本發(fā)明屬于dna分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用特異性引物對紫背浮萍sp6微衛(wèi)星標(biāo)記檢測的方法。
背景技術(shù)：
微衛(wèi)星（microsatellites）或稱簡單重復(fù)序列（simplesequencerepeats,ssr）是指由1-6個(gè)核苷酸組成的簡單串聯(lián)重復(fù)dna序列，幾乎存在于迄今研究過的所有生物當(dāng)中，并且分布密度很大。因微衛(wèi)星廣泛分布于基因組中，具有密度大、多態(tài)性豐富、高度雜合且穩(wěn)定性好、遵循孟德爾分離定律共顯性遺傳、易于pcr擴(kuò)增等特點(diǎn)，已成為近年來廣泛應(yīng)用的dna標(biāo)記，常應(yīng)用于生物資源的家系譜系認(rèn)證、基因連鎖分析、遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)鑒定、種群遺傳多樣性等許多研究領(lǐng)域。
在自然環(huán)境中，紫背浮萍基本以無性生殖進(jìn)行繁殖，當(dāng)環(huán)境條件適宜時(shí)2天即可克隆出一代，種群遺傳多樣性水平較低。
現(xiàn)有技術(shù)提供多種衛(wèi)星標(biāo)記的檢測方法，例如，中國發(fā)明授權(quán)專利文獻(xiàn)一種銹斑蟳微衛(wèi)星標(biāo)記的快速檢測方法授權(quán)公告號cn103305611b該發(fā)明涉及一種銹斑蟳微衛(wèi)星標(biāo)記的快速檢測方法，包括：（1）銹斑蟳基因組dna的提?。唬?）根據(jù)genebank數(shù)據(jù)庫中銹斑蟳的功能基因序列，獲得含有微衛(wèi)星重復(fù)的基因序列；（3）微衛(wèi)星標(biāo)記引物的設(shè)計(jì)；（4）銹斑蟳不同個(gè)體的基因組dna的pcr擴(kuò)增；（5）pcr產(chǎn)物的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。該發(fā)明的檢測方法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，能夠直觀地檢測出銹斑蟳不同個(gè)體的基因型，從而快速獲得銹斑蟳在功能基因微衛(wèi)星位點(diǎn)遺傳變異的多態(tài)性圖譜，該微衛(wèi)星標(biāo)記可應(yīng)用于銹斑蟳遺傳變異與種群遺傳多樣性分析等領(lǐng)域，但微衛(wèi)星標(biāo)記檢測速度還有提升空間。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對上述技術(shù)問題提供一種紫背浮萍sp6微衛(wèi)星dna標(biāo)記的檢測方法，可快捷的獲得紫背浮萍sp6遺傳標(biāo)記基因座呈現(xiàn)高度遺傳變異的多態(tài)性圖譜，方法迅速，所得結(jié)果可直觀地檢測出紫背浮萍在此位點(diǎn)的每個(gè)個(gè)體的基因型。
本發(fā)明針對上述技術(shù)問題所采取的方案為：利用特異性引物對紫背浮萍sp6微衛(wèi)星標(biāo)記檢測的方法，檢測方法如下：
1）材料預(yù)處理：采集紫背浮萍樣品，馴養(yǎng)，封裝，干燥，待用；
2）紫背浮萍基因組dna提?。篴在水浴鍋中預(yù)熱ctab提取液；b研磨樣品并轉(zhuǎn)入離心管中，加入提取液，保溫，顛倒混勻；c離心，取上清液；d加入酚/氯仿，混勻，離心，取上清液；e加入氯仿，混勻，離心，取上清液；f重復(fù)d、e1~2次；g加入異丙醇混勻，沉淀，離心，棄上清液；h將沉淀物用乙醇漂洗，離心，棄上清液；i重復(fù)h；j檢測，低溫保存，備用；
3）設(shè)計(jì)特異性引物：
微衛(wèi)星點(diǎn)sp6特異性引物：f:gaaccttaatatgcgaccaag
r:caagaaagtcaaatacagcgg；
4）利用上述引物對紫背浮萍不同地理群內(nèi)個(gè)體的基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增；
5）對prc產(chǎn)物初篩，加上樣緩沖液，變性后于變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行垂直電泳分析，從而獲得紫背浮萍在sp6核心序列區(qū)高度遺傳變異的多態(tài)性圖譜。
可快捷的獲得紫背浮萍sp6遺傳標(biāo)記基因座呈現(xiàn)高度遺傳變異的多態(tài)性圖譜，方法簡便，所得結(jié)果可直觀地檢測出紫背浮萍在此位點(diǎn)的每個(gè)個(gè)體的基因型。
步驟1中采集紫背浮萍樣品，馴養(yǎng)3~5天，通過人工馴養(yǎng)的方式使野生狀態(tài)下的紫背浮萍以無性繁殖的方式進(jìn)行繁殖，獲得較多的樣品。
步驟2dna提取法為改良的ctab法，通過對ctab法進(jìn)行改良，獲得的dna質(zhì)量優(yōu)異，提取過程中無明顯的dna降解。
步驟2中b在液氮中研磨樣品后轉(zhuǎn)入離心管中，加入提取液，60~68℃保溫30~60min，每隔10min輕輕顛倒混勻，使樣品充分溶解在提取液中，通過顛倒混勻提高提取效果。
步驟2中h將沉淀物用65~75%乙醇漂洗，離心，棄上清液，通過乙醇漂洗使核酸充分的分離出來。
步驟2中j提取產(chǎn)物取2~3μl用1.0~2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余置于‐10~-30℃保存?zhèn)溆?，采用的凝膠電泳方法簡單、快速、靈敏的特點(diǎn)。
步驟2中a在60~70℃水浴鍋中預(yù)熱ctab提取液，ctab提取液由以下成分及重量份組成：ctab3~5份、1mtris-hcl18~22份、nacl14~18份、0.5medta6~10份、1,10-菲啰啉0.02~0.08份、2-巰基乙醇0.2~1份、edta鐵鈉0.03~0.06份、氯仿90~98份、異戊醇3~5份。通過預(yù)熱抑制dnase,加速蛋白變性,促進(jìn)dna溶解，獲得優(yōu)異的提取效果，dna質(zhì)量優(yōu)異，且提取速度較快。
步驟5中先將pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖初篩，選擇有擴(kuò)增的引物pcr產(chǎn)物加上樣緩沖液，92~95℃變性8~12min后于5~7%變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行垂直電泳分析，采用的凝膠電泳方法簡單、快速、靈敏的特點(diǎn)。
步驟5中的上樣緩沖液由以下成分及重量份組成：二甲酚橙0.05~0.18份、檸檬黃0.1~0.25份、溴酚藍(lán)0.01~0.05份、二甲苯青ff0.05~0.18份、羧甲基淀粉鈉0.02~0.06份、丙三醇35~37份、番茄紅素0.01~0.02份、乙二胺四乙酸二鈉2.8~3.2份、烷醇酰胺0.04~0.08份、十二烷基硫酸鈉3~5份?？稍黾訕悠访芏?，使其比重增加，以確保dna均勻沉入加樣孔內(nèi)，速度更快，使樣品呈色，操作方便。
有益效果：本發(fā)明具有速度快、準(zhǔn)確性和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，可快捷的獲得紫背浮萍sp6遺傳標(biāo)記基因座呈現(xiàn)高度遺傳變異的多態(tài)性圖譜，方法簡便，所得結(jié)果可直觀地檢測出紫背浮萍在此位點(diǎn)的每個(gè)個(gè)體的基因型。
附圖說明
圖1為sp6微衛(wèi)星標(biāo)記pcr產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳成像。
具體實(shí)施例
以下結(jié)合附圖與實(shí)施例作進(jìn)一步詳細(xì)描述：
實(shí)施例1：
如圖1所示，利用特異性引物對紫背浮萍sp6微衛(wèi)星標(biāo)記檢測的方法，檢測方法如下：
1）材料預(yù)處理：采集紫背浮萍樣品，馴養(yǎng)，封裝，干燥，待用；
2）紫背浮萍基因組dna提取：a在水浴鍋中預(yù)熱ctab提取液；b研磨樣品并轉(zhuǎn)入離心管中，加入提取液，保溫，顛倒混勻；c離心，取上清液；d加入酚/氯仿，混勻，離心，取上清液；e加入氯仿，混勻，離心，取上清液；f重復(fù)d、e1~2次；g加入異丙醇混勻，沉淀，離心，棄上清液；h將沉淀物用乙醇漂洗，離心，棄上清液；i重復(fù)h；j檢測，低溫保存，備用；
3）設(shè)計(jì)特異性引物：
微衛(wèi)星點(diǎn)sp6特異性引物：f:gaaccttaatatgcgaccaag
r:caagaaagtcaaatacagcgg；
4）利用上述引物對紫背浮萍不同地理群內(nèi)個(gè)體的基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增；
5）對prc產(chǎn)物初篩，加上樣緩沖液，變性后于變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行垂直電泳分析，從而獲得紫背浮萍在sp6核心序列區(qū)高度遺傳變異的多態(tài)性圖譜。
可快捷的獲得紫背浮萍sp6遺傳標(biāo)記基因座呈現(xiàn)高度遺傳變異的多態(tài)性圖譜，方法簡便，所得結(jié)果可直觀地檢測出紫背浮萍在此位點(diǎn)的每個(gè)個(gè)體的基因型。
步驟1中采集紫背浮萍樣品，馴養(yǎng)3~5天，通過人工馴養(yǎng)的方式使野生狀態(tài)下的紫背浮萍以無性繁殖的方式進(jìn)行繁殖，獲得較多的樣品。
步驟2dna提取法為改良的ctab法，通過對ctab法進(jìn)行改良，獲得的dna質(zhì)量優(yōu)異，提取過程中無明顯的dna降解。
步驟2中b在液氮中研磨樣品后轉(zhuǎn)入離心管中，加入提取液，60~68℃保溫30~60min，每隔10min輕輕顛倒混勻，使樣品充分溶解在提取液中，通過顛倒混勻提高提取效果。
步驟2中h將沉淀物用65~75%乙醇漂洗，離心，棄上清液，通過乙醇漂洗使核酸充分的分離出來。
步驟2中j提取產(chǎn)物取2~3μl用1.0~2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余置于‐10~-30℃保存?zhèn)溆?，采用的凝膠電泳方法簡單、快速、靈敏的特點(diǎn)。
步驟2中a在60~70℃水浴鍋中預(yù)熱ctab提取液，ctab提取液由以下成分及重量份組成：ctab3~5份、1mtris-hcl18~22份、nacl14~18份、0.5medta6~10份、1,10-菲啰啉0.02~0.08份、2-巰基乙醇0.2~1份、edta鐵鈉0.03~0.06份、氯仿90~98份、異戊醇3~5份。通過預(yù)熱抑制dnase,加速蛋白變性,促進(jìn)dna溶解，獲得優(yōu)異的提取效果，dna質(zhì)量高于現(xiàn)有技術(shù)，且提取速度較快。
步驟5中先將pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖初篩，選擇有擴(kuò)增的引物pcr產(chǎn)物加上樣緩沖液，92~95℃變性8~12min后于5~7%變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行垂直電泳分析，采用的凝膠電泳方法簡單、快速、靈敏的特點(diǎn)。
步驟5中的上樣緩沖液由以下成分及重量份組成：二甲酚橙0.05~0.18份、檸檬黃0.1~0.25份、溴酚藍(lán)0.01~0.05份、二甲苯青ff0.05~0.18份、羧甲基淀粉鈉0.02~0.06份、丙三醇35~37份、番茄紅素0.01~0.02份、乙二胺四乙酸二鈉2.8~3.2份、烷醇酰胺0.04~0.08份、十二烷基硫酸鈉3~5份?？稍黾訕悠访芏?，使其比重增加，以確保dna均勻沉入加樣孔內(nèi)，使樣品呈色，操作方便。
實(shí)施例2：
如圖1所示，利用特異性引物對紫背浮萍sp6微衛(wèi)星標(biāo)記檢測的方法，檢測方法如下：
1）材料預(yù)處理：采集紫背浮萍樣品，馴養(yǎng)，封裝，干燥，待用；
2）紫背浮萍基因組dna提取：a在水浴鍋中預(yù)熱ctab提取液；b研磨樣品并轉(zhuǎn)入離心管中，加入提取液，保溫，顛倒混勻；c離心，取上清液；d加入酚/氯仿，混勻，離心，取上清液；e加入氯仿，混勻，離心，取上清液；f重復(fù)d、e優(yōu)選的1次；g加入異丙醇混勻，沉淀，離心，棄上清液；h將沉淀物用乙醇漂洗，離心，棄上清液；i重復(fù)h；j檢測，低溫保存，備用；
3）設(shè)計(jì)特異性引物：
微衛(wèi)星點(diǎn)sp6特異性引物：f:gaaccttaatatgcgaccaag
r:caagaaagtcaaatacagcgg；
4）利用上述引物對紫背浮萍不同地理群內(nèi)個(gè)體的基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增；
5）對prc產(chǎn)物初篩，加上樣緩沖液，變性后于變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行垂直電泳分析，從而獲得紫背浮萍在sp6核心序列區(qū)高度遺傳變異的多態(tài)性圖譜。
可快捷的獲得紫背浮萍sp6遺傳標(biāo)記基因座呈現(xiàn)高度遺傳變異的多態(tài)性圖譜，方法簡便，所得結(jié)果可直觀地檢測出紫背浮萍在此位點(diǎn)的每個(gè)個(gè)體的基因型。
步驟1中采集紫背浮萍樣品，馴養(yǎng)優(yōu)選的4天，通過人工馴養(yǎng)的方式使野生狀態(tài)下的紫背浮萍以無性繁殖的方式進(jìn)行繁殖，獲得較多的樣品。
步驟2dna提取法為改良的ctab法，通過對ctab法進(jìn)行改良，獲得的dna質(zhì)量優(yōu)異，提取過程中無明顯的dna降解。
步驟2中b在液氮中研磨樣品后轉(zhuǎn)入離心管中，加入提取液，在優(yōu)選的65℃中保溫優(yōu)選45min，每隔10min輕輕顛倒混勻，使樣品充分溶解在提取液中，通過顛倒混勻提高提取效果。
步驟2中h將沉淀物用優(yōu)選70%乙醇漂洗，離心，棄上清液，通過乙醇漂洗使核酸充分的分離出來。
步驟2中j提取產(chǎn)物取2μl用優(yōu)選的2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余置于優(yōu)選的‐20℃保存?zhèn)溆?，采用的凝膠電泳方法簡單、快速、靈敏的特點(diǎn)。
步驟2中a在優(yōu)選的65℃水浴鍋中預(yù)熱ctab提取液，ctab提取液由以下成分及優(yōu)選重量份組成：ctab4份、1mtris-hcl20份、nacl16份、0.5medta8份、1,10-菲啰啉0.06份、2-巰基乙醇0.7份、edta鐵鈉0.04份、氯仿92份、異戊醇4份。通過預(yù)熱抑制dnase,加速蛋白變性,促進(jìn)dna溶解，獲得優(yōu)異的提取效果，dna質(zhì)量優(yōu)異，且提取速度較快。
步驟5中先將pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖初篩，選擇有擴(kuò)增的引物pcr產(chǎn)物加上樣緩沖液，優(yōu)選94℃變性10min后于優(yōu)選的6%變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行垂直電泳分析，采用的凝膠電泳方法簡單、快速、靈敏的特點(diǎn)。
步驟5中的上樣緩沖液由以下成分及優(yōu)選的重量份組成：二甲酚橙0.1份、檸檬黃0.2份、溴酚藍(lán)0.03份、二甲苯青ff0.12份、羧甲基淀粉鈉0.04份、丙三醇36份、番茄紅素0.016份、乙二胺四乙酸二鈉2.9份、烷醇酰胺0.06份、十二烷基硫酸鈉4份?？稍黾訕悠访芏?，使其比重增加，以確保dna均勻沉入加樣孔內(nèi)，使樣品呈色，操作方便。
實(shí)施例3：
如圖1所示，1)植物材料采集：使用普通魚網(wǎng)兜從河流、池塘、水溝、水稻田等自然水域中采集紫背浮萍樣品，樣品之間最小間隔為20m。采集的新鮮紫背浮萍先在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用自來水馴養(yǎng)3~5天后，選取20~40片葉片相連的紫背浮萍植株（包括根）作為基因組dna提取樣品，即一個(gè)克?。╟lone）。每一份樣品單獨(dú)使用紙質(zhì)樣品袋封裝，利用硅膠進(jìn)行干燥制備干樣。
2)紫背浮萍基因組dna提?。翰扇「牧嫉腸tab法進(jìn)行dna提取，每個(gè)樣本采取0.5g葉片進(jìn)行dna提取。
a）在65℃水浴鍋中預(yù)熱ctab提取液；
b）在液氮中迅速研磨樣品，將粉末狀材料轉(zhuǎn)入2ml離心管中，加入預(yù)熱的ctab提取液（每克樣品加入3-5ml的提取液），65℃保溫30-60min，每隔10min輕輕顛倒混勻；
c）12000rpm條件下離心5min，取上清轉(zhuǎn)入新離心管；
d）加入等體積酚/氯仿（1∶1），充分混勻，11000rpm離心10min，取上清轉(zhuǎn)入新離心管；
e）加入等體積氯仿，充分混勻，11000rpm離心10min，取上清轉(zhuǎn)入新離心管；
f）重復(fù)步驟d、e；
g）加入2/3體積的異丙醇混勻，室溫放置，沉淀15min；
h）11000rpm條件下離心6min，棄上清；
i）將沉淀用70%的乙醇漂洗一次，室溫條件下11000rpm離心2min，棄上清，重復(fù)洗一次；
j）提取產(chǎn)物取2-3μl用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余置于‐20℃保存?zhèn)溆?/p>
3)微衛(wèi)星引物設(shè)計(jì)：根據(jù)genbank發(fā)布的紫背浮萍全基因組序列，使用primerpremier5.0軟件對含有2-6個(gè)堿基重復(fù)重復(fù)單元且重復(fù)數(shù)超過5個(gè)的dna序列進(jìn)行微衛(wèi)星（simplerepeatsequence，ssr）引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)參數(shù)如下：引物gc含量不超過40-60%，且正反向引物相差不到10%；退火溫度不小于45℃，且正反向引物相差不超過5℃；正反向引物不能發(fā)生錯(cuò)配，且3'避免互補(bǔ)重疊；引物3'不選擇a，且不選擇超過3個(gè)的g或者c；引物長度為18-27bp；預(yù)期的pcr產(chǎn)物長度為100-299bp。
設(shè)計(jì)得微衛(wèi)星點(diǎn)sp6特異性引物：f:gaaccttaatatgcgaccaag
r:caagaaagtcaaatacagcgg；
4)微衛(wèi)星pcr擴(kuò)增:pcr反應(yīng)體系：
ssr（共20ul）：ddh2o14.8ul，dntp0.4ul，10xpcrbuffer2ul，正向引物0.3ul（20um），反向引物0.3ul（20um），dna模板2ul，taq0.2ul。
pcr反應(yīng)采用如下循環(huán)參數(shù)：
ssrpcr擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，54℃復(fù)性35s，72℃延伸40s，共35個(gè)循環(huán)；最終72℃延伸3min。
先將pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖初篩，選擇有擴(kuò)增的引物pcr產(chǎn)物加上上樣緩沖液，94℃變性10min后于6%變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行垂直電泳分析，銀染后觀察。
5)數(shù)據(jù)分析:pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳位置在凝膠的某個(gè)相同遷移率位置上有dna條帶記為1，無dna條帶記為0，然后轉(zhuǎn)化成aa、bb的格式錄入到excel中，使用tfpgav1.3、fstatv2.9.3（goudet,2002）和popgenev1.32等軟件計(jì)算以下參數(shù)：多態(tài)位點(diǎn)百分率p（percentofpolymorphicloci）；有效等位基因數(shù)ne（effectivenumberofallelesperloci）；期望雜合度he（expectedheterozygosity），觀察雜合度ho（observedheterozygosity）；pic（polymorphisminformationcontent）值即多個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)信息含量；近交系數(shù)fis（inbreedingcoefficient）。
以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對本發(fā)明作任何限制。凡是根據(jù)發(fā)明技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、變更以及等效變化，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍內(nèi)。
sequencelisting
<110>浙江海洋大學(xué)
<120>利用特異性引物對紫背浮萍sp6微衛(wèi)星標(biāo)記檢測的方法
<130>zjou-hk-001
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<213>人工合成
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