生產(chǎn)費用?？紤]D-阿洛酮糖3-差向異構酶的附加值，本發(fā)明的表達水平已達到工業(yè)化生產(chǎn)要求。
【附圖說明】
[0017]圖1為重組質粒pMA5-RDPE的構建流程。
[0018]圖2為基因工程菌株B.subtilis 1A751-HR分泌表達D-阿洛酮糖3_差向異構酶的SDS-PAGE圖譜。1A751為負對照；1A751C為將pMA5空質粒轉化1A751得到的菌株，也作為負對照；1A751-HR為將pMA5-RDPE轉化1A751得到的菌株。Marker表示蛋白分子質量標準。箭頭所指示的條帶為D-阿洛酮糖3-差向異構酶蛋白。
[0019]圖3為三個誘導型表達質粒的構建流程。PxylA為來源于巨大芽孢桿菌的木糖誘導啟動子;Pglv為來源于枯草芽孢桿菌的麥芽糖誘導啟動子;Ρ.β為來源于枯草芽孢桿菌的蔗糖誘導啟動子。
[0020]圖4為RDPE在枯草芽孢桿菌中誘導表達結果。Α，木糖誘導RDPE分泌表達的結果。B，麥芽糖誘導RDPE分泌表達的結果。C，蔗糖誘導RDPE表達的結果。發(fā)酵時間為72 h。
[0021 ] 圖5為基因工程菌株1A751SD-XR在不同木糖濃度誘導下分泌表達RDPE的結果。A，胞外酶活測定。B，SDS-PAGE分析。發(fā)酵時間為72 h。
[0022]圖6為采用分批-補料發(fā)酵工藝在7.5 L發(fā)酵罐中(裝液量3.0 L)進行發(fā)酵。A:發(fā)酵曲線。B = SDS-PAGE分析。實驗顯示84 h D-阿洛酮糖3-差向異構酶活性最高。
[0023]
【具體實施方式】
[0024]在本發(fā)明中所使用的術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。
[0025]下面結合具體的制備實施例和應用實施例，并參照數(shù)據(jù)進一步詳細地闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明的范圍。
[0026]在以下的實施例中，未詳盡描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規(guī)方法。
[0027]實施例1D-阿洛酮糖3-差向異構酶基因片段的獲得
根據(jù)來源于瘤胃菌(Ruminococcus sp.5_1_39B_FAA)的DPEase編碼基因rdpe序列進行全基因合成，并在該基因核苷酸序列的5 ’和3，端分別引入NdeI和BamHI限制性酶切位點，以方便后續(xù)的表達載體構建。合成好的基因連接到PUC57載體上，命名為pUC57-RDPE。
[0028]實施例2D-阿洛酮糖3-差向異構酶的組成型表達
將質粒PUC57-RDPE和pMA5分別進行NdeI和BamHI雙酶切處理;雙酶切反應條件為37°C水浴3 hο將雙酶切產(chǎn)物分別進行膠回收，得到兩端分別帶有NdeI和BamHI酶切位點的rdpe片段和線性化的PMA5載體，將兩者以T4連接酶在4°C冰箱中進行過夜連接;連接產(chǎn)物轉化大腸感受態(tài)細胞DH5a，以氨芐霉素(100 yg/mL)進行抗性篩選，通過菌落PCR篩選陽性克隆，并提取質粒進行測序驗證。質粒構建結果見圖1，所構建的含有該rdpe基因的重組表達質粒命名為 PMA5-RDPE。
[0029]將組成型表達質粒pMA5-RDPE通過Spizizen轉化方法轉入1A751感受態(tài)細胞，涂布于卡那霉素(50 yg/mL)平板過夜培養(yǎng)，以菌落PCR篩選陽性克隆，得到重組菌株1A751-HR。將重組菌株1A751-HR接種于含5 mL SR培養(yǎng)基(1.5%蛋白胨，3.0%酵母提取物和0.3%K2HP04，pH 7.2)的試管中，并添加50 yg/mL卡那霉素用于維持質粒穩(wěn)定，在37°C、200 rpm條件下培養(yǎng)18 h。隨后，取300 yL試管中菌液接種于裝有30 mL 2XSR培養(yǎng)基(3.0%蛋白胨，6.0%酵母提取物和0.6% K2HPO4, pH 7.2)的搖瓶(250 mL)中，并添加50 yg/mL卡那霉素，在37°C、200 rpm條件下培養(yǎng)72 h。隨后取出發(fā)酵液，12000 rpm離心5 min得到發(fā)酵液上清，即為粗酶液;將離心后的菌體用I3BS重懸，進行超聲破碎，12000 rpm離心5 min得到破碎細胞上清。上述相關方法均采用常規(guī)操作步驟。
[0030]取粗酶液和破碎細胞上清分別進行酶活測定，結果顯示胞外和胞內RDPE活性分別為17 U/mL和4 U/mL;SDS-PAGE分析顯示胞內和胞外在相對分子質量約33 kDa處均有明顯的條帶，與RDPE分子質量理論值大小一致，且胞外目標蛋白量明顯多于胞內(如圖2所示)。綜上可知，大部分表達的RDPE被分泌到胞外。
[0031]實施例3D-阿洛酮糖3-差向異構酶的誘導型表達
木糖啟動子PxyiA序列、麥芽糖啟動子PgIv序列和蔗糖啟動子PsacB序列分別如SEQ IDN0.2、SEQ ID N0.3和SEQ ID 勵.4所示，設計引物叉71八沖八71八-1?41￥-?/^1￥-1?和8&084/sacB-R。以xyΙΑ-F/xyIA-R為引物，以質粒pHCMC04為模板進行PCR得到PxyIA片段;分別以glv-F/glv-R和sacB-F/sacB-R為引物，以枯草芽孢桿菌1A751基因組為模板進行PCR得到Pgiv和Ρ.β片段。設計弓I物pMA5-RDPE-F/pMA5-RDPE-R，以pMA5_RDPE為模板進行PCR，獲得線性化的PMA5-RDPE載體片段。以上所述引物序列如下:
XylA-F:5’-CAGCCTCGCAGAGCACACACTTTATGGGCGCGCCTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAAC-3’XylA-R:5’-CAATAAGCGTAATAAATACCATATTTCATATGATTTCCCCCTTTGATTTAAGTGATTTCC-3’Glv-F:5’-CAGCCTCGCAGAGCACACACTTTATGGGCGCGCCCGCGGATCCCTTTTGTCCCCTG-3’Glv-R:5’-CCAATAAGCGTAATAAATACCATATTTCATATGCGGGGTACCATGACGACCTCCTTG-3’sacB-F:5’-CAGCCTCGCAGAGCACACACTTTATGGGCGCGCCGATCCTTTTTAACCCATCACATATAC-3’sacB-R:5 ’-CCAATAAGCGTAATAAATACCATATTTCATATGCGTTCATGTCTCCTTTTTTATGTAC-3’ρΜΑδ-RDPE-F: 5’-CATATGAAATATGGTATTTATTACGCTTATTGG-3’ρΜΑδ-RDPE-R: 5’-AAGGCGCGCCCATAAAGTGTGTGCTCTGCGAGGCTG-3’
將PxyiA片段、Pgiv片段和PsacB片段分別與pMA5-RDPE載體片段進行POE-PCR (Prolongedoverlap extens1n PCR)，插入片段與載體片段摩爾比為1:1，延伸時間以載體長度為準，得到融合產(chǎn)物。將融合DNA產(chǎn)物直接轉化大腸感受態(tài)細胞DH5a，涂布于含100 yg/mL氨芐霉素的LB平板上，以菌落PCR篩選陽性克隆。將陽性克隆接種于LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，提質粒進行測序驗證。質粒構建結果見圖3，所構建的含有該RDPE基因的重組表達質粒分別命名為pMA5-Pxyia-RDPE，pMA5_Pgiv-RDPE和pMA5-PsacB-RDPE。
[0032]將誘導型表達質粒pMA5-PxyiA_RDPE，pMA5_Pgiv-RDPE和pMA5-PsacB-RDPE通過Spizizen轉化方法分別轉入1A751感受態(tài)細胞，涂布于卡那霉素(50 yg/mL)平板上過夜培養(yǎng)，以菌落PCR進行驗證，得到重組菌株1A751-XR，1A751-GR和1A751-SR。將以上重組菌株分別接種于含5 mL SR培養(yǎng)基(50 yg/mL卡那霉素)的試管中，在37°C、200 rpm條件下培養(yǎng)18 h。隨后，取300 yL試管中菌液接種于含30 mL 2XSR培養(yǎng)基(50 yg/mL卡那霉素)的搖瓶(250 mL)中，在37°C、200 rpm條件下培養(yǎng)。待發(fā)酵液OD6qq達到0.8時，分別添加不同濃度的誘導物(0.0%，2.0%，4.0，6.0和8.0% (w/v)木糖;0.0%，2.0%，4.0，6.0和8.0%(w/v)麥芽糖;0.0%，2.0%，4.0，6.0和8.0%(w/v)蔗糖)進行誘導表達。發(fā)酵72 h，取出發(fā)酵液，分別進行酶活檢測和SDS-PAGE分析(如圖4所示)，具體方法同于實施例2。
[0033]結果顯示，三個誘導型啟動子中，木糖啟動子PxylA的強度是最強的；在木糖的添加濃度為4.0%時，胞外的RDPE酶活最高，達到37 U/mL，是RDPE組成型表達的2.2倍。SDS-PAGE分析也證實了以上結果。
[0034]實施例4木糖利用基因xylAB的敲除 I)木糖濃度變化測定
根據(jù)實施例3中的最終結果，對木糖誘導表達系統(tǒng)進行進一步分析。將重組菌株1A751-XR進行搖瓶發(fā)酵，具體方法同于實施例3。待發(fā)酵液OD6qq達到0.8左右時添加4.0%木糖進行RDPE的誘導表達，每隔12 h進行取樣。對胞外木糖濃度進行測定，結果顯示72 h木糖濃度為
0.2%。表明絕大多數(shù)木糖已被枯草芽孢桿菌消耗利用，從而會影響RDPE的誘導表達。因此，為了進一步提高RDPE的分泌水平，對木糖利用基因xy lAB(xy IA和xy 1B)進行敲除。
[0035]2)構建基因敲除菌株
以實驗室所保存菌株IA751S(amyE::ParaR-spe)為出發(fā)菌株。設計合成引物UP-F/R、DN-F/R、CR-F/R和G-F/R，以枯草芽孢桿菌168基因組為模板，擴增DNA片段UP、DN、CR和G。以上所述引物序列如下: