高產(chǎn)2,3-丁二醇的產(chǎn)酸克雷伯氏基因工程菌株的構(gòu)建方法及其發(fā)酵方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)2,3_ 丁二醇的基因工程菌株的構(gòu)建方法及其發(fā)酵方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 產(chǎn)酸克雷伯氏菌(1(1613186113(?71:〇〇3)作為2,3-丁二醇的產(chǎn)生菌，具有適應(yīng)環(huán)境 能力強、底物范圍廣、代謝徹底、副產(chǎn)物較少、產(chǎn)物濃度和轉(zhuǎn)化率較高等優(yōu)點被認(rèn)為是工業(yè) 化生產(chǎn)的潛在菌株。但是，酸性副產(chǎn)物乳酸的積累仍是限制2,3_ 丁二醇產(chǎn)量提高的主要因 素，發(fā)酵過程中乳酸含量的增加，會抑制菌體的生長，不但降低了 2,3_ 丁二醇的產(chǎn)量，同時 增加了后續(xù)對2，3_ 丁二醇分離純化的復(fù)雜性。
[0003] 另外，還存在2,3_ 丁二醇轉(zhuǎn)化率低、生產(chǎn)強度低及純度低的技術(shù)問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明是為了解決目前產(chǎn)酸克雷伯氏菌產(chǎn)2,3_丁二醇產(chǎn)量低、轉(zhuǎn)化率低、生產(chǎn)強 度低及純度低的問題，提供高產(chǎn)2，3-丁二醇的產(chǎn)酸克雷伯氏基因工程菌株的構(gòu)建方法及其 發(fā)酵方法。
[0005] 本發(fā)明高產(chǎn)2,3_ 丁二醇的產(chǎn)酸克雷伯氏基因工程菌株的構(gòu)建方法，按以下步驟進(jìn) 行：
[0006] -、敲除ldh基因的產(chǎn)酸克雷伯氏基因工程菌株HD79-01的構(gòu)建：
[0007] 二、ack基因同源左臂片段ack-L和右臂片段ack-R的構(gòu)建：
[0008] 以敲除了ldh基因的產(chǎn)酸克雷伯氏基因工程菌株HD79-01基因組DNA為模板，分別 用 ack-Li、ack_L2 和 ack-Ri、ack_R2 引物進(jìn)行 PCR 反應(yīng)；
[0009] 三、pack-L 和 pack-R 質(zhì)粒構(gòu)建：
[0010]向含有ack基因同源左臂片段和右臂片段的PCR反應(yīng)體系中加入0.25yL Taq(5UAx L)DNA聚合酶，72°C水浴中反應(yīng)lOmin，將目的條帶膠回收純化，獲得片段ack-L和ack-R，將 片段ack-L和ack-R分別與pMD18-T載體連接，獲得克隆載體分別命名為pack-L和pack-R;
[0011] 四、pack-LR質(zhì)粒構(gòu)建；
[0012]以pack-L為骨架，選用限制性內(nèi)切酶Xho I和Bgl II對質(zhì)粒載體pldh-L進(jìn)行雙酶 切，選用限制性內(nèi)切酶Xho I和BamH I對質(zhì)粒載體pack-R進(jìn)行雙酶切，用T4DNA連接酶將 pack-R的酶切產(chǎn)物連接到pack-L質(zhì)粒載體上，得到重組質(zhì)粒pack-LR;
[0013] 五、pT_Kanr質(zhì)粒構(gòu)建：
[0014] 以pET-28a( + )為模板，利用Kan-up和Kan-down為擴增引物，對Kan"進(jìn)行PCR擴增， 對PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆，得到pT-Karf質(zhì)粒；
[0015] 六、同源重組片段ackL-Kanr-ackR的構(gòu)建：
[0016] 以重組質(zhì)粒pack-LR為骨架，選用限制性內(nèi)切酶Xho I對重組質(zhì)粒pT-Kaf和pack-LR進(jìn)行酶切，將獲得的Karf片段插入質(zhì)粒載體pack-LR中，構(gòu)建質(zhì)粒載體pT-LKR;
[0017] 選擇限制性內(nèi)切酶Bgl II和BamH I對重組質(zhì)粒pT-LCR進(jìn)行酶切，獲得同源重組片 段ackL_Kanr-ackR;
[0018] 七、K.oxytoca HD79_01/pKD46菌株構(gòu)建：
[0019] 將質(zhì)粒pKD46電轉(zhuǎn)化到K.oxytoca HD79-01 感受態(tài)細(xì)胞，得到K.oxytoca HD79-01/ pKD46菌株；
[0020] 八、同源重組片段ackL_Kanr-ackR轉(zhuǎn)化K.oxytoca HD79_01/pKD46:
[0021] 將同源重組片段ackL-Karf-ackR電轉(zhuǎn)化到K.oxytoca HD79-01/pKD46中，得到的 目的菌株為高產(chǎn)2,3_丁二醇的產(chǎn)酸克雷伯氏基因工程菌株K.ocytoca HD79-02。
[0022] 步驟一所述產(chǎn)酸克雷伯氏菌（K.oxytoca)HD79已在文獻(xiàn)《Klebisella oxytoca HD79乙酸激酶部分基因（ack)的克隆與序列分析》（中國農(nóng)學(xué)通報，2015。31(14):83-88)中 公開。
[0023] 上述方法構(gòu)建的產(chǎn)酸克雷伯氏基因工程菌株的發(fā)酵方法，按以下步驟進(jìn)行：
[0024] 一、將產(chǎn)酸克雷伯氏基因工程菌株K.oxytoca HD79-02的單菌落接種到種子液培 養(yǎng)基中，30 °C，150r/min培養(yǎng)至對數(shù)生長期，得種子液；
[0025]二、然后將種子液以5%的接種量接種到裝液量為150mL/500mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中， 于30°C，150r/min發(fā)酵156h后結(jié)束；
[0026]步驟一中所述種子液培養(yǎng)基配方：（NH4)2S〇4 lg/L、K2HP〇4 · 3H20 3.4g/L、 KH2P0U · 3g/L、MgS〇4 0 · 2g/L、酵母提取物lg/L、微量元素 2mlVL和鐵溶液lmL/L，調(diào)pH值至 7.0,121°C高壓滅菌15min，之后向每100mL種子培養(yǎng)基中加入經(jīng)108°C高壓滅菌20min的5g 葡萄糖粉末；
[0027]步驟二中所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方：（NH4)2S〇4 6.6g/L、K2HP〇4 · 3H20 8.7g/L、 KH2P〇46.8g/L、MgS〇4 · 7H20 0.25g/L、酵母提取物5g/L、FeS〇4 · 7H20 0.05g/L、ZnS〇4 · 7H20 0.001g/L、MnS〇4 · 7H20 0.001g/L和CaCl2 · 2H20 0.001g/L，調(diào)整溶液的pH值至7.0，121°C 高壓滅菌15min，然后在其中加入經(jīng)108°C高壓滅菌20min的葡萄糖粉末至濃度為150g/L。
[0028] 本發(fā)明的原理：
[0029] 本發(fā)明是針對已經(jīng)敲除了乳酸脫氫酶基因的產(chǎn)酸克雷伯氏基因工程菌株 1(1613丨86113(?71:〇〇3!1079-01，其酸性副產(chǎn)物乙酸的積累仍然限制2,3-丁二醇產(chǎn)量提高的 問題而設(shè)計的。ack基因編碼的乙酸激酶是乙酸代謝途徑的關(guān)鍵酶，本發(fā)明利用XRed同源重 組技術(shù)對K.oxytoca HD79-01中ack基因敲除，阻斷乙酸的生成途徑，促使碳流量更多流向 2，3-丁二醇，以期獲得2，3-丁二醇高產(chǎn)菌株。
[0030] 首先，通過PCR技術(shù)擴增得到乙酸激酶基因的同源左右兩臂片段，然后將該兩臂片 段連接到卡那霉素抗性基因的左右兩翼，形成一個表達(dá)盒ackL-Karf-ackR。將該表達(dá)盒轉(zhuǎn) 入產(chǎn)酸克雷伯氏菌K.oxytoca HD79-01中，通過同源重組的方式，以卡那霉素抗性基因替代 乙酸激酶基因，從而完成對乙酸激酶基因的敲除。獲得突變株由于不能有效的產(chǎn)生乙酸，使 菌株代謝通路發(fā)生改變，提高了 2，3-丁二醇的產(chǎn)量。
[0031] 本發(fā)明的有益效果：
[0032] 本發(fā)明成功敲除產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebisella oxytoca)HD_79的ldh基因和ack基 因，構(gòu)建Klebisella oxytocaHD-79-02菌株，減少乙酸和乳酸的產(chǎn)量，提高了2,3-丁二醇的 產(chǎn)量。
[0033] 其中2,3-丁二醇的產(chǎn)量由29.838/1提高到46.218/1，提高了54.9%。而乳酸則由 4 · 94g/L下降到2 · 45g/L，降低了 48 · 2 %。乙酸則由 4 · 28g/L下降到 1 · 59g/L，降低了 62 · 8 % · [0034] 2，3-丁二醇轉(zhuǎn)化率提高了20 · 5% ; 2，3-丁二醇的生產(chǎn)強度提高了 106 · 5%。另外， 利用該菌株獲得的2，3_丁二醇純度由57.9%增加到71.2%。同時敲除ldh和ack會對菌體的 0D_ nm值降低，但是單一的憑借0D值并不能判斷重組菌株的產(chǎn)2,3-BD的能力，本發(fā)明就是為 此提供了一個很好的證明。
[0035] 本發(fā)明關(guān)于基因敲除高效生產(chǎn)2,3_ 丁二醇的構(gòu)建研究將為今后基因功能的研究 提供理論依據(jù)。
【附圖說明】
[0036] 圖1為ack-L基因和ack-R基因 PCR擴增產(chǎn)物電泳圖；其中Μ為DNA Marker DL2000， 泳道1為ack-L基因 PCR產(chǎn)物，泳道2為ack-R基因 PCR產(chǎn)物；
[0037] 圖2為ack-L基因陽性克隆菌液PCR驗證結(jié)果;其中Μ為DNA Marker DL2000,泳道1-5為陽性克隆菌液PCR擴增產(chǎn)物；
[0038] 圖3為ack-R基因陽性克隆菌液PCR驗證結(jié)果;其中Μ為DNA Marker DL2000,泳道1-5為陽性克隆菌液PCR擴增產(chǎn)物；
[0039] 圖4為Kan-up、Kan-down引物對的PCR擴增結(jié)果;其中Μ為DNA Marker DL2000;泳道 1-2為Karf基因的PCR產(chǎn)物；
[0040] 圖5為Karf基因陽性克隆菌液PCR驗證結(jié)果;其中Μ為DNA Marker DL2000,泳道1-5 為陽性克隆菌液PCR擴增產(chǎn)物；
[0041 ]圖6為ack-Li、ack-R2引物對PCR結(jié)果；其中Μ為DNA Marker DL2000,泳道 1-2為PCR 產(chǎn)物
[0042]圖7為出發(fā)菌株和重組菌株的pH值及0D值對比，其中?表示出發(fā)菌株K.oxytoca HD79的0D值，?表示重組菌K.oxytoca HD79-02的0D值，▲表示出發(fā)菌株K.oxytoca HD79的 pH值，Λ表示重組菌K · oxytoca HD79-02的pH值；
[0043] 圖8為出發(fā)菌株和重組菌株的葡萄糖消耗及2,3_丁二醇產(chǎn)量對比，其中?表示出 發(fā)菌株K. oxytoca HD79的葡萄糖消耗，