本發(fā)明涉及一種即時(shí)檢測(cè)陰道加德納菌的熒光恒溫檢測(cè)試劑盒，特別涉及一種不依賴于高能量分子的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。
背景技術(shù)：
：陰道加德納氏菌（gv）是引起細(xì)菌性陰道?。╞v）的病原菌。其致病與厭氧菌共同作用有關(guān)，除引起bv以外，gv還可致早產(chǎn)、產(chǎn)褥熱、新生兒敗血癥、絨毛膜羊膜炎、產(chǎn)后敗血癥、膿毒血癥、尿路感染、腎周膿腫及膀胱炎等。gv是一種大小為1.5～2.5×0.5μm，多形性，無(wú)莢膜，無(wú)鞭毛，革蘭氏染色不穩(wěn)定的細(xì)菌。在普通瓊脂培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)，在血瓊脂培養(yǎng)基、巧克力培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但不需x因子、v因子、輔酶因子。兼性厭氧，在足夠co2的環(huán)境中，容易生長(zhǎng)。生長(zhǎng)最適溫度為35～37℃，ph為6.0～6.5。幾十年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究表明，該菌還可以引起宮頸炎，不潔流產(chǎn)，術(shù)后感染，尿道感染等多種疾病，是新認(rèn)識(shí)的一種性傳播疾病的病原菌和條件致病菌。陰道加德納菌是引起細(xì)菌性陰道病和尿道炎的重要病原體，在bv的微生物菌群中處于優(yōu)勢(shì)地位，含量明顯高于其他非正常菌群，已被確認(rèn)為bv的重要病原體。在bv患者與健康人群中，加德納菌的檢出率存在顯著差異，加德納菌抗原檢測(cè)可作為bv的一項(xiàng)重要檢測(cè)指標(biāo)，結(jié)合臨床表現(xiàn)進(jìn)行bv診斷。同時(shí)臨床研究表明，加德納菌感染還與不孕不育、異常妊娠高度相關(guān)，可引起輸卵管妊娠、胎膜早破和新生兒早產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局，不孕和不良懷孕史患者中30~40%可檢出加德納菌，配偶之間互感率高達(dá)90%。檢測(cè)陰道加德納菌對(duì)于婦產(chǎn)科疾病以及不孕不育的預(yù)防和診斷有著較為重大的意義?；诓≡wdna直接進(jìn)行檢測(cè)，相比amsel等傳統(tǒng)方法大大提高靈敏度，可以極大提升陽(yáng)性檢出率。陰道加德納菌檢測(cè)最常用的是生化檢測(cè)和免疫熒光檢測(cè)技術(shù)，但涂片鏡檢測(cè)等人工操作多，人為主觀因素占重要部分，免疫方法檢測(cè)多采用間接法，受樣本采集方法影響大，靈敏度不及核酸檢測(cè)方法。陰道加德納菌的dna檢測(cè)目前在國(guó)內(nèi)還沒有商業(yè)推廣用的試劑盒，國(guó)外最常見就是bd公司的affirmtm陰道微生物檢測(cè)系統(tǒng)。本發(fā)明的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)主要利用重組酶的活性，不進(jìn)行核酸解鏈和退火即可在恒溫條件下（如37℃）進(jìn)行核酸的擴(kuò)增，與生化檢測(cè)和免疫熒光檢測(cè)技術(shù)相比，有著更少人為干預(yù)，不需要人為判斷，能夠直接檢測(cè)病原體，靈敏度高等特點(diǎn)。與傳統(tǒng)的pcr技術(shù)相比，不需要昂貴的儀器，也避免了高溫對(duì)酶的損耗。同時(shí)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在體系中不需要加入過(guò)量的引物，降低了引物與模板錯(cuò)配或生成引物二聚體的可能性。另外，恒溫?cái)U(kuò)增體系有多重工具酶匹配進(jìn)行有效擴(kuò)增，擴(kuò)增效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)pcr技術(shù)，所用時(shí)間更短，最短可以在5min內(nèi)實(shí)現(xiàn)。最后，相對(duì)于目前其他恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)平臺(tái)相比，本發(fā)明所用的重組酶依賴擴(kuò)增技術(shù)平臺(tái)是新一代核酸檢測(cè)的利器，在檢測(cè)的時(shí)效性，便捷性和技術(shù)參數(shù)等多個(gè)方面都優(yōu)于其它恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)平臺(tái)，通過(guò)試劑的有效匹配，甚至可以在人體腋下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。在該技術(shù)平臺(tái)上，除了可以開發(fā)基于小型便攜式設(shè)備用于醫(yī)療檢測(cè)機(jī)構(gòu)如醫(yī)院急診科、婦產(chǎn)科、手術(shù)室；社區(qū)服務(wù)中心和基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)；檢驗(yàn)檢疫疾病防控機(jī)構(gòu)的分子診斷產(chǎn)品，還可以開發(fā)出適合家庭使用的分子診斷產(chǎn)品，使我國(guó)不同區(qū)域即便存在經(jīng)濟(jì)條件參差不齊的情況下，也可以展開全國(guó)性病毒性疾病、腫瘤和遺傳性疾病的定期和即時(shí)普查。這是一個(gè)非常巨大的潛在市場(chǎng)，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)效益不可估量。當(dāng)前我們已經(jīng)開發(fā)適用于醫(yī)療機(jī)構(gòu)和家庭使用的hiv檢測(cè)產(chǎn)品和宮頸癌hpv檢測(cè)產(chǎn)品。隨著平臺(tái)的不斷成熟，可進(jìn)一步拓展到食品安全、檢驗(yàn)檢疫、防恐等多個(gè)領(lǐng)域。本發(fā)明陰道加德納菌即時(shí)檢測(cè)試劑盒將恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)應(yīng)用到陰道陰道加德納菌感染的檢測(cè)上，縮短了反應(yīng)時(shí)間，降低了體系對(duì)反應(yīng)條件的要求，大大地提高了檢測(cè)的效率，也不需要人為主觀判讀結(jié)果，同時(shí)檢測(cè)結(jié)果不受混合其他病原體感染的干擾，因此能更準(zhǔn)確的提示陰道加德納菌感染，非常有利于臨床的即時(shí)診斷和對(duì)癥治療。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種即時(shí)檢測(cè)陰道加德納菌的熒光恒溫檢測(cè)方法及其試劑盒，包括反應(yīng)液，啟動(dòng)液，反應(yīng)酶系，陰道加德納菌特異性引物及探針。陰道加德納菌恒溫檢測(cè)方法及其試劑盒反應(yīng)液的具體組分如下：品名濃度（摩爾濃度/質(zhì)量分?jǐn)?shù)/質(zhì)量濃度）tris-hcl80mmkcl40mmnacl10mm二硫蘇糖醇5mm甜菜堿1m海藻糖3.5%peg3.5%bsa0.1mg/ml作為上述反應(yīng)液的進(jìn)一步改進(jìn)，tris-hcl的ph為7.0～9.0，優(yōu)選ph為8.3。陰道加德納菌恒溫檢測(cè)方法及其試劑盒啟動(dòng)液的具體組分如下：品名摩爾濃度氯化鎂5mm~20mm作為上述啟動(dòng)液的進(jìn)一步改進(jìn)，氯化鎂的優(yōu)選濃度為10mm。陰道加德納菌恒溫檢測(cè)方法及其試劑盒反應(yīng)酶系的具體組分如下：品名濃度（摩爾濃度/酶濃度/質(zhì)量濃度）dntps200um聚合酶bsu100ng/ul單鏈結(jié)合蛋白262ng/ul重組酶（e.colirect）360ng/ul上游引物200nm下游引物200nm作為上述反應(yīng)酶系的進(jìn)一步改進(jìn)，重組酶選自e.colirect蛋白。陰道加德納菌恒溫檢測(cè)方法及其試劑盒特異性引物及探針序列如下：上游引物1ataggctttttactggtgtatcactggtaagg（seqidno：1）下游引物1cactcttctcaaccccgtcagaggctgaacagt（seqidno：2）熒光探針1ggaccgatgaaggacgtgacgggctgcga(fam-dt)a(dspacer)(bhq-dt)tgcctcggggagctg（seqidno：3）作為本發(fā)明方法的進(jìn)一步改進(jìn)，恒溫?cái)U(kuò)增的溫度為35～42℃，優(yōu)選擴(kuò)增溫度為40℃。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明的恒溫?cái)U(kuò)增體系，不依賴于atp、磷酸肌酸等高能能量分子，相對(duì)現(xiàn)有的恒溫?cái)U(kuò)增體系，其組成更為簡(jiǎn)單，成本更為低廉，使用更為方便。本發(fā)明的恒溫?cái)U(kuò)增體系適用于復(fù)雜模板的擴(kuò)增，擴(kuò)增速度快且穩(wěn)定，可以在15min以內(nèi)完成擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增的靈敏度和準(zhǔn)確性高，不易出現(xiàn)錯(cuò)配，擴(kuò)增效果好。本發(fā)明的恒溫?cái)U(kuò)增體系使用熒光實(shí)時(shí)定量技術(shù)，應(yīng)用范圍更廣，適用于市面上大多數(shù)熒光定量擴(kuò)增儀。本發(fā)明檢測(cè)陰道加德納菌。對(duì)比常規(guī)檢測(cè)的培養(yǎng)方法和鏡檢方法，時(shí)間更短，靈敏度高受培養(yǎng)條件限制少，人為誤操作幾率低。附圖說(shuō)明圖1為最適反應(yīng)溫度下熒光擴(kuò)展曲線結(jié)果，圖中熒光曲線的標(biāo)號(hào)對(duì)應(yīng)實(shí)施例中反應(yīng)管的標(biāo)號(hào)。圖2為非最適反應(yīng)溫度下熒光擴(kuò)展曲線結(jié)果，圖中熒光曲線的標(biāo)號(hào)對(duì)應(yīng)實(shí)施例中反應(yīng)管的標(biāo)號(hào)。圖3為非最適反應(yīng)溫度下熒光擴(kuò)展曲線結(jié)果，圖中熒光曲線的標(biāo)號(hào)對(duì)應(yīng)實(shí)施例中反應(yīng)管的標(biāo)號(hào)。圖4為重復(fù)性特異性實(shí)驗(yàn)熒光擴(kuò)展曲線結(jié)果，圖中熒光曲線的標(biāo)號(hào)對(duì)應(yīng)實(shí)施例中反應(yīng)管的標(biāo)號(hào)。圖5為實(shí)驗(yàn)熒光擴(kuò)展曲線結(jié)果，圖中熒光曲線的標(biāo)號(hào)對(duì)應(yīng)實(shí)施例中反應(yīng)管的標(biāo)號(hào)。圖6為靈敏度實(shí)驗(yàn)熒光擴(kuò)展曲線結(jié)果，圖中熒光曲線的標(biāo)號(hào)對(duì)應(yīng)實(shí)施例中反應(yīng)管的標(biāo)號(hào)。具體實(shí)施方式一種即時(shí)檢測(cè)陰道加德納菌的熒光恒溫檢測(cè)方法及其試劑盒，采用了一種不依賴于高能能量分子的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。試劑盒成分包括反應(yīng)液，啟動(dòng)液，反應(yīng)酶系，陰道加德納菌特異性引物及探針，各成分的具體組分如下：陰道加德納菌恒溫檢測(cè)方法及其試劑盒反應(yīng)液的具體組分如下：品名濃度（摩爾濃度/質(zhì)量分?jǐn)?shù)/質(zhì)量濃度）tris-hcl（ph8.3）80mmkcl40mmnacl10mm二硫蘇糖醇5mm甜菜堿1m海藻糖3.5%peg3.5%bsa0.1mg/ml陰道加德納菌恒溫檢測(cè)方法及其試劑盒啟動(dòng)液的具體組分如下：品名摩爾濃度氯化鎂10mm陰道加德納菌恒溫檢測(cè)方法及其試劑盒反應(yīng)酶系的具體組分如下：品名濃度（摩爾濃度/酶濃度/質(zhì)量濃度）dntps200um聚合酶bsu100ng/ul單鏈結(jié)合蛋白262ng/ul重組酶（e.colirect）360ng/ul上游引物200nm下游引物200nm陰道加德納菌恒溫檢測(cè)方法及其試劑盒特異性引物及探針序列如下：上游引物1ataggctttttactggtgtatcactggtaagg（seqidno：1）下游引物1cactcttctcaaccccgtcagaggctgaacagt（seqidno：2）熒光探針1ggaccgatgaaggacgtgacgggctgcga(fam-dt)a(dspacer)(bhq-dt)tgcctcggggagctg（seqidno：3）下面結(jié)合具體的實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步說(shuō)明陰道加德納菌恒溫檢測(cè)方法及其試劑盒的優(yōu)勢(shì)，但并非限制本發(fā)明。實(shí)驗(yàn)樣本來(lái)源：以細(xì)菌性陰道炎患者中分離的陰道加德納菌經(jīng)提取得到的核酸溶液作為樣本；以外購(gòu)金黃色葡萄球菌、卷曲乳桿菌、詹式乳桿菌、惰性乳桿菌、支原體菌株、陰道毛滴蟲、白色念珠菌經(jīng)提取得到的核酸溶液作為特異性實(shí)驗(yàn)的樣本；以正常人陰道分泌物提取物為陰性對(duì)照樣本。實(shí)施例1（陰道加德納菌的檢測(cè)）：取2個(gè)200ul反應(yīng)管，分別標(biāo)記為反應(yīng)管1~2。在反應(yīng)管1~2中分別加入20ul反應(yīng)液、5ul反應(yīng)酶系；在反應(yīng)管1、2中加入上游引物1（200nm）、下游引物1（200nm）、熒光探針1（150nm）。在反應(yīng)管1中加入陰道加德納菌樣本2ul，反應(yīng)管2加入陰性對(duì)照樣本2ul。各反應(yīng)管均用滅菌水補(bǔ)足體系到45ul，振蕩混勻后各管再分別加入5ul啟動(dòng)液（各管的終體積為50ul）。選擇熒光定量pcr儀進(jìn)行擴(kuò)增及收集熒光，具體上機(jī)條件為：40℃，30s，30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)都搜集熒光。實(shí)施例2（非最優(yōu)擴(kuò)增溫度條件的檢測(cè)）：同實(shí)施例1，不同之處在于上機(jī)條件改為：35℃，30s，30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)都收集熒光。結(jié)果如圖2。實(shí)施例3（非最優(yōu)擴(kuò)增溫度條件的檢測(cè)）：同實(shí)施例1，不同處在于上機(jī)條件改為：42℃，30s，30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)都收集熒光。結(jié)果如圖3。實(shí)施例4（特異性實(shí)驗(yàn)）：按照實(shí)施例1配制體系8管，分別標(biāo)記1~8反應(yīng)管。在1~8反應(yīng)管的體系中加入上游引物1（200nm）、下游引物1（200nm）、熒光探針1（150nm）；在1~8號(hào)反應(yīng)管中按順序分別加入陰道加德納菌、黃色葡萄球菌、卷曲乳桿菌、詹式乳桿菌、惰性乳桿菌、支原體菌株、陰道毛滴蟲、白色念珠菌樣本2ul；各反應(yīng)管均用滅菌水補(bǔ)足體系到45ul，振蕩混勻后各管再分別加入5ul啟動(dòng)液（各管的終體積為50ul）。選擇熒光定量pcr儀進(jìn)行擴(kuò)增及收集熒光，具體上機(jī)條件為：40℃，30s，30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)都搜集熒光，結(jié)果如圖4。實(shí)施例5（陰道加德納菌重復(fù)性實(shí)驗(yàn)）：按實(shí)施例1配制體系10管，分別標(biāo)記反應(yīng)管1~10。在反應(yīng)管1~10中加入上游引物1（200nm）、下游引物1（200nm）、熒光探針1（150nm）。在反應(yīng)管1~5中均加陰道加德納菌樣本2ul，在反應(yīng)管6~10中加入陰性對(duì)照樣本2ul。各反應(yīng)管均用滅菌水補(bǔ)足體系到45ul，振蕩混勻后各管再分別加入5ul啟動(dòng)液（各管的終體積為50ul）。選擇熒光定量pcr儀進(jìn)行擴(kuò)增及收集熒光，具體上機(jī)條件為：40℃，30s，30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)都搜集熒光，結(jié)果如圖5。實(shí)施例6（陰道加德納菌靈敏度實(shí)驗(yàn)）按實(shí)施例1配制體系8管，分別標(biāo)記反應(yīng)管1~8。在反應(yīng)管1~10中加入上游引物1（200nm）、下游引物1（200nm）、熒光探針1（150nm）。在反應(yīng)管1~7中加入不同濃度的陰道加德納菌樣本2ul，在反應(yīng)管8中加入陰性對(duì)照樣本2ul。各反應(yīng)管均用滅菌水補(bǔ)足體系到45ul，振蕩混勻后各管再分別加入5ul啟動(dòng)液（各管的終體積為50ul）。選擇熒光定量pcr儀進(jìn)行擴(kuò)增及收集熒光，具體上機(jī)條件為：40℃，30s，30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)都搜集熒光，結(jié)果如圖6。結(jié)論：1.從圖1的結(jié)果可以看出，陰道加德納氏菌反應(yīng)管有“s”型擴(kuò)增曲線，陰道對(duì)照管沒有擴(kuò)增曲線，說(shuō)明本發(fā)明試劑盒的陰陽(yáng)性恒溫?cái)U(kuò)增效果好。2.從圖2、3的結(jié)果可以看出，即使不是在最適溫度下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，仍然得到穩(wěn)定的陽(yáng)性結(jié)果，說(shuō)明本發(fā)明試劑盒有較寬的反應(yīng)溫度范圍，非最優(yōu)擴(kuò)增溫度下的樣本出峰時(shí)間和信號(hào)值影響不大，試劑的容錯(cuò)率高、穩(wěn)定性強(qiáng)，可以適用于溫度不能精確控制的儀器或反應(yīng)裝置，使試劑盒的使用范圍更為廣泛。3.從圖4的結(jié)果可以看出，非本試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)的其他陰道內(nèi)微生物（黃色葡萄球菌、卷曲乳桿菌、詹式乳桿菌、惰性乳桿菌、支原體菌株、陰道毛滴蟲、白色念珠）沒有曲線增長(zhǎng)，檢測(cè)結(jié)果陰性，而陽(yáng)性對(duì)照（陰道加德納）擴(kuò)增結(jié)果陽(yáng)性，說(shuō)明試劑盒特異性較強(qiáng)。4.從圖5的結(jié)果可以看出，陰道加德納菌進(jìn)行了重復(fù)實(shí)驗(yàn)，均得到相應(yīng)的“s”型擴(kuò)增曲線，擴(kuò)增曲線出峰時(shí)間相差不超過(guò)1min，熒光信號(hào)波動(dòng)范圍小，說(shuō)明本試劑盒的重復(fù)性好。5.從圖6的結(jié)果可以看出，陰道加德納菌進(jìn)行了靈敏度實(shí)驗(yàn)，均得到相應(yīng)的“s”型擴(kuò)增曲線，樣本濃度從1×105~1×102cfu/ml，在1×102cfu/ml下均為陽(yáng)性，即使樣本在極濃度下本試劑盒仍能穩(wěn)定檢測(cè)出陽(yáng)性，說(shuō)明本試劑盒的靈敏度高，適應(yīng)臨床上各種發(fā)病期的樣本。。綜上，本發(fā)明試劑盒的擴(kuò)增效果好，特異性強(qiáng)，容錯(cuò)率高，穩(wěn)定性強(qiáng)，靈敏度高。sequencelisting<110>廣州和實(shí)生物技術(shù)有限公司<120>一種即時(shí)檢測(cè)陰道加德納菌的熒光恒溫檢測(cè)試劑盒<130>2016<160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>32<212>dna<213>人工序列<400>1ataggctttttactggtgtatcactggtaagg32<210>2<211>33<212>dna<213>人工序列<400>2cactcttctcaaccccgtcagaggctgaacagt33<210>3<211>45<212>dna<213>人工序列<400>3ggaccgatgaaggacgtgacgggctgcgaatgcctcggggagctg45當(dāng)前第1頁(yè)12