本發(fā)明屬于生物技術(shù)檢測領(lǐng)域，具體涉及裸鼴鼠的物種鑒定方法，特別是一種鑒定裸鼴鼠線粒體細(xì)胞色素b基因dna序列限制性片段多態(tài)性的方法。

背景技術(shù)：

裸鼴鼠屬于嚙齒目，濱鼠科，裸鼴鼠屬，裸鼴鼠種，原產(chǎn)于非洲東部，營蜜蜂式的真社會性生活。此外，裸鼴鼠具有諸多特殊特性，包括對某些疼痛刺激耐受、抗腫瘤能力強、壽命為普通嚙齒類的7倍、耐低氧以及骨骼維穩(wěn)能力強等特殊優(yōu)勢，因此，作為一種新型實驗動物，近年來裸鼴鼠得到國際上的廣泛重視。目前已有很多實驗室針對裸鼴鼠的抗腫瘤、長壽、耐低氧等特性進行分子生物學(xué)水平的研究，而裸鼴鼠的細(xì)胞及組織是研究的重要實驗材料。各個實驗室可能進行裸鼴鼠與其他物種的類比研究，在實驗過程中有可能由于疏忽或者儲存時間過長將不同物種的細(xì)胞或組織混淆，導(dǎo)致大批樣本的浪費，因此，使用本發(fā)明的方法對組織或細(xì)胞進行鑒定，可避免不必要的損失。

動物線粒體dna(mtdna)具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、易于提取、基因排列緊湊、無內(nèi)含子、母系遺傳等特點，是研究動物起源進化及遺傳分析的有力工具。其中，線粒體蛋白質(zhì)編碼基因中的細(xì)胞色素b基因在分子系統(tǒng)解析中用得最多。目前，對于人類、猴、犬、豬、小鼠、大鼠等物種的線粒體色素b基因的限制性片段多態(tài)性都已明確，但作為一種新型實驗動物裸鼴鼠的線粒體色素b基因的限制性片段多態(tài)性還未見報道。該多態(tài)性相當(dāng)于相應(yīng)物種的指紋，具有物種特異性。

因此，研究新型實驗動物裸鼴鼠的線粒體色素b基因的限制性片段多態(tài)性具有非常重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種鑒定裸鼴鼠線粒體細(xì)胞色素b基因的限制性片段多態(tài)性的方法。本發(fā)明研究了裸鼴鼠的線粒體細(xì)胞色素b基因dna序列的限制性片段多態(tài)性，建立了裸鼴鼠的物種鑒定方法。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

本發(fā)明的一種鑒定裸鼴鼠線粒體細(xì)胞色素b基因的限制性片段多態(tài)性的方法，包括：

(a)提取基因組dna；

(b)擴增線粒體色素b基因：以步驟(a)提取的基因組dna為模板，進行pcr擴增，獲取擴增產(chǎn)物；

擴增線粒體細(xì)胞色素b基因的引物序列如下：，

正向引物mtdna-f：ccatccaacatctccgcatgatgaaa，如seqidno:1所示；

反向引物mtdna-r：cccctcagaatgatatttggcctca，如seqidno:2所示；

(c)使用6種限制性內(nèi)切酶對步驟(b)中獲取的擴增產(chǎn)物進行酶切，獲取相應(yīng)的酶切產(chǎn)物；其中，所述6種限制性內(nèi)切酶為aluⅰ、hinfⅰ、haeⅲ、taqⅰ、rsaⅰ以及mboⅰ，酶切時間和溫度見表1.

(d)將酶切產(chǎn)物采用3％的瓊脂糖凝膠進行電泳，若線粒體細(xì)胞色素b基因dna序列的多態(tài)性片段大小bp如下所示，即鑒定該物種為裸鼴鼠；

aluⅰ：358

hinf?。?11、47

haeⅲ：225、111、22

taq?。?28、130

rsa?。?38、88、32

mboⅰ：213、114、31。

進一步的，所述步驟b中的pcr擴增，條件如下：pcr試劑盒為2×pfupcrmastermix，反應(yīng)體系為30μl，各組分的終濃度為：0.05upfutaqpolymerase/μl，250μmdntp，50mmkcl，1.5mmmgcl2，特異性引物0.2μm，0.5μldna模板；pcr反應(yīng)程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35個循環(huán)；72℃10min。

進一步的，所述步驟(c)中6種限制性內(nèi)切酶的酶切時間和溫度分別為：alu?。?h，37℃；hinf?。?h，37℃；haeⅲ：1h，37℃；taq?。?h，65℃；rsa?。?h，37℃；mboⅰ：1h，37℃。本發(fā)明的第二目的在于提供一種用于鑒定裸鼴鼠線粒體細(xì)胞色素b基因的試劑盒，包括：

(a)擴增線粒體色素b基因的引物，序列如下：

正向引物mtdna-f：ccatccaacatctccgcatgatgaaa；

反向引物mtdna-r：cccctcagaatgatatttggcctca；

(b)識別線粒體細(xì)胞色素b基因多態(tài)性位點的6種限制性內(nèi)切酶：aluⅰ、hinfⅰ、haeⅲ、taqⅰ、rsaⅰ以及mbo?。黄渲?，裸鼴鼠的線粒體細(xì)胞色素b基因dna序列的多態(tài)性片段大小bp如下所示：

aluⅰ：358

hinf?。?11、47

haeⅲ：225、111、22

taq?。?28、130

rsa?。?38、88、32

mbo?。?13、114、31。

本發(fā)明首次建立裸鼴鼠的線粒體細(xì)胞色素b基因dna序列的限制性片段多態(tài)性，作為裸鼴鼠特定的dna指紋，可用于裸鼴鼠的物種鑒定。

附圖說明

圖1為實施例1的4種物種線粒體細(xì)胞色素bdna的pcr-rlfp(聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析)瓊脂糖電泳結(jié)果；其中，a為人源293t細(xì)胞，b為昆明小鼠皮膚成纖維細(xì)胞，c為裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞，d為sd(spraguedawley)大鼠皮膚成纖維細(xì)胞。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。

實施例線粒體細(xì)胞色素b基因的限制性片段多態(tài)性鑒定裸鼴鼠物種的方法人、裸鼴鼠、大鼠、小鼠線粒體細(xì)胞色素bdna的pcr-rlfp

分別提取人源293t細(xì)胞、昆明小鼠皮膚成纖維細(xì)胞、裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞、sd(spraguedawley)大鼠皮膚成纖維細(xì)胞基因組dna，以基因組dna為模板，線粒體色素b基因引物(正向引物mtdna-f,反向引物mtdna-r)為4個物種的統(tǒng)一引物，使用高保真擴增酶分別進行pcr。接著分別使用限制性內(nèi)切酶：aluⅰ、hinfⅰ、haeⅲ、taqⅰ、rsaⅰ、mboⅰ(6種限制性內(nèi)切酶購自大連寶生物takara公司)酶切4種物種的pcr產(chǎn)物，將產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳。得到不同物種線粒體色素b基因的限制性片段多態(tài)性。

檢測步驟：

1)提取基因組dna：

分別將人源293t細(xì)胞、昆明小鼠皮膚成纖維細(xì)胞、裸鼴鼠皮膚成纖維細(xì)胞、sd(spraguedawley)大鼠皮膚成纖維細(xì)胞使用基因組提取試劑盒(qiagen，america)提取基因組dna，并檢測基因組dna的質(zhì)量及濃度。

2)線粒體色素b基因的擴增：

以步驟1)中4種物種的基因組dna為模板，使用線粒體色素b基因引物(正向引物mtdna-f：ccatccaacatctccgcatgatgaaa，反向引物mtdna-r：cccctcagaatgatatttggcctca)進行pcr擴增，pcr試劑盒為2×pfupcrmastermix(tiangen,天根生化)，反應(yīng)體系為30μl，各組分的終濃度為：0.05upfutaqpolymerase/μl，250μmdntp，50mmkcl，1.5mmmgcl2，特異性引物(r鏈，f鏈)0.2μm，0.5μldna模板(30～60ng)。pcr反應(yīng)程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35個循環(huán)；72℃10min。

3)pcr產(chǎn)物的純化測序和酶切：

將步驟2)中的pcr產(chǎn)物送生工生物技術(shù)公司雙向測序，并分別將4種pcr產(chǎn)物根據(jù)不同內(nèi)切酶的酶切最佳溫度和時間(如表1所示)，使用6種限制性內(nèi)切酶(aluⅰ、hinfⅰ、haeⅲ、taqⅰ、rsaⅰ、mboⅰ)進行酶切。

表16種限制性內(nèi)切酶的酶切最佳溫度和時間

4)瓊脂糖電泳

分別將不同酶切的產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳(3％的瓊脂糖，跑膠30min)，檢測酶切結(jié)果。

5)secentral軟件驗證酶切結(jié)果

將測序結(jié)果的序列使用secentral軟件，驗證6種限制性內(nèi)切酶的酶切結(jié)果。結(jié)果顯示酶切片段的瓊脂糖電泳結(jié)果與secentral軟件的驗證結(jié)果一致。

通過實施例1中人類、小鼠、大鼠、裸鼴鼠4種物種的酶切產(chǎn)物的瓊脂糖跑膠結(jié)果，確定了裸鼴鼠細(xì)胞線粒體色素b基因限制性片段多態(tài)性的指紋，為裸鼴鼠物種的鑒定提供有力的工具。

以上已對本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實施例進行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可作出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)

<120>一種鑒定裸鼴鼠線粒體細(xì)胞色素b基因的限制性片段多態(tài)性的方法及試劑盒

<130>說明書、權(quán)利要求書

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

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<212>dna

<213>人工序列

<400>2

cccctcagaatgatatttggcctca25