本發(fā)明涉及一種基于mgb探針的qpcr檢測熊膽膠囊中熊源性成分的檢測方法，涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明檢測方法特異性好、靈敏度高、重復(fù)性好。

背景技術(shù)：

亞洲傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，熊膽汁有清熱解毒、平肝明目、殺蟲止血的功效。黑熊膽和棕熊膽是制作熊膽膠囊制品的主要原材料。在巨大的經(jīng)濟(jì)利益刺激下，許多不法商販用其他動(dòng)物源性的膽來冒充熊膽。所以，迫切需要一種高效準(zhǔn)確的檢測方法。

傳統(tǒng)的熊膽膠囊制品分子檢測手段，首先提取熊膽膠囊制品中的dna，再利用引物擴(kuò)增目的片段，最后通過測序比對(duì)的方法來鑒定熊膽膠囊的真?zhèn)?。但是由于熊膽膠囊制品中dna降解和片段化較為嚴(yán)重，很難擴(kuò)增出能夠滿足測序分析的長序列，同時(shí)當(dāng)待測樣品為摻假樣品時(shí)，也很難有效的鑒定。

實(shí)時(shí)熒光定量pcr(quantitativereal-timepcr)是一種在dna擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)檢測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對(duì)待測樣品中的特定dna序列進(jìn)行定性定量分析的方法。該方法通過熒光信號(hào)的分析，對(duì)pcr進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測。探針法是qpcr中的一種常見方法，在反應(yīng)體系中加入化學(xué)修飾的寡聚核苷酸探針。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，無法檢測到熒光信號(hào)。而當(dāng)pcr擴(kuò)增時(shí)，taqdna酶的5’-3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)間的能量傳遞結(jié)構(gòu)被破壞，從而熒光檢測系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條dna鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與pcr產(chǎn)物的形成完全同步。mgb探針是在傳統(tǒng)taqman水解探針基礎(chǔ)上的改進(jìn)，通過在探針的3’端加入mgb基團(tuán)，從而提高探針的退火溫度，縮短探針的長度，提高探針的特異性和靈敏度。

本發(fā)明建立了一種對(duì)于熊膽膠囊制品的實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測方法，利用mgb探針，能夠高效、準(zhǔn)確和更快速的檢測熊膽膠囊制品中是否含有黑熊和棕熊源性的成分，還可以對(duì)熊膽膠囊制品dna提取液中的熊源性成分進(jìn)行定量分析。同時(shí)能對(duì)常用于在熊膽膠囊中摻假的牛、豬源性成分進(jìn)行分析鑒定。coi基因是目前國內(nèi)外廣泛認(rèn)可的dna條碼，本發(fā)明針對(duì)coi基因設(shè)計(jì)引物和mgb探針。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是設(shè)計(jì)針對(duì)黑熊、棕熊以及常見摻偽物牛和豬的引物和探針。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是為了克服現(xiàn)有分子生物學(xué)檢測技術(shù)的不足之處，建立一種使用方便、快捷、準(zhǔn)確的熊膽膠囊中熊源性成分的檢測方法。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是利用以上的引物探針和構(gòu)建的檢測方法，對(duì)熊膽膠囊制品進(jìn)行定性定量檢測。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下方案：

1、dna的提取體系

樣品的dna提取參照axygen動(dòng)物基因組提取試劑盒說明書進(jìn)行，取半個(gè)熊膽膠囊內(nèi)容物、20mg棕熊、黑熊、豬和牛等肌肉組織，放置于2ml離心管中，加入350μlpbs和0.9μlrnasea，用剪刀溫和的剪碎組織30s。加入150μl裂解液和20μl蛋白酶k，立即渦旋振蕩1min混合均勻。短暫離心后，將離心管至于56℃水浴中過夜消化處理。加入350μl蛋白去除液，渦旋振蕩30s均勻混合，12000r/min離心10min。將dna制備管至于2ml離心管中，將離心后的混合液上清移至制備管中，12000r/min離心1min。棄掉濾液，加入500μl洗滌液，12000r/min離心1min。棄掉濾液，加入700μl去鹽液，12000r/min離心1min。棄濾液，重復(fù)一次去鹽過程。棄濾液后，空管離心一分鐘。將dna制備管轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中，加入65℃預(yù)熱的tris-hcl洗脫液100μl洗脫制備管中dna，-20℃冷凍備用。

2、引物和探針的設(shè)計(jì)

選取genbank上已發(fā)表的黑熊(ef667005)、棕熊(ap012593)、牛(ku891849)和豬(kt279758)的線粒體coi序列，利用blast進(jìn)行比對(duì)后，選擇物種特異的dna序列，利用abiprimerexpress3.0設(shè)計(jì)引物與mgb探針，primer6.0分析引物二級(jí)結(jié)構(gòu)，將所設(shè)計(jì)的引物和探針利用blast再次進(jìn)行比對(duì)分析，確保引物與探針的特異性。

引物探針設(shè)計(jì)結(jié)果：

3、本發(fā)明中單重qpcr檢測方法的建立

在taq-hsprobeqpcrpremix的基礎(chǔ)上，建立20μl反應(yīng)體系，其中上下游引物和mgb探針的量從0.3μl到1.5μl，以0.1μl為梯度遞加。反應(yīng)體系中加入模板2μl其余用水補(bǔ)足。根據(jù)熒光定量pcr的結(jié)果，選擇最大的熒光增量和最好的曲線走勢作為判定標(biāo)準(zhǔn)，選擇引物和探針的最適量。

最優(yōu)反應(yīng)體系：

pcr反應(yīng)程序如下：94℃2min；94℃10s；60℃30s；60℃1min；40個(gè)循環(huán)，循環(huán)在退火時(shí)收集熒光信號(hào)。

判圖原則：ct值小于等于30并有明顯擴(kuò)增曲線判為陽性；ct值大于等于35判為陰性；ct值介于30～35之間判為可疑，dna模板加倍重復(fù)實(shí)驗(yàn)，如果ct值小于等于30并擁有明顯擴(kuò)增曲線判為陽性，否則判為陰性。

4、本發(fā)明中單重qpcr特異性實(shí)驗(yàn)

利用四種單重引物和探針，分別加入棕熊、黑熊、牛、豬、豹、狐貍、狗、金絲猴、馬鹿、猞猁、駝鹿、小靈貓、豹貓、梅花鹿、雪豹、馬來熊、漠貓的dna模板進(jìn)行單重?zé)晒馓禺愋缘膶?shí)驗(yàn)，反應(yīng)體系按照單重?zé)晒舛縫cr檢測方法所確定的最佳反應(yīng)體系建立。

5、本發(fā)明中單重qpcr的靈敏度實(shí)驗(yàn)

將黑熊和棕熊的dna提取液原液按照10倍的梯度倍比稀釋，得到10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6倍的dna原液。依次用相應(yīng)的黑熊和棕熊引物和探針進(jìn)行檢測。

6、本發(fā)明中雙重qpcr的特異性實(shí)驗(yàn)

將黑熊、棕熊的引物探針，牛和豬的引物探針分別混合。各自分別加入黑熊、棕熊、牛、豬、豹、狐貍、狗、金絲猴、馬鹿、猞猁、駝鹿、小靈貓、豹貓、梅花鹿、雪豹、馬來熊、漠貓的dna模板。檢測雙重?zé)晒怏w系的特異性情況。

7、混合dna樣品實(shí)驗(yàn)

分別將黑熊和棕熊、黑熊和牛、棕熊和豬、牛和豬的dna樣品按照1：1、1：10、10：1的比例混合。利用與混合模板相對(duì)應(yīng)的引物和探針進(jìn)行熒光定量pcr檢測實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證混合樣品的檢測效果。

8、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

將黑熊和棕熊的dna模板稀釋到1ng/μl，利用相應(yīng)的引物和探針進(jìn)行重復(fù)檢測，用于驗(yàn)證濃度下的重復(fù)性。取黑熊、棕熊樣品各10個(gè)，分別用黑熊、棕熊相應(yīng)的引物和探針進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果進(jìn)行回判率分析。

9、定量分析

利用黑熊和棕熊的引物，對(duì)黑熊和棕熊dna模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，體系建立和pcr條件如下：

反應(yīng)體系：

pcr反應(yīng)程序：94℃2min；94℃10s；60℃30s；60℃1min；40個(gè)循環(huán)

對(duì)黑熊和棕熊pcr擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收，利用微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行濃度測定。對(duì)切膠回收的黑熊和棕熊pcr產(chǎn)物進(jìn)行10倍的倍比稀釋，共設(shè)置5個(gè)濃度點(diǎn)。參照以上所述的qpcr反應(yīng)體系和程序進(jìn)行qpcr，每個(gè)濃度點(diǎn)設(shè)置三個(gè)重復(fù)樣，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品中的黑熊和棕熊dna模板濃度進(jìn)行測定。

附圖說明

圖1黑熊引物探針特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2棕熊引物探針特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3牛引物探針特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖4豬引物探針特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖5黑熊的梯度靈敏度實(shí)驗(yàn)

圖6棕熊的梯度靈敏度實(shí)驗(yàn)

圖7黑熊、棕熊模板1：1混合檢測結(jié)果

圖8棕熊、黑熊模板10：1混合檢測結(jié)果

圖9棕熊、黑熊模板1：10混合檢測結(jié)果

圖10棕熊、豬模板10：1混合檢測結(jié)果

圖111ng/μl黑熊、棕熊模板檢測結(jié)果

圖1220個(gè)樣品回判率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖13黑熊標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖14棕熊標(biāo)準(zhǔn)曲線

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

未知成分熊膽膠囊制品的檢測

1、dna的提取體系

樣品的提取參照axygen動(dòng)物基因組提取試劑盒說明書進(jìn)行，取半個(gè)熊膽膠囊內(nèi)容物，放置于2ml離心管中，加入350μlpbs和0.9μlrnasea。加入150μl裂解液和20μl蛋白酶k，立即渦旋振蕩1min混合均勻。短暫離心后，將離心管至于56℃水浴中過夜消化處理。加入350μl蛋白去除液，渦旋振蕩30s均勻混合，12000r/min離心10min。將dna制備管至于2ml離心管中，將離心后的混合液上清移至制備管中，12000r/min離心1min。棄掉濾液，加入500μl洗滌液，12000r/min離心1min。棄掉濾液，加入700μl去鹽液，12000r/min離心1min。棄濾液，重復(fù)一次去鹽過程。棄濾液后，空管離心一分鐘。將dna制備管轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中，加入65℃預(yù)熱的tris-hcl洗脫液100μl洗脫制備管中dna，-20℃冷凍備用。

2、體系和程序

對(duì)于待測樣品，分別用20μl混合有棕熊和黑熊探針引物的反應(yīng)體系和20μl混合有牛和豬探針引物的反應(yīng)體系進(jìn)行檢測分析。

20μl反應(yīng)體系：

pcr反應(yīng)程序如下：94℃2min；94℃10s；60℃30s；60℃1min；40個(gè)循環(huán)，循環(huán)在退火時(shí)收集熒光信號(hào)。

判圖原則：ct值小于等于30并有明顯擴(kuò)增曲線判為陽性；ct值大于等于35判為陰性；ct值介于30～35之間判為可疑，dna模板加倍重復(fù)實(shí)驗(yàn)，如果ct值小于等于30并擁有明顯擴(kuò)增曲線判為陽性，否則判為陰性。

3、定量分析

利用黑熊和棕熊的引物，對(duì)黑熊和棕熊dna模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，體系建立和pcr條件如下：

反應(yīng)體系：

pcr條件：94℃2min；94℃10s；60℃30s；60℃1min；40個(gè)循環(huán)

對(duì)黑熊和棕熊pcr擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收，利用微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行濃度測定。對(duì)切膠回收的黑熊和棕熊pcr產(chǎn)物進(jìn)行10倍的倍比稀釋，共設(shè)置5個(gè)濃度點(diǎn)。參照以上所述的qpcr反應(yīng)體系和程序進(jìn)行qpcr擴(kuò)增，每個(gè)濃度點(diǎn)設(shè)置三個(gè)重復(fù)樣，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品中的黑熊或棕熊dna模板濃度進(jìn)行測定。

4、檢測結(jié)果

結(jié)果表明，未知熊膽膠囊制品的dna提取液，經(jīng)過qpcr擴(kuò)增，出現(xiàn)明顯的黑熊擴(kuò)增曲線且ct值小于30，說明為黑熊。通過黑熊標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行濃度測定，結(jié)果為23.7ng/μl。檢測結(jié)果顯示，本方法對(duì)于鑒定熊膽膠囊中的熊源性成分是準(zhǔn)確、可靠、有效的。

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