本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，特別一種同時(shí)檢測(cè)nudt15和ugt1a1基因多位點(diǎn)突變的試劑盒。
背景技術(shù)：
：骨髓抑制，是化療過(guò)程中常見(jiàn)的毒性反應(yīng)，使周?chē)?xì)胞數(shù)量減少,血細(xì)胞由多種成分組成,每一種成分都對(duì)人體起著不可缺少的作用,任何一種成分的減少都使機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的副反應(yīng)。嚴(yán)重的威脅著患者的生命安全和生存質(zhì)量。巰嘌呤類(lèi)藥物(如常見(jiàn)的咪唑硫嘌呤及6-巰基嘌呤)，廣泛地應(yīng)用在自身免疫疾病，器官移植及炎癥疾病上。伊立替康是廣譜的抗腫瘤藥，現(xiàn)已用于胃癌、結(jié)直腸癌、肺癌等實(shí)體腫瘤的治療。此兩種化療藥物均可引起骨髓抑制。但出現(xiàn)骨髓抑制的概率及嚴(yán)重程度，在不同的個(gè)體上差異很大。國(guó)外試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，含有ugt1a1*28及ugt1a1*6的純合子或雜合子基因型個(gè)體應(yīng)用伊立替康后，出現(xiàn)骨髓抑制和?！ざ雀篂a的風(fēng)險(xiǎn)更大。在在治療白血病和克羅恩病中，突變型的nudt15的患者在使用巰嘌呤類(lèi)藥物后出現(xiàn)的骨髓抑制比野生型患者高出88倍。故而使用巰基嘌呤類(lèi)藥物及伊立替康前進(jìn)行基因檢測(cè)很有必要，能夠更加安全有效地指導(dǎo)用藥。目前，在市面上，沒(méi)有能夠同時(shí)檢測(cè)ugt1a1和nudt15的產(chǎn)品，因此發(fā)明一種可以同時(shí)檢測(cè)兩種基因多態(tài)性的試劑盒是十分有必要的。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于公開(kāi)了一種同時(shí)檢測(cè)nudt15和ugt1a1基因多位點(diǎn)突變的試劑盒。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：一種可同時(shí)檢測(cè)基因多位點(diǎn)突變的試劑盒，試劑盒含有檢測(cè)nudt15基因多態(tài)性和ugt1a1基因多態(tài)性的引物。優(yōu)選的，ugt1a1基因多態(tài)性位點(diǎn)為ugt1a1*28、ugt1a1*6。優(yōu)選的，檢測(cè)ugt1a1*28基因位點(diǎn)的引物是：正向引物：5’-aacattaacttggtgtatcgattggt-3’(seqidno：1)；反向引物：5’-agcaggcccaggacaagt-3’(seqidno：2)；野生型探針序列是：tgccatatatatatatataagtaggaa(seqidno：3)；突變體探針序列是：tgccatatatatatatatataagtaggaa(seqidno：4)。優(yōu)選的，檢測(cè)ugt1a1*6基因位點(diǎn)的引物是：正向引物：5’-cagtcaaacattaacttggtgtatcg-3’(seqidno：5)；反向引物：5’-ctttgctcctgccagaggttcg-3’(seqidno：6)；野生型探針序列是：tagcacctgacgcctcgttg(seqidno：7)；突變體探針序列是：tctttcacatcctccctttggg(seqidno：8)。優(yōu)選的，檢測(cè)nudt15基因的引物是：正向引物：5’-ccaccagatggttcagatcttg-3’(seqidno：9)；反向引物：5’-tgggttccttgggaagaactac-3’(seqidno：10)；野生型探針序列是：caacgcagtccct(seqidno：11)；突變體探針序列是：caacacagtcccct(seqidno：12)。優(yōu)選的，野生型探針有發(fā)光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)；其中發(fā)光基團(tuán)為fam，猝滅基團(tuán)為mgb。優(yōu)選的，突變體探針有發(fā)光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)；其中發(fā)光基團(tuán)為vic，猝滅基團(tuán)為mgb。試劑盒在制備治療癌癥藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是：該試劑盒可以同時(shí)基因多態(tài)性位點(diǎn)nudt15、ugt1a1*28、ugt1a1*6，操作簡(jiǎn)單方便，克服了不同基因位點(diǎn)間的下相互之間的干擾問(wèn)題，并且這種試劑盒具有檢測(cè)靈敏度高、效果好的優(yōu)點(diǎn)。具體實(shí)施方式實(shí)施例1：引物及探針的設(shè)計(jì)：設(shè)計(jì)ugt1a1*6、ugt1a1*28、nudt15基因多位點(diǎn)的特異性引物對(duì)與探針，具體如下：實(shí)施例2：用實(shí)施例1的引物，按以下體系配制反應(yīng)液，并檢測(cè)人外周抗凝血提取的dna，再用直接測(cè)序法進(jìn)行驗(yàn)證。反應(yīng)液的配制：組分ugt1a1*6ugt1a1*28nudt15引物300nm300nm300nm探針200nm200nm1000nmqpcrmix20％v/v20％v/v20％v/v純化水余量余量余量將提取出的基因組dna溶解于te緩沖溶液中，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，配成100ng/μl的溶液，作為pcr擴(kuò)增模板。取18μl反應(yīng)液加入2μl模板，上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果如下：nudt15ugt1a1*6ugt1a1*28、分型雜合野生野生ct值26.1227.7628.50測(cè)序結(jié)果雜合野生野生本發(fā)明的檢測(cè)結(jié)果與直接測(cè)序結(jié)果一致，ct值小于35，分型正確。實(shí)施例3用實(shí)施例1的引物，按以下體系配制反應(yīng)液，并檢測(cè)人外周抗凝血提取的dna，再用直接測(cè)序法進(jìn)行驗(yàn)證。反應(yīng)液的配制：組分ugt1a1*6ugt1a1*28nudt15引物800nm800nm800nm探針600nm600nm500nmqpcrmix50％v/v50％v/v50％v/v純化水余量余量余量將提取出的基因組dna溶解于te緩沖溶液中，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，配成100ng/μl的溶液，作為pcr擴(kuò)增模板。取18μl反應(yīng)液加入2μl模板(樣本，陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照)，上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果如下：nudt15ugt1a1*6ugt1a1*28、分型野生野生野生ct值18.1323.9126.01測(cè)序結(jié)果野生野生野生本發(fā)明的檢測(cè)結(jié)果與直接測(cè)序結(jié)果一致，ct值小于35，分型正確。實(shí)施例4用實(shí)施例1所配制的組分，按以下體系配制反應(yīng)液，并按下述程序檢測(cè)人外周抗凝血樣本3，再用直接測(cè)序法進(jìn)行驗(yàn)證。反應(yīng)液的配制：組分ugt1a1*6ugt1a1*28nudt15引物500nm500nm400nm探針200nm200nm200nmqpcrmix40％v/v40％v/v40％v/v純化水余量余量余量將提取出的基因組dna溶解于te緩沖溶液中，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，配成100ng/μl的溶液，作為pcr擴(kuò)增模板。取18μl反應(yīng)液加入2μl模板(樣本，陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照)，上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果如下：本發(fā)明的檢測(cè)結(jié)果與直接測(cè)序結(jié)果一致，ct值小于35，分型正確，特異型好，準(zhǔn)確性高。實(shí)施例5：以不同濃度(高：106copies/μl、中：105copies/μl、低：104copies/μl)的雜合質(zhì)粒為模板，用本發(fā)明與現(xiàn)有其他的引物及探針作對(duì)比(對(duì)比例中ugt1a1為市售的試劑盒中的引物探針，nudt15為本公司設(shè)計(jì)的其他引物及探針)。按相同的體系及程序進(jìn)行擴(kuò)增。體系如下：組分ugt1a1*6ugt1a1*28nudt15引物500nm500nm400nm探針200nm200nm200nmqpcrmix40％v/v40％v/v40％v/v純化水余量余量余量反應(yīng)程序如下：95℃10min——1個(gè)循環(huán)95℃30s；58℃30s——40個(gè)循環(huán)檢測(cè)ct值結(jié)果如下表：(ct-fam/ct-vic)結(jié)論：本發(fā)明各濃度質(zhì)粒的檢出率為100％，相比于對(duì)比例，本發(fā)明的ct值更低，特異性更好。sequencelisting<110>廣州海思醫(yī)療科技有限公司<120>一種同時(shí)檢測(cè)nudt15和ugt1a1基因多位點(diǎn)突變的試劑盒<130><160>12<170>patentinversion3.5<210>1<211>26<212>dna<213>人工序列<400>1aacattaacttggtgtatcgattggt26<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列<400>2agcaggcccaggacaagt18<210>3<211>27<212>dna<213>人工序列<400>3tgccatatatatatatataagtaggaa27<210>4<211>29<212>dna<213>人工序列<400>4tgccatatatatatatatataagtaggaa29<210>5<211>26<212>dna<213>人工序列<400>5cagtcaaacattaacttggtgtatcg26<210>6<211>22<212>dna<213>人工序列<400>6ctttgctcctgccagaggttcg22<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列<400>7tagcacctgacgcctcgttg20<210>8<211>22<212>dna<213>人工序列<400>8tctttcacatcctccctttggg22<210>9<211>22<212>dna<213>人工序列<400>9ccaccagatggttcagatcttg22<210>10<211>22<212>dna<213>人工序列<400>10tgggttccttgggaagaactac22<210>11<211>13<212>dna<213>人工序列<400>11caacgcagtccct13<210>12<211>14<212>dna<213>人工序列<400>12caacacagtcccct14當(dāng)前第1頁(yè)12