中包括引物的篩選，主要組分使用濃度的優(yōu)化，以及對反應(yīng)后產(chǎn)物直接用核酸試 紙條進行檢測，得到以下試劑盒。檢測轉(zhuǎn)BAR基因的核酸恒溫擴增試劑盒，由以下組分組成1) LAMP反應(yīng)液，表1為LAMP反應(yīng)液配方。表1 LAMP反應(yīng)液配方 Betaine 購自 SIGMA 公司，IOX 緩沖液，0. lmol/L MgS04 購自 NEB 公司，IOmmol/ LdNTP購自Promega公司；引物委托大連寶生物生物工程有限公司合成，其中IOX緩沖液 的組成為500mM KClUOOmM Tris-HCl (pH9. 025°C ) U. 0% Triton X-100。2) Bst DNA 聚合酶，8U/ μ L，購自 NEB 公司。3)陰性對照滅菌雙蒸水。4)陽性對照為含有BAR基因片段的質(zhì)粒?；厥辙D(zhuǎn)BAR基因作物BAR基因PCR擴 增產(chǎn)物，與PGEM-T easy載體(購自Promega公司)進行連接，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，堿 裂解法提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR和酶切鑒定后獲得陽性重組質(zhì)粒，命名為PGEM-BAR。用滅菌雙 蒸水將純化質(zhì)粒進行稀釋，至質(zhì)?？截悢?shù)調(diào)整為IO6拷貝/μ 1，即為檢測轉(zhuǎn)BAR基因作物的 陽性對照品。208bp BAR目的片段基因序列如下1 CGACCTCGTC CGTCTGCGGG AGCGCTATCC CTGGCTCGTC GCCGAGGTGG ACGGCGAGGT61 CGCCGGCATC GCCTACGCGG GCCCCTGGAA GGCACGCAAC GCCTACGACT GGACGGCCGA121GTCGACCGTG TACGTCTCCC CCCGCCACCA GCGGACGGGA CTGGGCTCCA CGCTCTACAC181CCACCTGCTG AAGTCCCTGG AGGCACAG對合成的引物做HPLC分析，如得到單吸收峰圖譜、而且用紫外分光光度計測定 0D260nm/0D280nm的比值在1. 6-2. 0之間，即視為合格引物。從轉(zhuǎn)BAR基因大豆中提取的 DNA為模板進行擴增，結(jié)果顯示本發(fā)明提供的引物對擴增效果較好。用CTAB法提取轉(zhuǎn)BAR基因作物的DNA。由于引物、MgS04, Betaine，dNTP的濃度 以及反應(yīng)時間和溫度對LAMP反應(yīng)效率有一定影響，通過逐一優(yōu)化，確定了如下反應(yīng)體系和 條件(表2)，分別對轉(zhuǎn)BAR基因大豆核酸以及轉(zhuǎn)BAR基因棉花核酸進行檢測。反應(yīng)條件為 600C /lh，然后用核酸試紙條檢測。表2建立的LAMP反應(yīng)體系 1)樣本的處理取待檢樣品0. 2mg置于研缽中，用液氮磨至粉狀，加入700μ L65°C 水浴預(yù)熱的2% CTAB抽提緩沖液，輕輕攪動，將磨碎液倒入1. 5ml的滅菌離心管中，65°C水浴30min，編號備用。處理的樣本在2V 8°C條件下保存應(yīng)不超過24h ；若需長期保存，須 放置-70°C冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融(最多凍融2次)。2) DNA的提取在樣本處理區(qū)進行。1.1取η個1.5ml滅菌離心管(η=樣本數(shù))，作好標(biāo)記。首先加入600yL氯仿-異 戊醇(24 1)，然后加入600 μ L處理好的待測樣本(一份樣本換用一個吸頭)，混勻器上 振蕩混勻5sec (不宜過于強烈，以免產(chǎn)生乳化層，也可用手顛倒混勻)。陰性對照、陽性對照 無需處理，直接使用。1.2 12，OOOg離心IOmin(如有條件，于4°C進行離心)。取與上步中相同數(shù)量的 1.5ml滅菌離心管，加入500 μ L異丙醇(_20°C預(yù)冷)，作好標(biāo)記。1. 3吸取步驟1. 2各管中的上清液相轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，顛倒混勻。1. 4 12，OOOg離心lOmin。輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，沾干液體(不同樣品 應(yīng)在吸水紙不同地方沾干)；加入600 μ L 75%乙醇(_20°C預(yù)冷)，顛倒洗滌。1. 5 12，OOOg離心5min。輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體。4，OOOg 離心lOsec，將管壁上的殘余液體甩到管底部，用微量加樣器盡量將其吸干(一份樣本換 用一個吸頭，注意吸頭不要碰到有沉淀一面)，室溫干燥3min (不宜過于干燥，以免DNA不 溶)。1.6加入50 μ L 0. IX TE (含RNase)緩沖液，輕輕混勻，溶解管壁上的DNA，2，OOOg 離心5sec，4°C保存?zhèn)溆茫粜栝L期保存，請保存于-20°C。3) LAMP擴增從試劑盒中取出LAMP反應(yīng)液、8U/ μ L Bst DNA聚合酶，在室溫下融 化后，2，OOOg離心5sec。設(shè)所需LAMP管數(shù)為η (η =樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)， 每個測試反應(yīng)體系需要17 μ L LAMP反應(yīng)液和1 μ L Bst DNA聚合酶。計算好各試劑的使用 量，加入一適當(dāng)體積試管中，向每個管中各分裝18 μ L，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。在各設(shè)定的管中 分別加入制備的DNA溶液各2 μ L，蓋緊管蓋，于4，OOOg離心5sec。60°C /Ih04)結(jié)果的判定可用核酸試紙條對產(chǎn)物進行檢測。也可對產(chǎn)物進行電泳進行結(jié)果 判定。核酸試紙條判定陰性對照只有一條紫色的線；陽性對照有兩條紫色的線。檢測 樣品顯示兩條紫線的為陽性，否則為陰性。電泳判定需要用1.5%瓊脂糖進行凝膠電泳，如出現(xiàn)特定的梯狀條帶，判為陽 性，否則判為陰性。本發(fā)明的優(yōu)點和創(chuàng)新之處在于1)快速檢測時間僅為1-1. 5小時；2)特異由于采用了針對8個區(qū)域的4條特異性引物和2條特異性探針，引物多 聚體及非特異性擴增幾率大大降低，從而使結(jié)果準(zhǔn)確性大大提高；與其他轉(zhuǎn)基因作物未發(fā) 現(xiàn)交叉反應(yīng)；3)靈敏該方法的擴增效率非常高，比傳統(tǒng)的PCR方法靈敏度高100-1000倍；用 所建立的方法對以10倍梯度稀釋的PGEM-BAR質(zhì)粒進行檢測，結(jié)果表明稀釋到10個拷貝仍 為陽性；4)反應(yīng)成本低采用一次性核酸試紙條進行檢測，不需任何特殊設(shè)備，而直接根 據(jù)核酸試紙條顯色進行判斷，結(jié)果更加直觀，比PCR簡單，且成本大大降低，因此極易推廣；
5)穩(wěn)定重復(fù)性試驗結(jié)果顯示所建立方法的穩(wěn)定性良好。下面結(jié)合說明書附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步說明。


圖1為轉(zhuǎn)Bar基因作物核酸恒溫擴增檢測方法陰陽性核酸試紙條判定(左邊2根 試紙條為陽性，右邊2根試紙條為陰性)。圖2為轉(zhuǎn)Bar基因作物核酸恒溫擴增檢測方法陰陽性電泳判定(左邊2個泳道為 陽性，右邊2個泳道為陰性)。
具體實施例方式實施例1、試劑盒的配制和使用1、試劑盒的配制組成，見表3。表3試劑盒配制組成 2、試劑盒的使用方法2. 1 DNA 提取1. 1取η個1.5ml滅菌離心管(η =樣本數(shù))，作好標(biāo)記。首先加入600 μ L氯仿-異 戊醇(24 1)，然后加入600 μ L處理好的待測樣本(一份樣本換用一個吸頭)，混勻器上 振蕩混勻5sec (不宜過于強烈，以免產(chǎn)生乳化層，也可用手顛倒混勻)。陰性對照、陽性對照 無需處理，直接使用。1.2 12，OOOg離心IOmin (如有條件，于4°C進行離心)。取與上步中相同數(shù)量的 1.5ml滅菌離心管，加入500 μ L異丙醇(_20°C預(yù)冷)，作好標(biāo)記。1. 3吸取步驟1. 2各管中的上清液相轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，顛倒混勻。1. 4 12，OOOg離心lOmin。輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，沾干液體(不同樣品 應(yīng)在吸水紙不同地方沾干)；加入600 μ L 75%乙醇(_20°C預(yù)冷)，顛倒洗滌。1. 5 12，OOOg離心5min。輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體。4，OOOg 離心lOsec，將管壁上的殘余液體甩到管底部，用微量加樣器盡量將其吸干(一份樣本換 用一個吸頭，注意吸頭不要碰到有沉淀一面)，室溫干燥3min (不宜過于干燥，以免DNA不 溶)。1.6加入50 μ L 0. IX TE (含RNase)緩沖液，輕輕混勻，溶解管壁上的DNA，2，OOOg 離心5sec，4°C保存?zhèn)溆?，若需長期保存，請保存于-20°C。3) LAMP擴增從試劑盒中取出LAMP反應(yīng)液、8U/ μ L Bst DNA聚合酶，在室溫下融 化后，2，OOOg離心5sec。設(shè)所需LAMP管數(shù)為η (η =樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)， 每個測試反應(yīng)體系需要17 μ L LAMP反應(yīng)液和1 μ L Bst DNA聚合酶。計算好各試劑的使用 量，加入一適當(dāng)體積試管中，向每個管中各分裝18 μ L，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。在各設(shè)定的管中分別加入制備的DNA溶液各2 μ L，蓋緊管蓋，于4，OOOg離心5sec。60°C /Ih04)結(jié)果的判定可用核酸試紙條對產(chǎn)物進行檢測。也可對產(chǎn)物進行電泳進行結(jié)果 判定。核酸試紙條判定陰性對照只有一條紫色的線；陽性對照有兩條紫色的線。檢測 樣品顯示兩條紫線的為陽性，否則為陰性。電泳判定需要用1.5%瓊脂糖進行凝膠電泳，如出現(xiàn)特定的梯狀條帶，判為陽 性，否則判為陰性。
權(quán)利要求
一組基于核酸試紙條的檢測轉(zhuǎn)BAR基因作物的核苷酸序列，如下1)5’ CGACCTCGTCCGTCTGCG 3’(SEQ ID NO1)2)5’ CTGTGCCTCCAGGGACTTC 3’(SEQ ID NO2)3)5’ TTGCGTGCCTTCCAGGGGCTTGGAGCGCTATCCCTGG 3’(SEQ I D NO3)4)5’ ACGGCCGAGTCGACCGTGT AGCAGGTGGGTGTAGAGC 3’(SEQ ID NO4)5)5’ CCACCTCGGCGACGAG 3’(SEQID NO5)6)5’ CACCAGCGGACGGGACT 3’(SEQID NO6)其中序列1)和2)分別為BAR檢測的外引物F3和B3，序列3)和4)為BAR檢測的內(nèi)引物FIP和BIP，序列5)和6)為BAR檢測的探針Df和Db，分別標(biāo)記熒光素和生物素。
2.一種基于核酸試紙條可簡單快速進行結(jié)果判定的轉(zhuǎn)BAR基因作物檢測試劑盒， 48tests/盒，由以下組分組成1)LAMP反應(yīng)液，分別為850yLXl管，含有IX緩沖液、Betaine、MgS04、dNTP、引物F3 和B3、引物FIP和BIP以及探針Db和Df ；2)Bst DNA 聚合酶 8U/μ L，50 μ LXl 管；3)滅菌雙蒸水，lmLX2管；4)陰性對照=ImLXl管，滅菌雙蒸水；5)陽性對照lmLX2管，為含有BAR基因片段的質(zhì)粒。回收轉(zhuǎn)BAR基因作物BAR基因 PCR擴增產(chǎn)物，與PGEM-T easy載體(購自Promega公司)進行連接，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細 胞，堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR和酶切鑒定后獲得陽性重組質(zhì)粒，命名為PGEM-BAR。用 滅菌雙蒸水將純化質(zhì)粒進行稀釋，至質(zhì)?？截悢?shù)調(diào)整為IO6拷貝/μ 1，即為檢測轉(zhuǎn)BAR基因 作物的陽性對照品。6)核酸試紙條48tests。208bp BAR目的片段基因序列如下1 CGACCTCGTC CGTCTGCGGG AGCGCTATCC CTGGCTCGTC GCCGAGGTGG ACGGCGAGGT61 CGCCGGCATC GCCTACGCGG GCCCCTGGAA GGCACGCAAC GCCTACGACT GGACGGCCGA121GTCGACCGTG TACGTCTCCC CCCGCCACCA GCGGACGGGA CTGGGCTCCA CGCTCTACAC181CCACCTGCTG AAGTCCCTGG AGGCACAG
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)BAR基因作物檢測試劑盒，其特征在于所述檢測BAR基 因引物序列為1)5，-CGACCTCGTCCGTCTGCG-3，(SEQID NO 1)2)5，-CTGTGCCTCCAGGGACTTC-3，(SEQID NO 2)3)5，-TTGCGTGCCTTCCAGGGGCTTGGAGCGCTATCCCTGG-3’(SEQID NO 3)4)5，-ACGGCCGAGTCGACCGTGT-AGCAGGTGGGTGTAGAGC-3’(SEQ ID NO 4)5)5，-CCACCTCGGCGACGAG-3，(SEQIDNO 5)6)5，-CACCAGCGGACGGGACT-3，(SEQID NO 6)其中序列1)和2)分別為BAR檢測的外引物F3和B3，序列3)和4)為BAR檢測的內(nèi)引 物FIP和BIP，序列5)和6)為BAR檢測的探針Df和Db，分別標(biāo)記熒光素和生物素。
全文摘要
一種檢測轉(zhuǎn)Bar基因作物的核酸恒溫擴增試劑盒及方法公開了一組檢測轉(zhuǎn)Bar基因作物的核苷酸序列，如下1)5’-CGACCTCGTCCGTCTGCG-3’(SEQ ID NO1)，2)5’-CTGTGCCTCCAGGGACTTC-3’(SEQ ID NO2)，3)5’-TTGCGTGCCTTCCAGGGGCTTGGAGCGCTATCCCTGG-3’(SEQ ID NO3)，4)5’-ACGGCCGAGTCGACCGTGT-AGCAGGTGGGTGTAGAGC-3’(SEQ ID NO4)，5)5’-CCACCTCGGCGACGAG-3’(SEQ ID NO5)，6)5’-CACCAGCGGACGGGACT-3’(SEQID NO6)并提供了一種基于核酸恒溫擴增及核酸試紙條，可簡單、快速進行結(jié)果判定的轉(zhuǎn)Bar基因作物檢測試劑盒，屬于檢驗檢疫領(lǐng)域。適用于對轉(zhuǎn)Bar基因作物的簡單、快速檢測，可用于檢測機構(gòu)實驗室對進出口商品的標(biāo)識復(fù)驗，轉(zhuǎn)基因育種研究單位對轉(zhuǎn)基因作物田間快速篩查等。本發(fā)明優(yōu)點是1)快速檢測時間僅為1-1.5小時；2)特異；3)靈敏；4)反應(yīng)成本低僅需一個普通的水浴鍋；5)穩(wěn)定。
文檔編號C12N15/11GK101906474SQ20101023335
公開日2010年12月8日 申請日期2010年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月22日
發(fā)明者喬彩霞, 凌鳳俊, 劉輝, 吳丹, 周琦, 張偉, 張利峰, 張向東, 張瑞宏, 李東燕, 柏亞鐸, 段向英, 汪琳, 羅英, 蒲靜, 谷強, 賴平安, 高志強, 齊瑋 申請人:中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局;物思科技發(fā)展(北京)有限公司