本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一組高特異性的nudt15引物及探針。
背景技術(shù)：
：在臨床上，使用巰嘌呤類藥物可引起白細(xì)胞減少癥，這不良反應(yīng)可嚴(yán)重威脅患者的生命安全，美國(guó)的fda建議，在使用巰基嘌呤類藥物前接受tpmt(巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶)檢測(cè)。然而讓人遺憾的是，只有四分一使用巰基嘌呤出現(xiàn)白細(xì)胞減少的患者被檢測(cè)出存在tpmt突變。巰嘌呤類藥物(如常見(jiàn)的咪唑硫嘌呤及6-巰基嘌呤)，廣泛地應(yīng)用在自身免疫疾病，器官移植及炎癥疾病上。在歐洲，超過(guò)5％的炎癥腸道疾病患者在接受巰基嘌呤藥物治療后出現(xiàn)白細(xì)胞減少癥。近年發(fā)現(xiàn)，在使用巰嘌呤類藥物后出現(xiàn)的不耐受的白血病患者和克羅恩病(炎癥腸道病)均與nudt15基因突變有很強(qiáng)的相關(guān)性。突變型的nudt15的患病率可比野生型高出88倍。故而，檢測(cè)nudt15比檢測(cè)tpmt更具有說(shuō)服性和實(shí)際意義。pcr-熒光探針?lè)ㄊ且环N高特異性的基因分型的檢測(cè)方法，使用pcr-熒光探針?lè)z測(cè)nudt15的基因型，可以為醫(yī)生在患者的個(gè)性化用藥上提供幫助與指導(dǎo)。而pcr-熒光探針?lè)ǖ年P(guān)鍵是獲得特異性的引物和探針。目前，市面上并沒(méi)有專門針對(duì)nudt15的檢測(cè)產(chǎn)品，因此設(shè)計(jì)專門的引物及探針具有十分重要的意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于公開(kāi)一組高特異性的nudt15引物及探針。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：一種高特異性的檢測(cè)nudt15基因的試劑盒，試劑盒含有檢測(cè)nudt15基因的探針和引物。優(yōu)選的，檢測(cè)nudt15基因的引物是：正向引物：5-’cccaccagatggttcagatctt-3’(seqidno：1)；反向引物：5’-gtgggttccttgggaagaacta-3’(seqidno：2)。優(yōu)選的，檢測(cè)nudt15基因的野生型探針序列是：acaacgcagtccc(seqidno：3)。優(yōu)選的，檢測(cè)nudt15基因的突變體探針序列是：acaacacagtcccc(seqidno：4)。優(yōu)選的，檢測(cè)nudt15基因的野生型探針含有發(fā)光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)。優(yōu)選的，檢測(cè)nudt15基因的野生型探針含有發(fā)光基團(tuán)fam和猝滅基團(tuán)mgb。優(yōu)選的，檢測(cè)nudt15基因的突變體探針含有發(fā)光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)。優(yōu)選的，檢測(cè)nudt15基因的突變體探針含有發(fā)光基團(tuán)vic和猝滅基團(tuán)mgb。試劑盒在巰嘌呤類藥物的適用性檢測(cè)中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是：該引物及探針對(duì)nudt15的檢測(cè)效果好，精確度高，檢測(cè)時(shí)的信號(hào)強(qiáng)度高，因此可以極大地方便檢測(cè)，并可用于檢測(cè)巰嘌呤類藥物的適用性。具體實(shí)施方式實(shí)施例11)引物及探針的設(shè)計(jì)及篩選nud15-rs116855232位點(diǎn)設(shè)計(jì)多組引物及探針，并驗(yàn)證其擴(kuò)增效率及特異性。設(shè)計(jì)的引物及探針對(duì)如下：2)以質(zhì)粒為樣本，驗(yàn)證各引物對(duì)及探針擴(kuò)增效果及特異性。結(jié)果如下：由上表可知，雖然三對(duì)引物均能對(duì)樣本進(jìn)行擴(kuò)增，也能正確分型。但擴(kuò)增效果并不一致，引物對(duì)1的信號(hào)強(qiáng)度比引物2及3都強(qiáng)，ct值在18左右。引物對(duì)2信號(hào)強(qiáng)度最低，且ct值在28左右，引物對(duì)3的信號(hào)強(qiáng)度介于兩者之間，ct值在26左右。故此，引物對(duì)1即本發(fā)明的引物對(duì)，具有明顯的優(yōu)勢(shì)。3)靈敏度度驗(yàn)證考慮到引物對(duì)2信號(hào)強(qiáng)度不滿足要求，故只驗(yàn)證引物對(duì)1及引物對(duì)2，取成人血液樣本提取的dna，稀釋成50ng/μl、5ng/μl、0.5ng/μl，進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果表明，引物對(duì)2在樣本濃度為5ng/μl開(kāi)始，信號(hào)強(qiáng)度低，而引物對(duì)1在樣本濃度為0.5ng/μl時(shí)仍能達(dá)到檢測(cè)效果，靈敏度高。將三種基因型的質(zhì)粒稀釋至104copies/μl，以此為模板，用引物對(duì)1進(jìn)行的擴(kuò)增，觀察其信號(hào)強(qiáng)度及ct值，若無(wú)信號(hào)或ct值大于35，則視為該樣品未擴(kuò)增。結(jié)果表明本發(fā)明引物檢出率為100％，特異性為100％。4)本發(fā)明的引物對(duì)1及探針，檢驗(yàn)66個(gè)樣本，用直接測(cè)序法驗(yàn)證結(jié)果，結(jié)果如下：野生型雜合突變純合突變直接測(cè)序法54111本發(fā)明54111符合率100％100％100％總結(jié)：本發(fā)明的引物和探針檢測(cè)符合率為100％，特異性好，符合基因分型的要求。實(shí)施例2：用實(shí)施例1所篩選出的引物對(duì)1及探針，檢測(cè)成人血液樣本提取的dna(樣本1)，然后用直接測(cè)序法進(jìn)行驗(yàn)證。使用dna提取試劑盒提取樣本1的dna。將提取出的基因組dna溶解于te緩沖溶液中，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，配成50ng/μl的溶液，作為pcr擴(kuò)增模板，進(jìn)行檢測(cè)。樣本檢測(cè)結(jié)果為雜合型，ct-fam為27.635、ct-vic為29.423，與直接測(cè)序結(jié)果一致。實(shí)施例3用實(shí)施例1所篩選出的引物對(duì)1及探針，檢測(cè)成人血液樣本提取的dna(樣本2)，然后用直接測(cè)序法進(jìn)行驗(yàn)證。使用dna提取試劑盒提取樣本2的dna。將提取出的基因組dna溶解于te緩沖溶液中，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，配成100ng/μl的溶液，作為pcr擴(kuò)增模板，進(jìn)行檢測(cè)。樣本檢測(cè)結(jié)果為野生型，ct值19.07，與直接測(cè)序結(jié)果一致。sequencelisting<110>廣州海思醫(yī)療科技有限公司<120>一組高特異性的nudt15引物及探針<130><160>8<170>patentinversion3.5<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列<400>1cccaccagatggttcagatctt22<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列<400>2gtgggttccttgggaagaacta22<210>3<211>13<212>dna<213>人工序列<400>3acaacgcagtccc13<210>4<211>14<212>dna<213>人工序列<400>4acaacacagtcccc14<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5caccagcaggttcagatcta20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6atgggttccttcggaagaac20<210>7<211>23<212>dna<213>人工序列<400>7ccttccagatggttcagatctca23<210>8<211>21<212>dna<213>人工序列<400>8gtggagtccttgggaagaagt21當(dāng)前第1頁(yè)12