一種新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)以及其制備方法，該基因遞送系統(tǒng)包括磷酸鈣及PEG接枝羧甲基殼聚糖，磷酸鈣包裹基因形成內(nèi)核，PEG接枝羧甲基殼聚糖包覆于內(nèi)核表面，PEG鏈段形成親水性外殼，從而形成具有PEG化核殼結(jié)構(gòu)的納米粒子，該納米粒子的粒徑為60～100nm。本發(fā)明的新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)，在制備過程中無需使用有機溶劑、表面催化劑，過程簡單可控，經(jīng)濟成本低，重復性好，適合于大規(guī)模生產(chǎn)，毒性低，轉(zhuǎn)染效率高。另外，本發(fā)明還涉及制備該基因遞送系統(tǒng)的試劑盒，以及本發(fā)明基因遞送系統(tǒng)的體內(nèi)外基因轉(zhuǎn)染與基因治療的用途。
【專利說明】一種新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及藥物制劑領(lǐng)域和生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體來說涉及一種新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著基因工程、納米技術(shù)、現(xiàn)代醫(yī)藥技術(shù)等學科的發(fā)展，從基因水平治療疾病正在成為一種極具前途的治療手段?；蛑委熓峭ㄟ^將核酸(DNA，siRNA，miRNA)導人組織和細胞，調(diào)控涉及疾病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵蛋白的表達，從而達到疾病治療的目的。但核酸分子由于其分子量大、帶負電性、親水的特征，不能有效進入細胞；另外，核酸分子極易被血漿蛋白中的核酸酶降解。所以核酸分子需要由載體包載才能實現(xiàn)給藥治療的目的。
[0003]將核酸導入細胞進行表達是實現(xiàn)基因治療的關(guān)鍵步驟，成功的基因治療依賴于有效的基因載體。常見的載體分為病毒類載體和非病毒載體，其中，病毒類載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒(AV)、腺相關(guān)病毒(AAV)、單純皰疹病毒(HSV)、痘苗病毒(VV)等，但是病毒類載體容易引起人體的免疫性反應，在臨床應用中存在著較大的安全隱患。非病毒載體主要是由陽離子聚合物或脂質(zhì)與核酸通過靜電吸附制備得到得到的陽離子載體，與病毒載體相t匕，非病毒載體具有安全、有效、無免疫原性等優(yōu)點。陽離子載體能有效包裹核酸，促進核酸進入細胞。但陽離子非病毒載體通常有由于陽離子特性帶來的細胞毒性，且易于在血漿中沉淀，從而抑制其體內(nèi)的給藥治療。
[0004]磷酸鈣沉淀法廣泛用于細胞轉(zhuǎn)染，磷酸鈣有良好的生物相容性、生物降解性，并且能夠有效的包載核酸分子。另外，磷酸鈣具有酸敏感性，在溶酶體酸性環(huán)境下，磷酸鈣解離得到鈣離子、磷酸根離子，增加溶酶體滲透壓，促進溶酶體膜破裂，促使核酸分子實現(xiàn)溶酶體逃逸。但磷酸鈣的膠體穩(wěn)定性差，制備后快速沉淀，缺乏制備的重復性；沉淀的磷酸鈣粒子且會引起細胞毒性。膠體穩(wěn)定性差阻止了磷酸鈣的體內(nèi)應用。
[0005]制備穩(wěn)定的磷酸鈣納米粒子成為實現(xiàn)核酸體內(nèi)安全、有效遞送的有效途徑。LeafHuang等制備了脂質(zhì)體包裹的磷酸鈣雜化納米粒，實現(xiàn)了靜脈注射后核酸的系統(tǒng)遞送，他們采用的是反向微乳法制備了穩(wěn)定的脂質(zhì)包覆磷酸鈣納米粒(Li J, Chen YC, TsengYC,Mozumdar S，Huang L.Biodegradable calcium phosphate nanoparticle,withlipid coating for systemic siRNA delivery.Journal of control ledrelease.2010; 142:416-21.)。中國專利申請(200910264114.6)授權(quán)了 “一種載有基因的磷酸鈣復合納米粒及其制法與用途”，也采用了微乳法制備磷酸鈣納米粒。但這種制備方法相對復雜且用到了有潛在毒性的有機溶劑和表面活性劑，不利于擴大生產(chǎn)。
[0006]于是，我們嘗試開發(fā)一種新型的雜化納米磷酸鈣基因載體，該載體具有制備簡單、經(jīng)濟成本低、使用方便、轉(zhuǎn)染效率高、生物相容性好、可用于體內(nèi)注射給藥等綜合優(yōu)勢，這對基因治療的發(fā)展有重大意義。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明的目的在于開發(fā)一種新型的基因遞送系統(tǒng)，提高基因的體內(nèi)外轉(zhuǎn)染效率，促進基因治療的發(fā)展。
[0008]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0009]一種新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)，包括磷酸鈣及PEG接枝羧甲基殼聚糖，其特征在于，磷酸鈣包裹基因形成內(nèi)核，PEG接枝羧甲基殼聚糖包覆于內(nèi)核表面，PEG鏈段形成親水性外殼，從而形成具有PEG化核殼結(jié)構(gòu)的納米粒子，其中所述PEG接枝羧甲基殼聚糖的粘均分子量為I~100萬，脫乙酰度大于80%，羧甲基取代度為20~90%，PEG分子量為500~10000，PEG接枝率為8%~60%，并且該納米粒子的粒徑為60~lOOnm。
[0010]優(yōu)選地，所述PEG接枝羧甲基殼聚糖的粘均分子量為10~40萬，脫乙酰度大于80%，羧甲基取代度為40~70%，PEG分子量為2000~6000，PEG接枝率為20%~40%。
[0011]本發(fā)明更提供一種制備新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)的方法，包括以下步驟:
[0012]I)制備試劑a，包含鈣鹽、緩沖劑，余量為水； [0013]2)制備試劑b，包含PEG接枝羧甲基殼聚糖、磷酸鹽、氯化鈉、緩沖劑，余量為水；
[0014]3)將基因與試劑a混合，再與試劑b等體積混合均勻，
[0015]其特征在于，
[0016]在所述試劑a中，鈣鹽為CaCl2Xa(NO3)2中的一種或兩種任意比例的組合，緩沖劑為H印es、MOPS、PBS、PIPES、Tris的一種或兩種以上的任意比例組合；
[0017]在所述b試劑中，PEG接枝羧甲基殼聚糖的粘均分子量為I~100萬，脫乙酰度大于80%，羧甲基取代度為20~90%，PEG分子量為500~10000，PEG接枝率為8%~60% ;磷酸鹽包括 Na3P04、Na2HPO4, NaH2PO4, K3PO4, K2HPO4, KH2PO4, (NH4)3P04、(MM)2HPO4 的一種或兩種以上的任意比例組合；緩沖劑為H印es、MOPS、PBS、PIPES、Tris中的一種或兩種以上的任意比例組合。
[0018]優(yōu)選地，試劑a中的鈣鹽為CaCl2或Ca(NO3)2,緩沖劑為Ifepes或Tris ;試劑b中的PEG接枝羧甲基殼聚糖的粘均分子量為10~40萬，脫乙酰度大于80%，羧甲基取代度為40~70%，PEG分子量為2000~6000，PEG接枝率為20%~40% ;磷酸鹽為Na2HPO4或NaH2PO4 ；緩沖劑為ifepes或Tris。
[0019]優(yōu)選地，基因與試劑a混合時的基因質(zhì)量(μ g)與試劑a體積(mL)的比例為10~200 μ g/mL。
[0020]更優(yōu)選地，基因質(zhì)量(μ g)與試劑a體積(mL)的比例為40~120 μ g/mL。
[0021]作為優(yōu)選方案，所述a試劑中的鈣鹽濃度為20~1000mM,緩沖劑濃度為5~200mM，pH為6.0~10.0 ;所述b試劑中的PEG接枝羧甲基殼聚糖濃度為50~2000mg/L，磷酸鹽濃度為0.5~10mM，NaCl濃度為50~500mM，緩沖劑濃度為5~200mM，pH為6.0~
10.0。
[0022]進一步優(yōu)選地，所述a試劑中的鈣鹽濃度為100~300mM，緩沖劑濃度為20~60mM，pH為7.0~8.0 ;所述b試劑中的PEG接枝羧甲基殼聚糖濃度為200~800mg/L，磷酸鹽濃度為1.5~3.0mM, NaCl濃度為100~300mM，緩沖劑濃度為20~60mM，pH為7.0~
8.0。
[0023]另一方面，本發(fā)明提供上述新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)用于體內(nèi)外細胞的基因轉(zhuǎn)染以及人或動物體內(nèi)基因藥物輸送的用途，其中所述基因是DNA、siRNA、miRNA或shRNA中的任一或多種。
[0024]本發(fā)明還提供一種試劑盒，用于制備上述新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)，所述試劑盒包含鈣鹽或其包含緩沖劑的水溶液；以及PEG接枝羧甲基殼聚糖、磷酸鹽、氯化鈉或者其包含緩沖劑的混合水溶液，其特征在于，鈣鹽或其包含緩沖劑的水溶液與PEG接枝羧甲基殼聚糖、磷酸鹽、氯化鈉或者其包含緩沖劑的混合水溶液是分開獨立包裝的，其中鈣鹽為CaCl2、Ca(NO3)2中的一種或兩種任意比例的組合；PEG接枝羧甲基殼聚糖的粘均分子量為I~100萬，脫乙酰度大于80%，羧甲基取代度為20~90%，PEG分子量為500~10000，PEG 接枝率為 8% ~60% ;磷酸鹽為 Na3P04、Na2HPO4、NaH2P04、K3PO4、K2HPO4、KH2PO4、(NH4)3P04、(MM)2HPO4中的一種或兩種以上的任意比例組合；緩沖劑為H印es、MOPS、PBS、PIPES、Tris中的一種或兩種以上的任意比例組合。
[0025]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:
[0026]生產(chǎn)過程不使用有機溶劑、表面催化劑，過程簡單可控，經(jīng)濟成本低，重復性好，適合于大規(guī)模生產(chǎn)；載體穩(wěn)定性好，安全性好，體內(nèi)外毒性極低；轉(zhuǎn)染效率高，能有效實現(xiàn)體內(nèi)外的基因遞送，實現(xiàn)基因治療。該載體具有制備簡單、經(jīng)濟成本低、使用方便可靠、轉(zhuǎn)染效率高、生物相容性好、可用于體內(nèi)注射給藥的優(yōu)點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1:本發(fā)明的新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)的透射電鏡照片。 [0028]圖2:本發(fā)明的新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)的細胞轉(zhuǎn)染效果。
[0029]圖3:本發(fā)明的新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)的細胞毒性(MTT法)結(jié)果。
[0030]圖4:本發(fā)明的新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)的體內(nèi)基因治療給藥的治療效
果O
[0031]圖5:本發(fā)明的新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)的免疫毒性。
【具體實施方式】
[0032]羧甲基殼聚糖是一種水溶性陰離子殼聚糖衍生物，具有良好的生物相容性和生物降解性，能夠通過靜電作用有效吸附于正電性磷酸鈣粒子表面，達到穩(wěn)定磷酸鈣粒子的目的。另外，PEG化也能夠通過屏蔽作用穩(wěn)定納米載體，延長循環(huán)時間，達到長循環(huán)效果增加療效。因此，PEG接枝羧甲基殼聚糖擁有穩(wěn)定磷酸鈣并得到雜化納米粒的潛力，從而實現(xiàn)核酸的安全、有效的體內(nèi)遞送，實現(xiàn)疾病的基因治療。另外，通過PEG接枝羧甲基殼聚糖與磷酸鈣的納米沉淀作用，自組裝形成納米粒子，更簡化了制備生產(chǎn)過程。
[0033]本發(fā)明提供了一種新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)，克服了現(xiàn)有技術(shù)的缺點，提高了基因的體內(nèi)外轉(zhuǎn)染效率，促進基因治療的發(fā)展。該載體具有制備簡單、經(jīng)濟成本低、使用方便可靠、轉(zhuǎn)染效率高、生物相容性好、可用于體內(nèi)注射給藥的優(yōu)點。
[0034]一方面，本發(fā)明的新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)包括磷酸鈣、PEG接枝羧甲基殼聚糖兩種組分；核殼結(jié)構(gòu)，磷酸鈣形成內(nèi)核，PEG接枝羧甲基殼聚糖包覆于內(nèi)核表面，PEG鏈段形成親水性外殼；粒徑為60~lOOnm。
[0035]所述新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)能包載的基因分子包括DNA、siRNA、miRNA、shRNA,基因分子被包載于磷酸鈣內(nèi)核中。
[0036]另一方面，制備本發(fā)明的新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)的方法包括如下步驟:
[0037]I)制備試劑a，包含鈣鹽、緩沖劑的水溶液；
[0038]2)制備試劑b，包含PEG接枝羧甲基殼聚糖、磷酸鹽、氯化鈉、緩沖劑的水溶液。
[0039]3)基因先與試劑a混合，再與試劑b等體積混合均勻。
[0040]在所述a試劑中，鈣鹽為包括CaCl2、Ca (NO3) 2的一種或兩種任意比例的組合，緩沖劑為H印es、MOPS、PBS、PIPES、Tris的一種或兩種以上的任意比例組合。
[0041]在所述b試劑中，PEG接枝羧甲基殼聚糖的粘均分子量為I~100萬，脫乙酰度大于80%，羧甲基取代度為20~90%，PEG分子量為500~10000，PEG接枝率為8%~60% ;磷酸鹽，包括 Na3P04、Na2HP04、NaH2PO4、K3PO4> K2HPO4、KH2PO4、(NH4) 3P04、(NH4) 2ΗΡ04 的一種或兩種以上的任意比例組合；緩沖劑為H印es、MOPS、PBS、PIPES、Tris的一種或兩種以上的任意比例組合。
[0042]作為優(yōu)選方案，鈣鹽為CaCl2或Ca(NO3)2，緩沖劑為Ifepes或Tr is。
[0043]作為優(yōu)選方案，PEG接枝羧甲基殼聚糖的粘均分子量為10~40萬，脫乙酰度大于80%，羧甲基取代度為40~70%，PEG分子量為2000~6000，PEG接枝率為20%~40% ;磷酸鹽為 Na2HPO4 或 NaH2PO4 ;緩沖劑為 Ifepes 或 Tris。
[0044]進一步，在所述a試劑中，鈣鹽濃度為20~1000mM,緩沖劑濃度為5~200mM，pH為6.0~10.0 ;在所述b試劑中，PEG接枝羧甲基殼聚糖濃度為50~2000mg/L，磷酸鹽濃度為0.5~10mM，NaCl濃度為50~500mM，緩沖劑濃度為5~200mM，pH為6.0~10.0。
[0045]進一步，作為優(yōu)選方案，在所述a試劑中，鈣鹽濃度為100~300mM，緩沖劑濃度為20~60mM，pH為7.0~8.0 ;在所述b試劑中，PEG接枝羧甲基殼聚糖濃度為200~800mg/L，磷酸鹽濃度為1.5~3.0mM, NaCl濃度為100~300mM，緩沖劑濃度為20~60mM，pH為
7.0 ~8.0。
[0046]在所述新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)的制備方法步驟(3)中，基因先與試劑a混合時基因質(zhì)量(μ g)與試劑a體積(mL)的比例為10~200 μ g/mL ;作為優(yōu)選方案，基因質(zhì)量(μ g)與試劑a體積(mL)的比例為40~120 μ g/mL。
[0047]另一方面，提供所述新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)的用途，在于體內(nèi)外細胞的基因轉(zhuǎn)染以及人或動物體內(nèi)基因藥物輸送；其中所述基因為DNA、siRNA、miRNA、shRNA中的任一或多種。
[0048]另一方面，本發(fā)明提供一種用于所述新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)制備的試劑盒，該試劑盒含有獨立包裝的a、b兩種試劑:試劑a，包含鈣鹽、緩沖劑的水溶液；試劑b，包含PEG接枝羧甲基殼聚糖、磷酸鹽、氯化鈉、緩沖劑的水溶液。
[0049]所述試劑盒的a試劑中，鈣鹽為包括CaCl2、Ca(NO3)2的一種或兩種任意比例的組合，緩沖劑為H印es、MOPS、PBS、PIPES、T ris的一種或兩種以上的任意比例組合。
[0050]所述試劑盒的b試劑中，PEG接枝羧甲基殼聚糖的粘均分子量為I~100萬，脫乙酰度大于80%，羧甲基取代度為20~90%，PEG分子量為500~10000，PEG接枝率為8%~60% ;磷酸鹽，包括 Na3P04、Na2HP04、NaH2P04、K3P04、K2HP04、KH2P04、(NH4)3P04、(MM)2HPO4 的一種或兩種以上的任意比例組合；緩沖劑為H印es、M0PS、PBS、PIPES、Tris的一種或兩種以上的任意比例組合。
[0051]作為所述試劑盒的優(yōu)選方案，鈣鹽為CaCl2或Ca(NO3)2，緩沖劑為Ifepes或Tris。
[0052]更優(yōu)選地，所述試劑盒中的PEG接枝羧甲基殼聚糖的粘均分子量為10~40萬，脫乙酰度大于80%，羧甲基取代度為40~70%，PEG分子量為2000~6000，PEG接枝率為20%~40% ;磷酸鹽為Na2HPO4或NaH2PO4 ;緩沖劑為Ifepes或Tris。
[0053]在所述試劑盒的試劑可以是濃縮物，待配制后使用，也可以即開即用。在一種實施方案中，a試劑中的鈣鹽濃度為20~1000mM,緩沖劑濃度為5~200mM，pH為6.0~10.0 ;b試劑中的PEG接枝羧甲基殼聚糖濃度為50~2000mg/L，磷酸鹽濃度為0.5~10mM，NaCl濃度為50~500mM，緩沖劑濃度為5~200mM，pH為6.0~10.0。
[0054]作為該實施方案的優(yōu)選方案，a試劑中的鈣鹽濃度為100~300mM，緩沖劑濃度為20~60mM，pH為7.0~8.0 ;b試劑中的PEG接枝羧甲基殼聚糖濃度為200~800mg/L，磷酸鹽濃度為1.5~3.0mM, NaCl濃度為100~300mM，緩沖劑濃度為20~60mM，pH為7.0~
8.0。
[0055]本發(fā)明的新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)與現(xiàn)有技術(shù)相比，生產(chǎn)過程不使用有機溶劑、表面催化劑，過程簡單可控，經(jīng)濟成本低，重復性好，適合于大規(guī)模生產(chǎn)；載體穩(wěn)定性好,安全性好,體內(nèi)外毒性極低；并且轉(zhuǎn)染效率高,能有效的體內(nèi)外的基因傳遞,實現(xiàn)基因治療。
[0056]以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的闡述。
[0057]實施例1:一種新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)的制備。
[0058]I)制備試劑a，含有CaCl2為250mM、Tris為20mM的水溶液，鹽酸調(diào)節(jié)pH為7.4 ;
[0059]2)制備試劑b，含有PEG接枝羧甲基殼聚糖的濃度為200mg/L、Na2HPO4濃度為1.5mM、NaCl濃度為280mM、Hepes濃度為50mM的水溶液，NaOH調(diào)節(jié)pH為7.4 ;
[0060]3)取40 μ g基因DNA分子與ImL試劑混合，再與試劑b快速混合均勻，即制備得到雜化納米磷酸鈣的基因轉(zhuǎn)染載體。
[0061]實施例2:—種新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)的制備。
[0062]I)制備試劑a，含有CaCl2為250mM、Tris為20mM的水溶液，鹽酸調(diào)節(jié)pH為7.4 ;
[0063]2)制備試劑b，含有PEG接枝羧甲基殼聚糖的濃度為200mg/L、Na2HPO4濃度為1.5mM、NaCl濃度為280mM、Hepes濃度為50mM的水溶液，NaOH調(diào)節(jié)pH為7.4 ;
[0064]3)取120 μ g基因DNA分子與ImL試劑混合，再與試劑b快速混合均勻，即制備得到雜化納米磷酸鈣的基因轉(zhuǎn)染載體。
[0065]實施例3:—種新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)的制備。
[0066]I)制備試劑a，含有CaCl2為250mM、Tris為20mM的水溶液，鹽酸調(diào)節(jié)pH為7.4 ;
[0067]2)制備試劑b，含有PEG接枝羧甲基殼聚糖的濃度為200mg/L、Na2HPO4濃度為1.5mM、NaCl濃度為280mM、Hepes濃度為50mM的水溶液，NaOH調(diào)節(jié)pH為7.4 ;
[0068]3)取80 μ g基因DNA分子與ImL試劑混合，再與試劑b快速混合均勻，即制備得到雜化納米磷酸鈣的基因轉(zhuǎn)染載體。
[0069]實施例4:一種新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)的制備。
[0070]I)制備試劑a，含有CaCl2為250mM、Tris為20mM的水溶液，鹽酸調(diào)節(jié)pH為7.4 ;
[0071]2)制備試劑b，含有PEG接枝羧甲基殼聚糖的濃度為800mg/L、Na2HPO4濃度為1.5mM、NaCl濃度為280mM、Hepes濃度為50mM的水溶液，NaOH調(diào)節(jié)pH為7.4 ;
[0072]3)取80 μ g基因DNA分子與ImL試劑混合，再與試劑b快速混合均勻，即制備得到雜化納米磷酸鈣的基因轉(zhuǎn)染載體。
[0073]實施例5:—種新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)的制備。
[0074]I)制備試劑a，含有CaCl2為250mM、Tris為20mM的水溶液，鹽酸調(diào)節(jié)pH為7.4 ;
[0075]2)制備試劑b，含有PEG接枝羧甲基殼聚糖的濃度為400mg/L、Na2HPO4濃度為1.5mM、NaCl濃度為280mM、Hepes濃度為50mM的水溶液，NaOH調(diào)節(jié)pH為7.4 ;
[0076]3)取80 μ g基因siRNA分子與ImL試劑混合,再與試劑b快速混合均勻，即制備得到雜化納米磷酸鈣的基因轉(zhuǎn)染載體。
[0077]實施例6:—種新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)的制備。
[0078]I)制備試劑a，含有CaCl2為250mM、Tris為20mM的水溶液，鹽酸調(diào)節(jié)pH為7.4 ;
[0079]2)制備試劑b，含有PEG接枝羧甲基殼聚糖的濃度為800mg/L、Na2HPO4濃度為
1.5mM、NaCl濃度為280mM、Hepes濃度為50mM的水溶液，NaOH調(diào)節(jié)pH為7.4 ;
[0080]3)取80 μ g基因miRNA分子與ImL試劑混合,再與試劑b快速混合均勻，即制備得到雜化納米磷酸鈣的基 因轉(zhuǎn)染載體。
[0081]如附圖1所示，本發(fā)明的新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)為均勻分布的球形，粒徑為60~lOOnm。
[0082]實施例7:—種新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)的細胞轉(zhuǎn)染。
[0083]取生長對數(shù)期H印G2細胞鋪板于24孔板，生長24h后，細胞匯合度為50~60%。載有靶向hTERT基因的siRNA的本發(fā)明新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)細胞給藥，每孔siRNA濃度為0.5 μ g。轉(zhuǎn)染48h后，提取RNA，RT-PCR測量hTERT基因的表達。Lipofectamine2000以相同siRNA濃度轉(zhuǎn)染細胞，作為對照。
[0084]如附圖2所示，載有靶向hTERT基因siRNA的本發(fā)明新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)染效率與市售制劑Lipofectamine2000相當。
[0085]實施例8 =MTT法測量本發(fā)明新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)的細胞毒性。
[0086]生長對數(shù)期!fepG2細胞鋪板于96孔板，生長24h后，細胞匯合度為70~80%。吸去培養(yǎng)液，載有熒光素酶質(zhì)粒PGL3的本發(fā)明新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)按濃度梯度給藥。48h后，加入MTT溶液(5mg/mL in pH7.4PBS) 10 μ L，37°C，繼續(xù)孵育4h。棄去上清液，加入150yL DMSO溶解藍紫色的甲瓚結(jié)晶，用酶聯(lián)免疫測定儀于570nm測定吸光度。計算細胞生存率。
[0087]實驗結(jié)果如附圖3所示，在基因濃度0.5~50 μ g/mL，細胞生存率都在100%，表明本發(fā)明新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)的低毒性。
[0088]實施例9:本發(fā)明新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)的的體內(nèi)基因治療效果。
[0089]以5X106!fepG2細胞接種于裸鼠腋下，獲得腫瘤裸鼠模型。當腫瘤體積達到IOOmm3時，裸鼠隨機分成3組，每組5只，各組分別尾靜脈給藥:載治療基因的本發(fā)明新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)，載非治療基因的本發(fā)明新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)，PBS0測量腫瘤體積隨時間的變化。結(jié)果如附圖4。
[0090]實驗結(jié)果表明，靜脈注射載有治療基因的本發(fā)明新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)，能有效抑制腫瘤的生長，從而達到系統(tǒng)治療腫瘤的目的。[0091]實施例10:本發(fā)明新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)的免疫毒性考察。
[0092]健康裸鼠隨機分成兩組，每組5只，分別給藥本發(fā)明新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)和PBS。給藥4h后，裸鼠尾部取血，酶聯(lián)免疫法測量血漿中的IFN — Y、IL-2和IL-6等免疫因子的濃度。
[0093]免疫毒性結(jié)果如附圖5所示，與對照組相比，靜脈注射本發(fā)明新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)沒有引起免疫因子的增加，說明該載體的低免疫毒性。
[0094]上面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的實施方式作了詳細的說明，但是本發(fā)明不限于上述實施方式，在所屬【技術(shù)領(lǐng)域】普通技術(shù)人員所具備的知識范圍內(nèi)，還可以在不脫離本發(fā)明宗旨的前提下做出各種變化。
【權(quán)利要求】
1.一種新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)，包括磷酸鈣及PEG接枝羧甲基殼聚糖，其特征在于，磷酸鈣包裹基因形成內(nèi)核，PEG接枝羧甲基殼聚糖包覆于內(nèi)核表面，PEG鏈段形成親水性外殼，從而形成具有PEG化核殼結(jié)構(gòu)的納米粒子,其中所述PEG接枝羧甲基殼聚糖的粘均分子量為I~100萬，脫乙酰度大于80%，羧甲基取代度為20~90%，PEG分子量為500~10000，PEG接枝率為8%~60%，并且該納米粒子的粒徑為60~lOOnm。
2.如權(quán)利要求1所述的新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)，其特征在于，所述PEG接枝羧甲基殼聚糖的粘均分子量為10~40萬，脫乙酰度大于80%，羧甲基取代度為40~70%，PEG分子量為2000~6000，PEG接枝率為20%~40%。
3.一種制備新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)的方法，包括以下步驟: .1)制備試劑a，包含鈣鹽、緩沖劑，余量為水； .2)制備試劑b，包含PEG接枝羧甲基殼聚糖、磷酸鹽、氯化鈉、緩沖劑，余量為水； .3)將基因與試劑a混合，再與試劑b等體積混合均勻， 其特征在于， 在所述試劑a中，鈣鹽為CaCl2、Ca(NO3)2中的一種或兩種任意比例的組合，緩沖劑為H印es、MOPS、PBS、PIPES、Tris的一種或兩種以上的任意比例組合； 在所述b試劑中，PEG接枝羧甲基殼聚糖的粘均分子量為I~100萬，脫乙酰度大于.80%，羧甲基取代度為20~90%，PEG分子量為500~10000，PEG接枝率為8%~60% ;磷酸鹽包括 Na3PO4' Na2HPO4' NaH2PO4' K3PO4' K2HPO4' KH2PO4' (MM)3PO4、(MM)2HPO4 的一種或兩種以上的任意比例組合；緩沖劑為H印es、MOPS、PBS、PIPES、Tris中的一種或兩種以上的任意比例組合。
4.如權(quán)利要求3所述的制備新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)的方法，其特征在于，試劑a中的鈣鹽為CaCl2或Ca (NO3)2,緩沖劑為Ifepes或Tris ;試劑b中的PEG接枝羧甲基殼聚糖的粘均分子量為10~40萬，脫乙酰度大于80%，羧甲基取代度為40~70%，PEG分子量為2000~6000，PEG接枝率為20%~40% ;磷酸鹽為Na2HPO4或NaH2PO4 ;緩沖劑為Ifepes或 Tris0
5.如權(quán)利要求3所述的制備新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)的方法，其特征在于，基因與試劑a混合時的基因質(zhì)量(μ g)與試劑a體積(mL)的比例為10~200 μ g/mL。
6.如權(quán)利要求5所述的制備新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)的方法，其特征在于，基因質(zhì)量(μ g)與試劑a體積(mL)的比例為40~120 μ g/mL。
7.如權(quán)利要求3至6中任一項所述的制備新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)的方法，其特征在于，所述a試劑中的鈣鹽濃度為20~1000mM,緩沖劑濃度為5~200mM，pH為.6.0~10.0 ;所述b試劑中的PEG接枝羧甲基殼聚糖濃度為50~2000mg/L，磷酸鹽濃度為0.5~10mM，NaCl濃度為50~500mM，緩沖劑濃度為5~200mM，pH為6.0~10.0。
8.如權(quán)利要求7所述的制備新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)的方法，其特征在于，所述a試劑中的鈣鹽濃度為100~300mM，緩沖劑濃度為20~60mM，pH為7.0~8.0 ;所述b試劑中的PEG接枝羧甲基殼聚糖濃度為200~800mg/L，磷酸鹽濃度為1.5~3.0mM,NaCl濃度為100~300mM，緩沖劑濃度為20~60mM，pH為7.0~8.0。
9.如權(quán)利要求1或2所述的新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)用于體內(nèi)外細胞的基因轉(zhuǎn)染以及人或動物體內(nèi)基因藥物輸送的用途，其中所述基因是DNA、siRNA, miRNA或shRNA中的任一或多種。
10.一種試劑盒，用于制備如權(quán)利要求1或2所述的新型雜化納米磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)，所述試劑盒包含鈣鹽或其包含緩沖劑的水溶液；以及PEG接枝羧甲基殼聚糖、磷酸鹽、氯化鈉或者其包含緩沖劑的混合水溶液，其特征在于，鈣鹽或其包含緩沖劑的水溶液與PEG接枝羧甲基殼聚糖、磷酸鹽、氯化鈉或者其包含緩沖劑的混合水溶液是分開獨立包裝的，其中鈣鹽為CaCl2、ea(N(B)2中的一種或兩種任意比例的組合；PEG接枝羧甲基殼聚糖的粘均分子量為1~100萬，脫 乙酰度大于80%，羧甲基取代度為20~90%，PEG分子量為500~10000，PEG 接枝率為 8% ~60% ;磷酸鹽為 Na3P04、Na2HPO4、NaH2P04、K3PO4、K2HPO4、KH2PO4、(NH4)3P04、(MM)2HPO4中的一種或兩種以上的任意比例組合；緩沖劑為H印es、MOPS、PBS、PIPES、Tris中的一種或兩種以上的任意比例組合。
【文檔編號】A61K48/00GK103789348SQ201410055627
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年2月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月19日
【發(fā)明者】孫敏捷, 謝穎, 張燦, 平其能, 張斐然 申請人:中國藥科大學