專利名稱：一種禽類精原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因，動(dòng)物克隆，珍稀動(dòng)物的保存及組織與細(xì)胞工程等領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
精原干細(xì)胞(SSCs)是精子形成的前體細(xì)胞，是一種具有自我更新和多向分化潛能的多能干細(xì)胞。隨著精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)、凍存技術(shù)和移植技術(shù)的不斷發(fā)展和成熟，使精原干細(xì)胞的應(yīng)用成為可能。且精原干細(xì)胞在人類醫(yī)學(xué)、建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型及瀕危動(dòng)物保護(hù)上都有很重要的意義。對(duì)精原干細(xì)胞的研究逐漸成為干細(xì)胞研究領(lǐng)域里的一個(gè)熱點(diǎn)。由于禽類獨(dú)特的生殖生理結(jié)構(gòu)和解剖學(xué)特點(diǎn)，使得對(duì)禽類組織與細(xì)胞工程、轉(zhuǎn)基因及動(dòng)物克隆方面的研究極少。
自1994年Brister和Zimmerman將可育小鼠的精原干細(xì)胞移植到不育小鼠的睪丸中并觀察到精子產(chǎn)生以及1996年Clonthier將大鼠睪丸生殖細(xì)胞移植到免疫缺陷小鼠并產(chǎn)生精子之后，精原細(xì)胞逐漸成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。李德雪、尹明等人對(duì)小鼠精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)的條件及分裂增殖的現(xiàn)象進(jìn)行了研究。精原干細(xì)胞的培養(yǎng)條件、鑒定方法和移植技術(shù)都在不斷的更新和完善。
研究表明，在有飼養(yǎng)層的基礎(chǔ)上，以DMEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基并加入一些添加劑及某些生長(zhǎng)因子對(duì)哺乳動(dòng)物精原干細(xì)胞的體外存活、分裂增殖及克隆形成具有良好作用，但對(duì)于雞胚胎精原干細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)及建系等方面的研究報(bào)道很少，仍沒有摸索到最適的體外培養(yǎng)及傳代條件。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種禽類精原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，為雞精原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)，對(duì)雞精原干細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)體系及精原干細(xì)胞移植、轉(zhuǎn)基因等技術(shù)提供必要的基礎(chǔ)，給體外研究細(xì)胞的發(fā)育分化提供較好的材料。
本發(fā)明的技術(shù)方案是，一種禽類精原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，其特征在于將雞胚SSCs接種到雞胚成纖維(CEF)飼養(yǎng)層上，再使用通過實(shí)驗(yàn)摸索出的最適培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。所用培養(yǎng)液為在DMEM高糖培養(yǎng)基中添加10％小牛血清、2％雞血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸鈉、5.5×10-5mol/L β-巰基乙醇、10μl/ml非必需氨基酸、15-20ng/mlhSCF、10U/ml mLIF、10-15ng/ml bFGF、0.04ng/ml hIL-11、10ng/ml IGF、100U/ml硫酸慶大霉素。
本發(fā)明獲得禽類精原干細(xì)胞長(zhǎng)期體外培養(yǎng)的有效方法，為利用雞精原干細(xì)胞進(jìn)行體外操作和雞胚胎精原干細(xì)胞的進(jìn)一步建系奠定研究基礎(chǔ)。優(yōu)點(diǎn)如下1、操作簡(jiǎn)便，可重復(fù)性強(qiáng)，可以滿足一般利用SSCs進(jìn)行體外操作的要求。
2、可以在體外對(duì)SSCs進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)，使其大量增殖，進(jìn)行細(xì)胞與組織工程操作。
3、所獲得的SSCs可進(jìn)行轉(zhuǎn)基因、動(dòng)物克隆、嵌合體雞的制備。


圖1為原代SSCs培養(yǎng)48小時(shí)形成的集落×200。
圖2為原代SSCs培養(yǎng)96小時(shí)形成的集落×200。
圖3為第2代SSCs培養(yǎng)48小時(shí)形成的集落×200。
圖4為第2代SSCs的AKP染色×200。
圖5為雞SSCs的SSEA-1染色鑒定×200。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例步驟1雞胚胎SSCs的分離取出殼一周內(nèi)的雛雞，無(wú)菌獲取雞睪丸，用PBS中浸洗三次，在解剖鏡下剝?nèi)グ啄さ?。加入適量的PBS用力吹打。首先用10倍于組織塊體積的膠原酶(1mg/mL)消化，在37℃、5％CO2濃度條件下作用5～8分鐘，其作用除去精曲小管的間質(zhì)細(xì)胞和一些血管成分，之后用透明質(zhì)酸酶(1.5mg/mL)和胰蛋白酶(0.25％)的混合液消化3～5分鐘，獲取生精上皮上的SSCs和支持細(xì)胞，以消化液用量10％的FCS終止消化，未消化的組織成分用350目過濾篩過濾除去。過濾液以1000r/分鐘離心8分鐘，棄上清，用培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算活細(xì)胞數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至104個(gè)/ml后接種到長(zhǎng)有CEF飼養(yǎng)層的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。
步驟2雞胚胎SSCs體外培養(yǎng)后的生物學(xué)特性檢測(cè)分別用形態(tài)學(xué)鑒定、堿性磷酸酶(AKP)染色、階段特異性胚胎表面抗原(SSEA-1)檢測(cè)鑒定雞胚胎SSCs。形態(tài)學(xué)鑒定如圖步驟3雞胚胎SSCs的體外培養(yǎng)制備培養(yǎng)液培養(yǎng)液DMEM高糖培養(yǎng)基，添加10％小牛血清、2％雞血清、2mmol/LL-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸鈉、5.5×10-5mol/L β-巰基乙醇、10μl/ml非必需氨基酸、15-20ng/ml hSCF、10U/ml mLIF、10-15ng/ml bFGF、0.04ng/ml hIL-11、10ng/ml IGF、100U/ml硫酸慶大霉素。
上述DMEM(Dulbecco’s modify Eagle’s medium)，即杜貝克氏改良的恩格氏培養(yǎng)液。
通過對(duì)SSCs進(jìn)行體外原代培養(yǎng)及繼代培養(yǎng)，摸索出了適合SSCs在體外長(zhǎng)期存活的較好培養(yǎng)體系，在有飼養(yǎng)層存在的條件下，在此培養(yǎng)體系中，SSCs生長(zhǎng)良好，貼壁速度快，克隆形成率高，1-4代的SSCs有AKP陽(yáng)性克隆形成，克隆形成率分別為47％、36％、26％、13％。由此說明，使用CEF飼養(yǎng)層和添別有細(xì)胞因子的培養(yǎng)液最適于雞SSCs的體外培養(yǎng)和增殖，是最佳的培養(yǎng)體。
權(quán)利要求
1.一種禽類精原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，其特征在于將禽類精原干細(xì)胞接種到雞胚成纖維飼養(yǎng)層上，再使用培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)；所述培養(yǎng)液為在DMEM高糖培養(yǎng)基中添加10％小牛血清、2％雞血清、2mmol/LL-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸鈉、5.5×10-5mol/Lβ-巰基乙醇、10μl/ml非必需氨基酸、15-20ng/ml hSCF、10U/ml mLIF、10-15ng/ml bFGF、0.04ng/ml hIL-11、10ng/ml IGF、100U/ml硫酸慶大霉素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種禽類精原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，涉及轉(zhuǎn)基因，動(dòng)物克隆，珍稀動(dòng)物的保存及組織與細(xì)胞工程等領(lǐng)域。將禽類精原干細(xì)胞接種到CEF飼養(yǎng)層上，再使用在DMEM高糖培養(yǎng)基中添加10％小牛血清、2％雞血清、2mmol/L L－谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸鈉、5.5×10
文檔編號(hào)C12N5/06GK1935984SQ200610096629
公開日2007年3月28日 申請(qǐng)日期2006年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月13日
發(fā)明者李碧春, 魏彩霞, 陳國(guó)宏, 孫思宇, 吳信生, 趙文明, 徐琪, 吳洪, 周冠月, 孫國(guó)波, 戴建明, 孫鵬翔, 葛劍輝 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)