一株高效分泌d-阿洛酮糖 3-差向異構(gòu)酶的基因工程菌株、構(gòu)建方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株高效分泌表達(dá)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的枯草芽孢桿菌基因工程菌株及其構(gòu)建方法，以及將基因工程菌株用于發(fā)酵生產(chǎn)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]稀少糖是存在于自然界中但含量極少的一類單糖及衍生物。隨著人們對(duì)這類糖逐步了解，以阿洛酮糖與塔格糖為核心的功能性稀少糖研究得到迅速的發(fā)展，并引起眾多研究者的關(guān)注。D-阿洛酮糖(D-Psicose)是一種稀有糖，它是D-果糖在C3位置的差向異構(gòu)體。D-阿洛酮糖極其少量地存在于某些商業(yè)化的糖類和農(nóng)產(chǎn)品中，并且很難通過化學(xué)方法進(jìn)行合成。比如，D-阿洛酮糖存在于小麥、甘蔗和甜菜糖蜜中，也少量地存在于商業(yè)化的D-葡萄糖和D-果糖中。
[0003]D-阿洛酮糖的甜度為蔗糖的70%，然而其能量值僅為0.007 kcal/g，且能量吸收效率僅為蔗糖的0.3%，所以D-阿洛酮糖是一種非常理想的低卡路里甜味劑。D-阿洛酮糖已經(jīng)被證明具有降血糖的作用，還可以抑制肝臟脂肪合成酶腸道α-糖苷酶的活性，從而減少腹部脂肪的累積。D-阿洛酮糖針對(duì)6-羥多巴胺誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有神經(jīng)保護(hù)作用，也可以抑制因高含量葡萄糖刺激產(chǎn)生的單核細(xì)胞趨化性蛋白-1的表達(dá)，因此D-阿洛酮糖在治療神經(jīng)退行性和動(dòng)脈粥樣硬化疾病方面有很高的醫(yī)療價(jià)值。在食品行業(yè)中，D-阿洛酮糖因?yàn)槠涮鸲?、高溶解度、極低卡路里和很低的血糖反應(yīng)的特點(diǎn)而被視為一種理想的蔗糖替代品。向食物中添加D-阿洛酮糖可以增加食物的凝固作用，且阿洛酮糖可以通過與食物蛋白產(chǎn)生美拉德反應(yīng)而使食物具有更好的味道。與D-果糖和D-葡萄糖相比，D-阿洛酮糖可以產(chǎn)生更多抗氧化的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，以使食物維持較高的抗氧化狀態(tài)，從而具有更長(zhǎng)的保質(zhì)期。此外，還有報(bào)道稱D-阿洛酮糖可以提高蛋清蛋白的起沫性能以及黃油餅干的質(zhì)量。總之，D-阿洛酮糖在食品、保健及醫(yī)藥品領(lǐng)域有著十分重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0004]2011年8月，D-阿洛酮糖被Π)Α認(rèn)定為是安全的(GRAS)，并且被允許在一定范圍的食物和食品中用作添加劑。因此，D-阿洛酮糖具有廣闊的市場(chǎng)前景。據(jù)我們所知，D-阿洛酮糖只在日本(Matsutani Chemical Industry C0., Ltd, and Raresweet C0.Ltd.)和韓國(guó)(CJ Cheiljedang, Inc.)實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。目前，生產(chǎn)D-阿洛酮糖的技術(shù)主要包括提取法、化學(xué)合成法和生物轉(zhuǎn)化法。但是D-阿洛酮糖在自然界中的含量極低，提取法明顯不適宜D-阿洛酮糖的大規(guī)模生產(chǎn);化學(xué)合成法不僅成本高、產(chǎn)量低，而且會(huì)產(chǎn)生比較嚴(yán)重的環(huán)境污染。生物轉(zhuǎn)化法可以利用自然界廣泛存在的單糖或某些單糖的加工副產(chǎn)物為原料，不僅成本較低，而且轉(zhuǎn)化效率也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于提取法，是規(guī)?；苽銬-阿洛酮糖的重要技術(shù)手段。使用DTEase家族的酶通過差向異構(gòu)作用使D-果糖與D-阿洛酮糖之間進(jìn)行相互轉(zhuǎn)化是生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)D-阿洛酮糖的主要方法。DTEase家族酶類的基因有多種來源，但是目前只有少數(shù)幾種酶得到比較系統(tǒng)的研究。1993年，Izumori et al ( 1993 )首次報(bào)道了來源于Pseudomonas cichorii ST-24的一種新酶，發(fā)現(xiàn)該酶可以催化酮糖在C3位置的差向異構(gòu)，其最適底物為D-塔格糖，因此將其命名為D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶。Kim et al (2006)報(bào)道了來源于Agrobacterium tumefaciens的DTEase酶類的另一種特性，即可以特異性催化D-果糖和D-阿洛酮糖之間的相互轉(zhuǎn)化，因其對(duì)D-阿洛酮糖的底物特異性最高，遂將其命名為D-阿洛酬糖 3_差向異構(gòu)酶(DPEase)。近年來，來自 Rhodobacter sphaerof ides SK011、Clostridium celluloyticm H10、Ruminocossus sp.5_l_39BFAA、Clostridium scindensATCC35704、Desmospora sp.8437 和Clostridium bolteae ATCC BAA-613的DPEase的基因也陸續(xù)被克隆和表達(dá)，其酶學(xué)性質(zhì)也被詳細(xì)地研究。
[0005]到目前為止，文獻(xiàn)和專利中的DPEase酶類主要在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，大腸桿菌外膜包含脂多糖，是一種可以引起人類和哺乳動(dòng)物發(fā)熱的內(nèi)毒素，而終產(chǎn)物中內(nèi)毒素的去除則明顯加大了產(chǎn)物純化的復(fù)雜性;此外，在大腸桿菌中，蛋白的合成通常發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)，為了獲得大量的目標(biāo)蛋白，需要將細(xì)胞進(jìn)行破壞以使細(xì)胞內(nèi)的蛋白釋放出來，這一附加的過程勢(shì)必將增加蛋白的生產(chǎn)成本?？莶菅挎邨U菌為革蘭氏陽性細(xì)菌，是傳統(tǒng)的工業(yè)生產(chǎn)菌。其生產(chǎn)的蛋白可以被大量釋放到培養(yǎng)基中，從而大大縮減下游的蛋白純化過程，顯著降低目標(biāo)蛋白生產(chǎn)成本;同時(shí)枯草芽孢桿菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單且不含內(nèi)毒素，美國(guó)FDA已將其列為GRAS (Generally Recognized As Safe)級(jí)別的微生物。因此，采用枯草芽孢桿菌進(jìn)行D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的生產(chǎn)比大腸桿菌具有更大的優(yōu)勢(shì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的之一是提供含有編碼來源于瘤胃菌D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因rdpe的各種重組表達(dá)質(zhì)粒。
[0007]所述D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因rdpe的序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]本發(fā)明的目的之二是提供一株高效分泌表達(dá)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的基因工程菌株1A751SD-XR，是將來源于質(zhì)粒pMA5且包含木糖啟動(dòng)子PxyIA和瘤胃菌D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因rdpe的重組質(zhì)粒為表達(dá)載體，以枯草芽孢桿菌為宿主構(gòu)建得到的基因工程菌株，所述宿主是枯草芽孢桿菌168、14751、18600、18700、18800或以上菌株后代細(xì)胞中的一種。
[0009]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述枯草芽孢桿菌是B.subtilis 1A751。
[0010]本發(fā)明的目的之三是提供該高效分泌表達(dá)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因工程菌株的構(gòu)建方法，主要包括以下步驟= (I)PCR擴(kuò)增或化學(xué)合成rdpe基因序列；(2)將rdpe基因插入表達(dá)質(zhì)粒PMA5，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pMA5-RDPE ； (3)將pMA5_RDPE轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，獲得重組菌株1A751-HR;(4)以三個(gè)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PxylA、Pglv和PsacB替換pMA5-RDPE上的組成型啟動(dòng)子 Ρ_π，分別構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 pMA5-PxyiA-RDPE、pMA5-Pgiv—RDPE 和 pMA5-PsacB-RDPE。(5)將 pMA5-PxyiA_RDPE、pMA5-Pgiv-RDPE 和 pMA5-Psac；B-RDPE 分別轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，獲得重組菌 1A751-XR、1A751-GR 和 1A751-SRJ6)敲除基因 xylAB(xylA 和 xylB)，獲得菌株 1A751SD，導(dǎo)入重組表達(dá)質(zhì)粒pMA5-Pxy ia-RDPE，從而獲得基因工程菌株IA751SD-XR。
[0011]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，重組表達(dá)質(zhì)粒PMA5-RDPE上的啟動(dòng)子Pfipall分別被誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PxyIA、Pglv和PsacB替換。
[0012]本發(fā)明的目的之四是提供應(yīng)用上述基因工程菌分泌生產(chǎn)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的方法，主要包括以下步驟:將重組菌用種子培養(yǎng)基活化后，將種子液以0.5%?5%接種量轉(zhuǎn)入裝液量50%?70%的發(fā)酵罐中，通氣量1.0?2.0 vvm，攪拌轉(zhuǎn)速100?800 rpm，pH不作控制，于37 °C培養(yǎng);待發(fā)酵液OD_穩(wěn)定后以恒定流速進(jìn)行補(bǔ)料;發(fā)酵培養(yǎng)基成分為2.0%?4.0%蛋白胨、3.0%-7.0%酵母提取物、0.3%-0.9%磷酸氫二鉀和1.0%-3.0%可溶性淀粉，初始pH 7.2;補(bǔ)料培養(yǎng)基為2.0%?8.0%可溶性淀粉。當(dāng)基因工程菌株需誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，待發(fā)酵液OD6qq達(dá)到0.8時(shí)添加一定濃度的誘導(dǎo)物。
[0013]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將重組菌用種子培養(yǎng)基活化后，將種子液以1.0%接種量轉(zhuǎn)入裝液量60%的發(fā)酵罐中，通氣量2.0 vvm,攪拌轉(zhuǎn)速200?600 rpm，pH維持在7.2，于37 0C培養(yǎng);發(fā)酵培養(yǎng)基成分為3.0%蛋白胨、5.0%酵母提取物、0.6%磷酸氫二鉀和2.0%可溶性淀粉，初始PH 7.2;補(bǔ)料培養(yǎng)基為8.0%可溶性淀粉。當(dāng)基因工程菌株需誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，待發(fā)酵液OD6qq達(dá)到0.8時(shí)添加一定濃度的誘導(dǎo)物。
[0014]本發(fā)明的目的之五是提供一種高效表達(dá)分泌D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的方法，以重組表達(dá)了瘤胃菌來源的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因rdpe的枯草芽孢桿菌為生產(chǎn)菌株，發(fā)酵生產(chǎn)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶RDPE。
[0015]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，構(gòu)建基因工程菌株1A751-HR、1A751-XR、1A751-GR、1八751-31?或147513011?;發(fā)酵培養(yǎng)基為2.0%~4.0%蛋白胨、3.0%~7.0%酵母提取物和0.3%?0.9%磷酸氫二鉀;于37°C、200rpm搖瓶發(fā)酵。當(dāng)基因工程菌株需誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，待發(fā)酵液OD600達(dá)到0.8時(shí)添加一定濃度的誘導(dǎo)物。
[0016]本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)的有益效果:本發(fā)明首次以枯草芽孢桿菌為表達(dá)宿主，實(shí)現(xiàn)了瘤胃菌來源D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的高效分泌表達(dá)，重組D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的分泌量達(dá)到2.6 g/L，約占上清液總蛋白量的70%，酶活力約為95 U/mL。該產(chǎn)量是國(guó)際上已有報(bào)道的最高表達(dá)分泌水平。目前D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的生產(chǎn)宿主大多采用大腸桿菌且在胞內(nèi)表達(dá)，純化蛋白前需要進(jìn)行復(fù)雜的細(xì)胞破碎處理。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌基因工程菌株高效分泌表達(dá)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶，大大簡(jiǎn)化了蛋白純化流程且明顯降低了