專利名稱：一種產(chǎn)丁二酸大腸桿菌基因工程菌株的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)丁二酸大腸桿菌基因工程菌株的構(gòu)建方法，具體是一種基于 NAD(H)系統(tǒng)改造后的大腸桿菌菌株的構(gòu)建方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
丁二酸(Succinic acid)又稱琥珀酸，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、染料、香料、油漆、 食品和塑料等行業(yè)，作為C4平臺化合物，可用于合成1，4-丁二醇、四氫呋喃、γ - 丁內(nèi)酯等有機(jī)化學(xué)品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)類生物可降解材料，被美國能源部認(rèn)為是未來12 種最有價值的生物煉制產(chǎn)品之一。丁二酸的生產(chǎn)方法主要包括化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法，利用微生物發(fā)酵法轉(zhuǎn)化可再生資源(葡萄糖、木糖等)，由于原料來源廣泛且價格低廉，污染小，環(huán)境友好，且在發(fā)酵過程中可以吸收固定CO2,能有效緩解溫室效應(yīng)，開辟了溫室氣體二氧化碳利用的新途徑，近年來成為研究的熱點(diǎn)。丁二酸的生產(chǎn)菌株主要集中在Armerobiospirillum succiniciproducens^Actinobacillus succinogenes、Mannheimia succiniciproducens、 重組谷氨酸棒桿菌和重組大腸桿菌的研究上。利用野生菌株生產(chǎn)丁二酸雖然獲得了較高的產(chǎn)物濃度，但培養(yǎng)過程培養(yǎng)基成本較高，且甲酸、乙酸等副產(chǎn)物積累較多，阻礙了其工業(yè)化進(jìn)程。五C^i (大腸桿菌)由于遺傳背景清楚、易操作、易調(diào)控、培養(yǎng)基要求簡單和生長迅速等優(yōu)點(diǎn)，近年來被廣泛用于研究以獲得產(chǎn)丁二酸優(yōu)秀菌株。提高丁二酸的發(fā)酵產(chǎn)酸能力，可以有多種方法，包括重新篩選優(yōu)良菌株、通過傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法進(jìn)行菌種誘變以及用現(xiàn)代遺傳育種技術(shù)、基因工程方法來提高菌種的產(chǎn)酸能力等。Soon Ho Hong等人報道了構(gòu)建產(chǎn)琥珀酸基因工程菌的方法，原理是敲除野生大腸桿菌中的丙酮酸甲酸裂解酶基因(/7/7召)和乳酸脫氫酶基因Qi/似)減少甚至不產(chǎn)副產(chǎn)物甲酸、乳酸、乙酸以及乙醇等，使更多的代謝流流向琥珀酸(Biotechnol Bioeng, 2001, 74: 89 95)。現(xiàn)有產(chǎn)丁二酸重組大腸桿菌的構(gòu)建思路主要包括失活副產(chǎn)物生成途徑的關(guān)鍵酶 (如丙酮酸甲酸裂解酶與乳酸脫氫酶)、增強(qiáng)丁二酸合成途徑中酶(如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)的活性以及外源導(dǎo)入可以弓I導(dǎo)合成丁二酸的酶(如丙酮酸羧化酶)提高其對葡萄糖的利用率以及生產(chǎn)速率。其中，五COli NZNlll由于同時失活了丙酮酸甲酸裂解酶與乳酸脫氫酶，NADH不能及時再生為NAD+，引起胞內(nèi)輔酶NAD(H)的不平衡(NADH/NAD+比例超過2)， 最終導(dǎo)致厭氧條件下菌株不能利用葡萄糖。其自發(fā)突變株五coli AFPlll由于突變了葡萄糖專性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的PtsG基因，降低了在EMP途徑中NADH的產(chǎn)生速率，恢復(fù)了 NAD(H) 平衡，使得菌株在厭氧條件下能夠利用葡萄糖，且產(chǎn)物主要為丁二酸，在有氧厭氧兩階段發(fā)酵培養(yǎng)AFPlll過程中，丁二酸質(zhì)量收率達(dá)到96%，生產(chǎn)強(qiáng)度為1.21 g L—1 · h—1。因此，在高產(chǎn)丁二酸大腸桿菌菌株構(gòu)建過程中，確保胞內(nèi)輔酶NAD(H)的平衡是重組大腸桿菌高產(chǎn)丁二酸的關(guān)鍵因素之一。大腸桿菌中NAD(H)的生物合成及分解途徑如圖1所示，涉及其合成的基因主要有三個QpncB，nadD,肪淑)，涉及分解代謝的基因主要有兩個ijjaD, yrfE),而NAD+和NADH 相互之間的轉(zhuǎn)化反應(yīng)則多達(dá)300多個。相關(guān)研究表明，利用DNA重組技術(shù)改造NAD(H) 生物合成途徑是提高NAD(H)總量的有效手段。San等人(Metab Eng, 2002，4: 238 247;Metab Eng, 2002, 4: 182 192)在研究輔因子調(diào)控對大腸桿菌代謝流分布的影響過程中，通過過量表達(dá)煙酸轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶使胞內(nèi)NAD(H)總量提高了 41. 7% ；Heuser 等人(Eng. Life Sci, 2007, 7: 343 353)通過過量表達(dá)煙酸轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶和NAD 合成酶，或者同時表達(dá)這兩個酶，使菌株胞內(nèi)NAD(H)總量提高了 2倍多，并將其應(yīng)用到酶轉(zhuǎn)化合成O )-甲基-3-羥基丁胺過程中，使得NAD(H)的量不再成為限制因素，從而提高了酶轉(zhuǎn)化的效率。眾多科學(xué)實踐也證明利用發(fā)酵調(diào)控手段可有效調(diào)節(jié)NAD(H)總量與NADH/NAD+比例，進(jìn)而有效提高底物的利用率和產(chǎn)物生產(chǎn)水平。在利用Saccharomyces cerevisiaelW> >QQ 1 (Biotechnol Bioeng, 2002, 78:172 178)勒 Fusarium oxysporum (J Biosci Bioeng, 2004， 97: 299 -304. Enzyme Micro Technol, 2005， 36: 100 106)發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙醇的過程中添加乙偶姻作為外源電子受體，有效地增加了胞內(nèi)NAD+含量，提高了乙醇的產(chǎn)率；San等人(Metab Eng，2002, 4: 182 192)在利用大腸桿菌生產(chǎn)1，2-丙二醇過程中，發(fā)現(xiàn)在稀釋率為0. 1 h—1恒化厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)中，隨著碳源還原性的增大，胞內(nèi)NADH/NAD+比率從0. 51 (葡萄糖酸)增加到0. 75 (葡萄糖)和0. 94 (山梨醇)，并導(dǎo)致中心代謝流產(chǎn)物乙醇(消耗2 mol NADH)對乙酸(不消耗NADH)的比率分別為0.29、 1 和 3. 62。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種基于NAD(H)系統(tǒng)改造后的產(chǎn)丁二酸大腸桿菌基因工程菌株的構(gòu)建方法，達(dá)到菌株的構(gòu)建方法簡單方便，構(gòu)建得到的菌株發(fā)酵簡單可行，易于工業(yè)化，產(chǎn)酸能力強(qiáng)的目的，從而大大降低了生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。為實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案。一種產(chǎn)丁二酸大腸桿菌基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于
(1)純化擴(kuò)增出pncB基因，和/或純化擴(kuò)增出rmdD基因，和/或純化擴(kuò)增出rmdE基因后，構(gòu)建得到過量表達(dá)煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、煙酸單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶、或者NAD合成酶中的一種或幾種的表達(dá)質(zhì)粒；
(2)將步驟(1)所述的質(zhì)粒導(dǎo)入缺乏乳酸脫氫酶基因Qi/似)，丙酮酸甲酸裂解酶基因 (.PflB)活性的菌株五coli NZNlll的感受態(tài)，獲得陽性轉(zhuǎn)化子；
(3)利用步驟(2)的陽性轉(zhuǎn)化子過量表達(dá)煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、煙酸單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶、或者NAD合成酶中的一種或幾種，恢復(fù)其在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，得到產(chǎn)丁二酸基因工程菌。其中，上述方法的具體步驟實施起來包括下述7種方法
A、過量表達(dá)煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，恢復(fù)其在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，獲得產(chǎn)丁二酸基因工程菌株fecAericAia coli LL101
合成一對5’端帶有酶切位點(diǎn)的引物，以大腸桿菌K12基因組DNA為模板，純化擴(kuò)增出的基因后，表達(dá)質(zhì)粒pTrC99a用與引物所設(shè)計的酶切位點(diǎn)一致的酶雙酶切、連接獲得重組質(zhì)粒pTrc99a-/7/ c召；將質(zhì)粒pTrC99a-/7/7Ci 導(dǎo)入大腸桿菌NZm 11的感受態(tài)，獲得的陽性轉(zhuǎn)化子即為 Escherichia coli LLlOl ；
利用federicAia coli LLlOl過量表達(dá)煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，恢復(fù)其在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力。B、過量表達(dá)煙酸單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶，恢復(fù)其在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，獲得產(chǎn)丁二酸基因工程菌株菌株fecAericAia coli LL102
合成一對5’端帶有酶切位點(diǎn)的引物，以大腸桿菌K12基因組DNA為模板，純化擴(kuò)增出的/^勸基因后，表達(dá)質(zhì)粒pTrC99a用與引物所設(shè)計的酶切位點(diǎn)一致的酶雙酶切、連接獲得重組質(zhì)粒 pTrc99a-/ ao0 ；
將質(zhì)粒pTrC99a-肪勸導(dǎo)入大腸桿菌NZm 11的感受態(tài)，獲得的陽性轉(zhuǎn)化子即為 Escherichia coli LL102 ；
利用federicAia coli LL102過量表達(dá)煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，恢復(fù)其在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力。C、過量表達(dá)NAD合成酶，恢復(fù)其在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，獲得產(chǎn)丁二酸基因工程菌株菌株fecAericAia coli LL103
合成一對5’端帶有酶切位點(diǎn)的引物，以大腸桿菌K12基因組DNA為模板，純化擴(kuò)增出的Z7a0E■基因后，表達(dá)質(zhì)粒pTrC99a用與引物所設(shè)計的酶切位點(diǎn)一致的酶雙酶切、連接獲得重組質(zhì)粒 pTrc99a-/ ao^ ；
將質(zhì)粒pTrC99a-肪淑導(dǎo)入大腸桿菌NZmil的感受態(tài)，獲得的陽性轉(zhuǎn)化子即為 Escherichia coli LL103 ；
利用federicAia coli LL103過量表達(dá)煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，恢復(fù)其在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力。D、共過量表達(dá)煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和煙酸單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶，恢復(fù)其在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，獲得產(chǎn)丁二酸基因工程菌株菌株federidia coli LL104
合成一對5’端帶有相同酶切位點(diǎn)的引物，以大腸桿菌K12基因組DNA為模板，純化擴(kuò)增出的/^勸基因后，已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pTrC99a-/7/7M用與引物所設(shè)計的酶切位點(diǎn)一致的酶單酶切、連接獲得重組質(zhì)粒命c(diǎn)ma-pncB-nadD ；
將質(zhì)粒命c(diǎn)^-pncB-nadD導(dǎo)入大腸桿菌NZmil的感受態(tài)，獲得的陽性轉(zhuǎn)化子即為 Escherichia coli LL104 ；
利用fecAericAia coli LL104同時過量表達(dá)煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和煙酸單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶，恢復(fù)其在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力。E、共過量表達(dá)煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和NAD合成酶，恢復(fù)其在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，獲得產(chǎn)丁二酸基因工程菌株菌株federicAia coli LL105
合成一對5’端帶有相同酶切位點(diǎn)的引物，以大腸桿菌K12基因組DNA為模板，純化擴(kuò)增出的/^淑基因后，已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pTrC99a-/7/7M用與引物所設(shè)計的酶切位點(diǎn)一致的酶單酶切、連接獲得重組質(zhì)粒命c(diǎn)ma-pncB-nadE ；
將質(zhì)粒命c(diǎn)ma-pncB-rrndE導(dǎo)入大腸桿菌NZmil的感受態(tài)，獲得的陽性轉(zhuǎn)化子即為 Escherichia coli LL105 ；
利用fecAericAia coli LL105同時過量表達(dá)煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和NAD合成酶，恢復(fù)其在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力。F、共過量表達(dá)煙酸單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶和NAD合成酶，恢復(fù)其在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，獲得產(chǎn)丁二酸基因工程菌株菌株federicAia coli LL106
合成一對5’端帶有相同酶切位點(diǎn)的引物，以大腸桿菌K12基因組DNA為模板，純化擴(kuò)增出的/^淑基因后，已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pTrC99a-/ ao0用與引物所設(shè)計的酶切位點(diǎn)一致的酶單酶切、連接獲得重組質(zhì)粒介cmmadD-nadE ；
將質(zhì)粒命c(diǎn)mmadD-neidE導(dǎo)入大腸桿菌NZmil的感受態(tài)，獲得的陽性轉(zhuǎn)化子即為 Escherichia coli LL106 ；
利用fecAericAia coli LL106同時過量表達(dá)煙酸單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶和NAD合成酶，恢復(fù)其在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力。F、共過量表達(dá)煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、煙酸單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶和NAD合成酶， 恢復(fù)其在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，獲得產(chǎn)丁二酸基因工程菌株菌株federidia coli LL107
合成一對5’端帶有相同酶切位點(diǎn)的引物，以大腸桿菌K12基因組DNA為模板，純化擴(kuò)增出的/^浙基因后，已構(gòu)建的重組質(zhì)粒命c(diǎn)^-pncB-nadD用與引物所設(shè)計的酶切位點(diǎn)一致的酶單酶切、連接獲得重組質(zhì)粒pTrc99a-/7/ M ~nadD~nadE ；
將質(zhì)粒pTrC99a-/7/7M導(dǎo)入大腸桿菌NZmil的感受態(tài)，獲得的陽性轉(zhuǎn)化子
勒為 Escherichia coli LL107 ；
利用fecAericAia coli LL107同時過量表達(dá)煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、煙酸單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶和NAD合成酶，恢復(fù)其在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力。本發(fā)明的有益效果在于
(1)厭氧發(fā)酵過程中產(chǎn)大量諸如乙酸等對菌株有毒害作用的副產(chǎn)物，因此在利用本發(fā)明所述的基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸時，考慮兩階段發(fā)酵方式，有氧階段提高生物量，厭氧階段進(jìn)行產(chǎn)酸發(fā)酵。也可以選擇性地采用膜分離技術(shù)，達(dá)到分離菌體的目的，再進(jìn)而用于厭氧發(fā)酵。具體步驟如下采用兩階段發(fā)酵模式，劃線-80°C凍存管保藏的菌液到含有氯霉素、硫酸卡那霉素和氨芐青霉素的平板，挑取平板上長出的單菌落到5 mL LB培養(yǎng)基的試管，1% (v/v)接種量接入三角瓶中，當(dāng)有氧培養(yǎng)菌體OD6tltl至0. 8 1. 0左右時用0. 3 mM的 IPTG誘導(dǎo)至0D_=3左右時，按接種量10%轉(zhuǎn)接至血清瓶中厭氧發(fā)酵；
發(fā)酵結(jié)果表明，新構(gòu)建的和大腸桿菌NAD(H)生物合成途徑有關(guān)的基因工程菌 Escherichia coli LL101> Escherichia coli LL102> Escherichia coli LL103> Escherichia coli LL104> Escherichia coli LL105> Escherichia coli LL106> Escherichia coli LL107恢復(fù)了氧化還原平衡，同時恢復(fù)了厭氧條件下代謝葡萄糖的能力。(2)本發(fā)明采用分子生物學(xué)手段，調(diào)控表達(dá)大腸桿菌NAD(H)合成途徑中的一個或多個基因，以有效提高大腸桿菌胞內(nèi)NAD(H)總量及NADH/NAD+，結(jié)合發(fā)酵調(diào)控手段，實現(xiàn)微觀與宏觀兩種調(diào)控手段的合理結(jié)合，從而大量提高丁二酸的產(chǎn)量及生產(chǎn)能力的方法未見公開，而這種應(yīng)用將大大推進(jìn)丁二酸產(chǎn)業(yè)的進(jìn)步和發(fā)展。


圖1大腸桿菌中NAD(H)的生物合成及分解途徑。圖2重組質(zhì)粒pTrc99a-/7/ c召的構(gòu)建圖譜。圖3重組質(zhì)粒PTrc99a-/ ao0的構(gòu)建圖譜。圖4重組質(zhì)粒pTrc99a-/ ao^的構(gòu)建圖譜。圖5重組質(zhì)粒^\i:cma-pncB-nadD的構(gòu)建圖譜。圖6重組質(zhì)粒^\i:cma-pncB-nadE的構(gòu)建圖譜。圖7重組質(zhì)粒命oma-nadD-nadE的構(gòu)建圖譜。圖8重組質(zhì)粒識！cma-pncB-nadD-rrndE的構(gòu)建圖譜。圖9 PCR產(chǎn)物pncB的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖。圖10 PCR產(chǎn)物ImdD的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖。圖11 PCR產(chǎn)物ImdE的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖。圖12重組質(zhì)粒pTrC99a-/7/7M的單雙酶切鑒定圖。圖13重組質(zhì)粒pTrC99a-/7ao0的單雙酶切鑒定圖。圖14重組質(zhì)粒pTrC99a-/7ai^的單雙酶切鑒定圖。圖15重組質(zhì)粒x^d-pncB-nadD的單雙酶切鑒定圖。圖16重組質(zhì)粒x^d-pncB-nadE的單雙酶切鑒定圖。圖17重組質(zhì)粒介娜a-nadD-naclE的單雙酶切鑒定圖。圖18重組質(zhì)粒識！cma-pncB-nadD-rrndE的單雙酶切鑒定圖。
具體實施例方式本發(fā)明所述的大腸桿菌K12的來源是購自中國科學(xué)院北京微生物研究所。本發(fā)明所述的表達(dá)質(zhì)粒用pTrc99a的來源是購自htrovegen公司。本發(fā)明所述的五co/i NZNlll 的來源是Biotechnol Bioeng, 2001，74:89 95。下面的實施例對本發(fā)明作詳細(xì)說明，但對本發(fā)明沒有限制。實施例1
本實施例說明純化擴(kuò)增出基因，以構(gòu)建過量表達(dá)煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)質(zhì)粒，恢復(fù)重組菌株在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，得到產(chǎn)丁二酸基因工程菌菌株 Escherichia coli LLlOl 的方法。1、構(gòu)建過量表達(dá)煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)質(zhì)粒，其過程包括
(1)合成帶有Nco I和Hind 111酶切位點(diǎn)的引物， 上游引物5’ - CATGCCATGGATGACACAATTCGCTTCTCCTG-3，
下游引物5，-CCCAAGCTTCACTTGTCCACCCGTAAATGG-3，
(2)以大腸桿菌K12系列為模板，PCR擴(kuò)增目的基因片段，反應(yīng)條件為94°C，5min ； (940C 45 s，55°C 45 s，72°C 1 min，;35個循環(huán))；72°C，10 min。純化擴(kuò)增出的/mc召基因后， 表達(dá)質(zhì)粒用pTrc99a分別用Afco I私Hind III雙酶切、連接獲得重組質(zhì)粒pTrc99a-/7/ M。2、將質(zhì)粒pTrc99a-/7/ M導(dǎo)入萬.co/i NZWll的感受態(tài)，獲得的陽性轉(zhuǎn)化子為新構(gòu)建菌株，命名為fecAericAia coli LLlOl。實施例2本實施例說明純化擴(kuò)增出/^勸基因，以構(gòu)建過量表達(dá)煙酸單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)質(zhì)粒，恢復(fù)重組菌株在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，得到產(chǎn)丁二酸基因工程菌株 Escherichia coli LL102 的方法。1、構(gòu)建過量表達(dá)煙酸單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)質(zhì)粒，其過程包括
(1)合成帶有AfcoI私Hind III酶切位點(diǎn)的引物，
上游引物5，- CATGCCATGGGGCGGACGTATTTATCGACGGTTGA -3， 下游引物5，- CCCAAGCTTCAGATTTTGCGCTTGCTCAATACCG -3，
(2)以大腸桿菌K12系列為模板，PCR擴(kuò)增目的基因片段，反應(yīng)條件為94°C，5min ； (940C 45 s，60°C 45 s，72°C 48s，;35 個循環(huán))；72°C，10 min。純化擴(kuò)增出的基因后， 表達(dá)質(zhì)粒用pTrc99a分別用Afco I _ind III雙酶切、連接獲得重組質(zhì)粒pTrc99a-/ ao 。2、將質(zhì)粒pTrC99a-/7ao0導(dǎo)入五cWi NZWll的感受態(tài)，獲得的陽性轉(zhuǎn)化子為新構(gòu)建菌株，命名為fecAericAia coli LL102。實施例3
本實施例說明純化擴(kuò)增出/^淑基因，以構(gòu)建過量表達(dá)NAD合成酶的表達(dá)質(zhì)粒，恢復(fù)重組菌株在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，得到產(chǎn)丁二酸基因工程菌株federidia coli LL103的方法。1、構(gòu)建過量表達(dá)NAD合成酶的表達(dá)質(zhì)粒，其過程包括
(1)合成帶有AfcoI私Hind III酶切位點(diǎn)的引物，
上游引物5’ -CATGCCATGGCGCTTGTCGTTTCAGTAGCAACGGG-3’ 下游引物5，-CCCAAGCTTCGCATCCGGCGTGAACAAATTACTC-3，
(2)以大腸桿菌K12系列為模板，PCR擴(kuò)增目的基因片段，反應(yīng)條件為94°C， 5 min ； (94 °C 45 s，64°C 45 s，72°C 57s，；35 個循環(huán))；72 °C，10 min。純化擴(kuò)增出的 /^淑基因后，表達(dá)質(zhì)粒用pTrc99a分別用Afco I私Hind III雙酶切、連接獲得重組質(zhì)粒 pTrc99a-/ ai/i 02、將質(zhì)粒pTrC99a-/7ai^導(dǎo)入五cWi NZWll的感受態(tài)，獲得的陽性轉(zhuǎn)化子為新構(gòu)建菌株，命名為fecAericAia coli LL103。實施例4
本實施例說明利用基因和/^勸基因構(gòu)建共表達(dá)煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和煙酸單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶的質(zhì)粒，恢復(fù)重組菌株在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，得到產(chǎn)丁二酸 S @ XfM^tt Escherichia coli LL104 的方法。 1、構(gòu)建過量表達(dá)共表達(dá)煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和煙酸單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)質(zhì)粒，其過程包括
(1)合成兩端都帶有/ ^III酶切位點(diǎn)的引物，
上游引物5’ - CCCAAGCTTGGCGGACGTATTTATCGACGGTTGA -3， 下游引物5，- CCCAAGCTTCAGATTTTGCGCTTGCTCAATACCG -3，
(2)以大腸桿菌K12系列為模板，PCR擴(kuò)增目的基因片段，反應(yīng)條件為94°C，5min； (94°C 45 s，60°C 45 s，72°C 48s，；35 個循環(huán))；72°C，10 min。純化擴(kuò)增出的基因后，表達(dá)質(zhì)粒pTrC99a-/7/7M (實施例1中得到)用III雙酶切、連接獲得重組質(zhì)粒 》Trc^a-pncB-nadD 0
2、將質(zhì)粒pTrc99a-/7/ M-/ ao0導(dǎo)入五co/i NZNlll的感受態(tài)，獲得的陽性轉(zhuǎn)化子為新構(gòu)建菌株，命名為fecAericAia coli LL104。實施例5
本實施例說明利用/^M基因和/^淑基因構(gòu)建共表達(dá)煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和NAD合成酶的質(zhì)粒，恢復(fù)重組菌株在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，得到產(chǎn)丁二酸基因工程菌株 Escherichia coli LL105 的方法。1、構(gòu)建過量表達(dá)共表達(dá)煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和NAD合成酶的表達(dá)質(zhì)粒，其過程包括
(1)合成兩端都帶有/ ^III酶切位點(diǎn)的引物，
上游引物5’ -CCCAAGCTTCGCTTGTCGTTTCAGTAGCAACGGG-3’ 下游引物5，-CCCAAGCTTCGCATCCGGCGTGAACAAATTACTC-3，
(2)以大腸桿菌K12系列為模板，PCR擴(kuò)增目的基因片段，反應(yīng)條件為94°C，5min ； (940C 45 s，64°C 45 s，72°C 57s，；35 個循環(huán))；72°C，10 min。純化擴(kuò)增出的flaifi1 基因后，表達(dá)質(zhì)粒pTrC99a-/7/7M (實施例1中得到)用III雙酶切、連接獲得重組質(zhì)粒 pTrc^a-pncB-nadE。2、將質(zhì)粒pTrc99a-/7/7M-/ ao^導(dǎo)入五co/i NZNlll的感受態(tài)，獲得的陽性轉(zhuǎn)化子為新構(gòu)建菌株，命名為fecAericAia coli LL105。實施例6
本實施例說明利用/^勸基因和Mifi■基因構(gòu)建共表達(dá)煙酸單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶和 NAD合成酶的質(zhì)粒，恢復(fù)重組菌株在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，得到產(chǎn)丁二酸基因工程 Escherichia coli LL106。1、 構(gòu)建過量表達(dá)共表達(dá)煙酸單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶和NAD合成酶的表達(dá)質(zhì)粒， 其過程包括
(1)合成兩端都帶有HindIII酶切位點(diǎn)的引物，
上游引物5’ -CCCAAGCTTCGCTTGTCGTTTCAGTAGCAACGGG-3’ 下游引物5，-CCCAAGCTTCGCATCCGGCGTGAACAAATTACTC-3，
(2)以大腸桿菌K12系列為模板，PCR擴(kuò)增目的基因片段，反應(yīng)條件為94°C，5min； (94°C 45 s，64°C 45 s，72°C 57s，；35 個循環(huán))；72°C，10 min。純化擴(kuò)增出的flaifi1 基因后，表達(dá)質(zhì)粒pTrC99a-/7ao0 (實施例2中得到)用歷III雙酶切、連接獲得重組質(zhì)粒 plrd^a~nadD-nadE。2、將質(zhì)粒pTrc99a-/7ao0-/ ao^導(dǎo)入五co/i NZNlll的感受態(tài)，獲得的陽性轉(zhuǎn)化子為新構(gòu)建菌株，命名為fecAericAia coli LL106。實施例7
本實施例說明利用PncB基因、nadD基因和imdE基因構(gòu)建共表達(dá)煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、 煙酸單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶和NAD合成酶的質(zhì)粒，恢復(fù)重組菌株在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，得到產(chǎn)丁二酸基因工程菌株federicAia coli LL107的方法。1、 構(gòu)建過量表達(dá)共表達(dá)煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、煙酸單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶和 NAD合成酶的表達(dá)質(zhì)粒，其過程包括
(1)合成兩端都帶有/ ^ III酶切位點(diǎn)的引物，上游引物5’ -CCCAAGCTTCGCTTGTCGTTTCAGTAGCAACGGG-3’ 下游引物5，-CCCAAGCTTCGCATCCGGCGTGAACAAATTACTC-3，
(2)以大腸桿菌K12系列為模板，PCR擴(kuò)增目的基因片段，反應(yīng)條件為94°C，5 min ； (940C 45 s，64°C 45 s，72°C 57s，；35 個循環(huán))；72°C，10 min。純化擴(kuò)增出的flaifi1 基因后，表達(dá)質(zhì)粒pTrC99a-/7/7M-/7ao0 (實施例4中得到)用歷III雙酶切、連接獲得重組質(zhì) plrd^a~pncB-nadD-nadE。2、將質(zhì)粒 pTrc99a-/7/ c召-nadD-nadE^KE.coli NZWll 的感受態(tài)，獲得的陽性轉(zhuǎn)化子為新構(gòu)建菌株，命名為fecAericAia coli LL107。實施例8
本實施例說明過量表達(dá)新構(gòu)建的重組大腸菌株federicAia coli LLlOl與出發(fā)菌株 NZNlll的NAD(H)總量及NADH/NAD+比例的比較，及兩者發(fā)酵過程中耗糖及產(chǎn)酸能力的對比。采用厭氧血清瓶發(fā)酵，先有氧搖瓶培養(yǎng)至( ·=3左右時，按接種量10%轉(zhuǎn)接血清瓶厭氧發(fā)酵48 h。厭氧血清瓶發(fā)酵用培養(yǎng)基為LB+葡萄糖(20 g/L)+堿式碳酸鎂0.48 g+Kan (卡那霉素 30 μ g/mL) +Amp (氨芐青霉素 50 μ g/mL) +Chl (氯霉素 25 μ g/mL) +0. 3 mM IPTG+0. 5 mM NA (煙酸)。厭氧血清瓶培養(yǎng)后各種參數(shù)的測定結(jié)果見表1。表1厭氧血清瓶培養(yǎng)后各種參數(shù)的測定結(jié)果
權(quán)利要求
1. 一種產(chǎn)丁二酸大腸桿菌基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于(1)純化擴(kuò)增出pncB基因，和/或純化擴(kuò)增出rmdD基因，和/或純化擴(kuò)增出rmdE基因后，構(gòu)建得到過量表達(dá)煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、煙酸單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶、或者NAD合成酶中的一種或幾種的表達(dá)質(zhì)粒；(2)將步驟(1)所述的質(zhì)粒導(dǎo)入缺乏乳酸脫氫酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的菌株五C07iNZNlll的感受態(tài)，獲得陽性轉(zhuǎn)化子；(3)利用步驟(2)的陽性轉(zhuǎn)化子過量表達(dá)煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、煙酸單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶、或者NAD合成酶中的一種或幾種，恢復(fù)其在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，得到產(chǎn)丁二酸基因工程菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)丁二酸大腸桿菌基因工程菌株的構(gòu)建方法，具體涉及一種基于NAD(H)系統(tǒng)改造后的大腸桿菌菌株的構(gòu)建方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過分子生物學(xué)手段改造大腸桿菌的NAD(H)生物合成途徑，過量表達(dá)與該途徑有關(guān)的酶的活性，有效的提高了大腸桿菌胞內(nèi)NAD(H)的總量，并綜合利用氧化還原電位等發(fā)酵調(diào)控手段進(jìn)一步提高了胞內(nèi)NAD(H)的總量并維持合適的NADH/NAD+比例，確定基于輔酶調(diào)控丁二酸的生物合成策略，大幅度提高了丁二酸的合成效率。
文檔編號C12N15/63GK102154339SQ201110038939
公開日2011年8月17日 申請日期2011年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月16日
發(fā)明者劉嶸明, 姜岷, 梁麗亞, 歐陽平凱, 陳可泉, 韋萍, 馬江峰 申請人:南京工業(yè)大學(xué)