本發(fā)明涉及一種多重基因檢測產(chǎn)品以及該產(chǎn)品所用到的檢測體系，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

感染性腹瀉是由多種病原菌引起的腸道傳染病，是全世界范圍內(nèi)最高發(fā)的消化系統(tǒng)感染性疾病之一。全球每年患腹瀉病達20億人次左右，我國每年發(fā)病約8億人次。感染性腹瀉已經(jīng)成為僅次于呼吸道感染、影響人類健康的第二大感染性疾病。

病原學(xué)診斷對感染性腹瀉的防治具有重要意義?！妒澜缥改c病學(xué)組織全球指南—成人和兒童急性腹瀉：全球觀點(2012)》和《中國成人急性感染性腹瀉診療專家共識(2013)》明確指出：“感染性腹瀉的診斷包括臨床診斷和病原學(xué)診斷，后者不僅為合理治療提供依據(jù)，同時為流行病學(xué)調(diào)查以及預(yù)防和控制腹瀉病的傳播和流行提供重要線索”。目前，由于引起腹瀉的病原菌種類繁多，高達數(shù)十種，而常規(guī)的檢測方法局限性大，難以實現(xiàn)精準的病原學(xué)診斷，導(dǎo)致臨床治療盲目、耐藥菌產(chǎn)生，使得感染性腹瀉未能得到最及時和有效地控制。

但是,感染性腹瀉病原菌的常規(guī)檢測方法、檢測流程、臨床治療方案都具有局限性。

目前國內(nèi)外檢測腹瀉相關(guān)病原菌的常規(guī)方法包括：①細菌培養(yǎng)法：通過分離、培養(yǎng)和鑒定腸道致病菌，結(jié)合血清學(xué)分型方法，確定腸道致病菌種屬和血清型。該方法特異性強，可以直接為臨床提供明確的病原學(xué)診斷和體外藥敏試驗結(jié)果。但是引起感染性腹瀉的病原菌種類繁多，不同種屬的腸道致病菌的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件各不相同，該方法無法同時采用所有的腸道致病菌都適合的分離培養(yǎng)方法(比如培養(yǎng)基的類型和培養(yǎng)環(huán)境)，造成了病原菌陽性檢出率低，假陰性率高，導(dǎo)致臨床漏診和誤診率高。同時該方法耗時長，成本高。②免疫學(xué)方法：通過直接檢測糞便中病原菌的特異性抗原或者血液中的特異性抗體進行病原學(xué)診斷。該方法耗時短，但敏感性和特異性低，尤其是血液中特異性抗體的產(chǎn)生有一個窗口期(從感染到產(chǎn)生可以檢測到的抗體成分)，導(dǎo)致該方法假陰性率高。同時該方法也無法同時檢測和鑒別數(shù)十種感染性腹瀉相關(guān)的抗原或抗體。③特異性核苷酸檢測法：通過特異性檢測感染性腹瀉相關(guān)病原菌的基因片段進行診斷。其優(yōu)點是特異性和敏感性高，但缺點是無法同時檢測和鑒定感染性腹瀉相關(guān)的多種病原菌，而且成本高。

感染性腹瀉病原菌常規(guī)檢測流程和步驟為：①首先采集腹瀉患者糞便樣本進行腸道致病菌的培養(yǎng)——直接接種ss平板，分離培養(yǎng)沙門菌/志賀菌；同時接種堿性蛋白胨水增菌后轉(zhuǎn)種tcbs平板，分離培養(yǎng)弧菌。②常規(guī)培養(yǎng)陽性者，進行生化鑒定、血清學(xué)鑒定和體外藥敏試驗。常規(guī)培養(yǎng)陰性者，如果臨床癥狀符合腸道細菌感染癥狀，需再次采集糞便樣本進行致病性大腸埃希菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、空腸彎曲菌或艱難梭菌的分離培養(yǎng)——分別接種麥康凱平板、空腸彎曲菌平板和ccfa平板，陽性者進一步進行生化鑒定、血清學(xué)鑒定和體外藥敏試驗。③以上細菌培養(yǎng)陰性或者其它實驗室檢查指標符合病毒性腹瀉的患者，需要進行腸道病毒的免疫學(xué)或特異性核酸檢測。臨床上感染性腹瀉病原菌的檢測流程步驟多、費用高、時間長。全面檢測費用至少需要1000元，耗時可長達72小時。

不同的病原菌引起的感染性腹瀉的治療和隔離的方法各不相同。

《國家衛(wèi)計委2015年抗菌藥物臨床應(yīng)用指導(dǎo)原則》明確指出：“抗菌藥物的應(yīng)用必須根據(jù)患者的癥狀、體征和實驗室檢查結(jié)果，明確診斷后可應(yīng)用”。但是，目前的常規(guī)檢測方法存在檢出率低、耗時長、尤其無法同時對多種病原菌進行準確鑒定等缺點，無法為臨床提供及時、全面和準確的病原菌診斷依據(jù)，導(dǎo)致臨床普遍采用廣譜性抗菌藥物進行經(jīng)驗性治療，造成療效低下、不能及時控制腹瀉、耐藥菌株高發(fā)和消化菌群紊亂等問題。

綜上所述，目前腹瀉病原菌檢測和診斷方法不能滿足臨床需求，迫切需要開發(fā)新技術(shù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種可以快速、全面、準確、低成本的腹瀉病原菌多重基因檢測體系及其試劑盒，以及采用該檢測體系在制備診斷產(chǎn)品方面的應(yīng)用。

本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題提出的一種技術(shù)方案是：一種腹瀉病原菌多重基因檢測體系，包括分別針對空腸彎曲菌、志賀菌、艱難梭菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌、腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌、腸出血性大腸埃希菌、腸致病性大腸埃希菌、腸黏附性大腸埃希菌、腸侵襲性大腸埃希菌、大腸埃希菌o157、弧菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌進行檢測的正反向pcr擴增引物。

針對空腸彎曲菌的正向引物的核苷酸序列如seqidno.1所示，針對空腸彎曲菌的反向引物的核苷酸序列如seqidno.2所示；

針對志賀菌的正向引物的核苷酸序列如seqidno.3所示，針對志賀菌的反向引物的核苷酸序列如seqidno.4所示；

針對艱難梭菌的正向引物的核苷酸序列如seqidno.5所示，針對艱難梭菌的反向引物的核苷酸序列如seqidno.6所示；

針對腸炎沙門菌的正向引物的核苷酸序列如seqidno.7所示，針對腸炎沙門菌的反向引物的核苷酸序列如seqidno.8所示；

針對鼠傷寒沙門菌的正向引物的核苷酸序列如seqidno.9所示，針對鼠傷寒沙門菌的反向引物的核苷酸序列如seqidno.10所示；

針對腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌的正向引物的核苷酸序列如seqidno.11所示，針對腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌的反向引物的核苷酸序列如seqidno.12所示；

針對腸出血性大腸埃希菌的正向引物的核苷酸序列如seqidno.13所示，針對腸出血性大腸埃希菌的反向引物的核苷酸序列如seqidno.14所示；

針對腸致病性大腸埃希菌的正向引物的核苷酸序列如seqidno.15所示，針對腸致病性大腸埃希菌的反向引物的核苷酸序列如seqidno.16所示；

針對腸黏附性大腸埃希菌的正向引物的核苷酸序列如seqidno.17所示，針對腸黏附性大腸埃希菌的反向引物的核苷酸序列如seqidno.18所示；

針對腸侵襲性大腸埃希菌的正向引物的核苷酸序列如seqidno.19所示，針對腸侵襲性大腸埃希菌的反向引物的核苷酸序列如seqidno.20所示；

針對弧菌的正向引物的核苷酸序列如seqidno.21所示，對應(yīng)弧菌的反向引物的核苷酸序列如seqidno.22所示；

針對小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的正向引物的核苷酸序列如seqidno.23所示，對應(yīng)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌反向引物的核苷酸序列如seqidno.24所示；

針對大腸埃希菌o157的正向引物的核苷酸序列如seqidno.25所示，對應(yīng)人大腸埃希菌o157的反向引物的核苷酸序列如seqidno.26所示。

上述腹瀉病原菌多重基因檢測體系還包括針對人dna內(nèi)參、系統(tǒng)質(zhì)控內(nèi)參進行檢測的正反向pcr擴增引物；

所述人dna內(nèi)參是rnasep，系統(tǒng)質(zhì)控內(nèi)參是含有卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒；

針對人dna內(nèi)參的正向引物的核苷酸序列如seqidno.41所示，以及針對人dna內(nèi)參的反向引物的核苷酸序列如seqidno.42所示；

針對系統(tǒng)質(zhì)控內(nèi)參的正向引物的核苷酸序列如seqidno.43所示，以及針對系統(tǒng)質(zhì)控內(nèi)參的反向引物的核苷酸序列如seqidno.44所示。

上述針對空腸彎曲菌、志賀菌、艱難梭菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌、腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌、腸出血性大腸埃希菌、腸致病性大腸埃希菌、腸黏附性大腸埃希菌、腸侵襲性大腸埃希菌、弧菌的正向引物在檢測體系中的終濃度均為200nm；所述針對小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的正向引物在檢測體系中的終濃度均為100nm，所述針對大腸埃希菌o157的正向引物在檢測體系中的終濃度均為350nm；

所述針對空腸彎曲菌、志賀菌、艱難梭菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌、腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌、腸出血性大腸埃希菌、腸致病性大腸埃希菌、腸黏附性大腸埃希菌、大腸埃希菌o157、弧菌的反向引物在檢測體系中的終濃度均為100nm，所述針對腸侵襲型大腸埃希菌的反向引物在檢測體系中的終濃度均為200nm，所述針對小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的反向引物在檢測體系中的終濃度均為300nm；

針對人dna內(nèi)參和系統(tǒng)質(zhì)控內(nèi)參的正反向引物在檢測體系中的終濃度均為1μm。

上述腹瀉病原菌多重基因檢測體系還包括pcr緩沖液,mgcl2溶液,dntps,以及熱啟動dna聚合酶混合液。

上述熒光標記為cy5或cy3或fam。

上述腹瀉病原菌多重基因檢測體系還包括陽性對照液和陰性對照物；所述陽性對照物是包括所有目的基因靶點的質(zhì)?；旌衔铮凰鲫幮詫φ找菏菬o核酸酶超純水。

反應(yīng)時體系中的組分用量為5×的pcr緩沖液2體積，10μm的dntps共0.35體積，25mmol/l的mgcl2溶液0.25體積，引物混合物1體積，5u/μl的熱啟動dna聚合酶混合液0.4體積，1u/μl的udg酶0.1體積dna模板2.5體積，純水2.5體積；所述基因模板的使用量為5～50ng/體系。

本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題提出的另一種技術(shù)方案是：一種采用上述的檢測體系的腹瀉病原菌多重基因檢測試劑盒。

本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題提出的又一種技術(shù)方案是：一種采用上述的檢測體系制備腹瀉病原菌的檢測和診斷產(chǎn)品的應(yīng)用。本發(fā)明具有積極的效果：

(1)本發(fā)明的腹瀉病原菌多重基因檢測體系及試劑盒，將所有目的基因的質(zhì)粒等拷貝數(shù)混合在一起，通過調(diào)整各病原菌的引物濃度，使各靶點出現(xiàn)的峰高相當，達到等效擴增所有靶基因的目的。

(2)本發(fā)明的腹瀉病原菌多重基因檢測體系及試劑盒優(yōu)化了反應(yīng)體系，加入了防污染的ung酶，在基因擴增前有效消除基因擴增片段污染，確保結(jié)果的準確性和可靠性。

(3)本發(fā)明的腹瀉病原菌多重基因檢測體系及試劑盒結(jié)合毛細管電泳及熒光檢測技術(shù)，不同于傳統(tǒng)凝膠電泳分析模式，可將非特異性擴增產(chǎn)物、引物二聚體和特異性擴增產(chǎn)物分離，最大程度降低假陽性。該試劑盒的檢測結(jié)果無雜峰，特異性高?？蓹z測低至10個拷貝的病原菌，靈敏度高。

(4)本發(fā)明的腹瀉病原菌多重基因檢測體系及試劑盒不需要采用腹瀉病原菌常規(guī)的培養(yǎng)等步驟，在同一反應(yīng)體系直接對組織樣本進行多重腹瀉病原菌的同步檢測和分析，一次檢測得出所有結(jié)果，彌補了常規(guī)檢測方法通量低、步驟多、耗時長和檢出率低等缺點，成本低、便捷性好，第一時間為臨床提供全面、精準、低成本的病原學(xué)診斷。

(5)不同的病原菌引起的感染性腹瀉的治療和隔離的方法各不相同。《國家衛(wèi)計委2015年抗菌藥物臨床應(yīng)用指導(dǎo)原則》明確指出：“抗菌藥物的應(yīng)用必須根據(jù)患者的癥狀、體征和實驗室檢查結(jié)果，明確診斷后可應(yīng)用”。但是，目前的常規(guī)檢測方法存在檢出率低、耗時長、尤其無法同時對多種病原菌進行準確鑒定等缺點，導(dǎo)致臨床普遍采用廣譜性抗菌藥物進行經(jīng)驗性治療，造成療效低下、不能及時控制腹瀉、耐藥菌株高發(fā)和消化菌群紊亂等問題。本發(fā)明采用建立了一種高通量、快速、準確、低成本的腹瀉病原菌鑒定系統(tǒng)，可以同步檢測13種感染性腹瀉常見病原菌，有效彌補常規(guī)檢測方法檢出率低、耗時長和不能同時進行多種病原菌鑒定等缺點，可在第一時間內(nèi)明確病原菌種類，以便臨床采取正確的治療方案和隔離措施，有效防止感染擴散和減少耐藥菌株的產(chǎn)生。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例1的試劑盒對混合腹瀉病原菌陽性對照進行pcr反應(yīng)后進行毛細管電泳分析后的圖譜；

圖2是本發(fā)明實施例1的試劑盒對腹瀉病原菌系列稀釋并進行pcr反應(yīng)后進行毛細管電泳分析后的圖譜；

圖3是本發(fā)明實施例1的試劑盒對樣本1進行pcr反應(yīng)后進行毛細管電泳分析后的圖譜；

圖4是本發(fā)明實施例1的試劑盒對樣本2進行pcr反應(yīng)后進行毛細管電泳分析后的圖譜；

圖5是本發(fā)明實施例1的試劑盒對樣本3進行pcr反應(yīng)后進行毛細管電泳分析后的圖譜；

圖6是本發(fā)明實施例1的試劑盒對樣本4進行pcr反應(yīng)后進行毛細管電泳分析后的圖譜。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明進行具體的描述，有必要在此指出的是以下實施例只用于對本發(fā)明進行進一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)上述本發(fā)明內(nèi)容對本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整。下述實施例中，若非特意表明，所用的試劑均為分析純，所用試劑均可從商業(yè)渠道獲得。文中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如j.薩姆布魯克等編著的科學(xué)出版社2002年出版的《分子克隆實驗指南》一書中所述的條件，或按照制造商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。

實施例1

一、試劑盒的組成

本實施例的腹瀉病原體多重基因檢測試劑盒檢測試劑盒包括：引物混合物、pcr緩沖液(5×pcrbuffer)、mgcl2溶液、dntps、熱啟動dna聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶混合液、udg酶、陽性對照物和陰性對照物。

pcr緩沖液、熱啟動dna聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶混合液均來自qiagen公司(貨號：210212)。

熱啟動dna聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶混合在一起形成混合液，其中熱啟動dna聚合酶在反應(yīng)體系中的濃度是0.1u/μl，逆轉(zhuǎn)錄酶在混合液中的濃度是0.1u/μl。

陽性對照液是包括所有目的基因靶點的質(zhì)粒混合物。

陰性對照液是無核酸酶超純水。

引物混合物中包括：針對空腸彎曲菌的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對志賀氏菌的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對艱難梭菌的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對腸炎沙門菌的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對鼠傷寒沙門菌的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對腸出血性大腸埃希菌的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對腸致病性大腸埃希菌的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對腸黏附性大腸埃希菌的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對弧菌的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對腸侵襲性大腸埃希菌的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對大腸埃希菌o157的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對人星狀病毒的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對諾如病毒ii的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對人腸道腺病毒的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對輪狀病毒a的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對輪狀病毒b的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對輪狀病毒c的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對人rna內(nèi)參的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對人dna內(nèi)參的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列；針對系統(tǒng)質(zhì)控內(nèi)參的正向引物的核苷酸序列和反向引物的核苷酸序列。

人rna內(nèi)參是b2m，人dna內(nèi)參是rnasep，系統(tǒng)質(zhì)控內(nèi)參是含有卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒。

各引物的特征如表1所示。引物均由上海桑尼生物科技有限公司合成。

表1腹瀉病原體引物序列特征表

二、試劑盒的使用方法

本實施例的腹瀉病原體檢測試劑盒的具體檢測步驟如下：

1.樣本采集

將腹瀉患者的糞便組織標本浸入生理鹽水中，采用天跟抽提試劑盒提取樣本總基因組，具體的操作參見抽提試劑盒產(chǎn)品說明書。

獲得樣本核酸基因后，經(jīng)紫外分光光度計測定濃度和od260/od280的比值控制樣本核酸質(zhì)量。樣本核酸的優(yōu)選濃度為10ng/μl～100ng/μl。od260/od280的比值的優(yōu)選范圍為1.7～1.9。

2.pcr反應(yīng)

采用本實施例的試劑盒中的試劑分別與基因模板(樣本核酸、陽性對照液或陰性對照液)配制pcr反應(yīng)體系，具體組分如表2所示。

表2pcr反應(yīng)體系組分表

然后在pcr儀(abiveriti96well)上進行pcr反應(yīng)程序，最優(yōu)反應(yīng)程序如表3所示。

表3pcr反應(yīng)程序表

3.毛細管電泳片段分析

在96孔樣品板的每個孔中加入9μl的甲酰胺(absciex公司，貨號：608082)和0.25μl的內(nèi)標(dnasizestandard500，absciex公司，貨號：608098)，再將1μl的pcr產(chǎn)物加入其中。

根據(jù)ab3500dx毛細管電泳分析儀的操作手冊，將樣品板放入機器，運行fragment分離程序。執(zhí)行默認的分析方法，最后保存數(shù)據(jù)。

針對各個基因的pcr產(chǎn)物片段大小不同,得到的毛細管電泳峰圖，其中橫坐標表示片段長度，縱坐標表示熒光強度。

4.結(jié)果分析

毛細管電泳分析儀自動進行數(shù)據(jù)分析。

三、試劑盒的檢測結(jié)果判定

1.試劑盒有效性判定

同時滿足下列條件，才可進行結(jié)果判定：

1)陰性對照：只檢測到系統(tǒng)質(zhì)控內(nèi)參特異峰。

2)陽性對照：在各擴增片段長度處各檢測到一個熒光信號，且熒光信號值高于300。

2.樣本有效性判定：

2)若檢測樣本的熒光信號值至少有一個高于32000，則樣本加入過量，建議對pcr產(chǎn)物進行適當稀釋后再進行毛細管電泳檢測。

3)若檢測樣本的熒光信號值均低于300，則樣本加入量較低，可適當增加pcr產(chǎn)物加入量或增加pcr反應(yīng)循環(huán)數(shù)；若仍然不符合要求，需重新制備樣本。

3.結(jié)果判定標準

腹瀉病原體感染鑒定

人dna內(nèi)參、人rna內(nèi)參、系統(tǒng)質(zhì)控內(nèi)參和腹瀉病原體基因的目的片段區(qū)域出現(xiàn)了相應(yīng)的峰且熒光信號值均高于300，可以判斷感染了腹瀉病原體。

4.結(jié)果判斷實例

采用本實施例的試劑盒對單個陽性對照分別進行pcr反應(yīng)后采用毛細管電泳分析?；虻哪繕似螀^(qū)域空腸彎曲菌、志賀菌、艱難梭菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌、腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌、腸出血性大腸埃希菌、腸致病性大腸埃希菌、腸黏附性大腸埃希菌、腸侵襲性大腸埃希菌、大腸埃希菌o157、弧菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、人星狀病毒、諾如病毒ii、人腸道腺病毒、輪狀病毒a、輪狀病毒b和輪狀病毒c的19種病原體均出現(xiàn)了相應(yīng)的峰。該結(jié)果非常直觀，基因均擴增良好。說明每對引物能有效擴增對應(yīng)的目的基因，特異性好。

采用本實施例的試劑盒對所有陽性對照的混合進行pcr反應(yīng)后采用毛細管電泳分析后圖譜如圖1所示?；虻哪繕似螀^(qū)域空腸彎曲菌、志賀菌、艱難梭菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌、腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌、腸出血性大腸埃希菌、腸致病性大腸埃希菌、腸黏附性大腸埃希菌、腸侵襲性大腸埃希菌、大腸埃希菌o157、弧菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、人星狀病毒、諾如病毒ii、人腸道腺病毒、輪狀病毒a、輪狀病毒b和輪狀病毒c19種病原體均出現(xiàn)了相應(yīng)的峰。該結(jié)果非常直觀，基因均擴增良好。說明各引物之間沒有干擾，能同時有效擴增所有目的基因。

采用本實施例的試劑盒對陰性對照進行pcr反應(yīng)后采用毛細管電泳分析，沒有出現(xiàn)任何目的基因峰，只在小于100nt處有非特異性背景熒光信號。說明該檢測體系特異性非常好。

采用本實施例的試劑盒對單個腹瀉病原體陽性對照進行系列稀釋后，進行pcr反應(yīng)后采用毛細管電泳分析后的圖譜如表4所示，檢測最低靈敏度艱難梭菌、腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌、腸黏附性大腸埃希菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌、弧菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌和輪狀病毒可達到1000個拷貝；空腸彎曲菌、腸出血性大腸埃希菌、腸致病性大腸埃希菌、腸侵襲性大腸埃希菌和人星狀病毒可達到100個拷貝；志賀菌、諾如病毒ii型和人腸道腺病毒可達到10個拷貝。說明該檢測系統(tǒng)對腹瀉病原體單重感染檢測的靈敏度很高。

表4腹瀉病原體檢測靈敏度

采用本實施例的試劑盒對所有的腹瀉病原體陽性對照進行混合后并系列稀釋后，進行pcr反應(yīng)后采用毛細管電泳分析后的圖譜如圖2所示，在1000個拷貝/反應(yīng)的稀釋度時19種目標病原體都可以被檢測出，且信號值均高于300，結(jié)果清晰易判讀。說明該檢測體系對腹瀉病原體多重感染檢測靈敏度也很高。

采用本實施例的試劑盒對樣本1進行pcr反應(yīng)后采用毛細管電泳分析后的圖譜如圖3所示。人rna內(nèi)參、人dna內(nèi)參和系統(tǒng)質(zhì)控內(nèi)參同時出現(xiàn)且信號值大于300，艱難梭菌(c.difficile)基因的目標片段區(qū)域均出現(xiàn)了相應(yīng)的峰且信號值大于300。根據(jù)結(jié)果判定標準，說明該患者感染了艱難梭菌。檢測結(jié)果非常直觀。

采用本實施例的試劑盒對樣本2進行pcr反應(yīng)后采用毛細管電泳分析后的圖譜如圖4所示。人rna內(nèi)參、人dna內(nèi)參和系統(tǒng)質(zhì)控內(nèi)參同時出現(xiàn)且信號值大于300，鼠傷寒沙門(s.typhimurium)基因的目標片段區(qū)域均出現(xiàn)了相應(yīng)的峰且信號值大于300。根據(jù)結(jié)果判定標準，說明該患者感染了鼠傷寒沙門。檢測結(jié)果非常直觀。

采用本實施例的試劑盒對樣本3進行pcr反應(yīng)后采用毛細管電泳分析后的圖譜如圖5所示。人rna內(nèi)參、人dna內(nèi)參和系統(tǒng)質(zhì)控內(nèi)參同時出現(xiàn)且信號值大于300，輪狀病毒(rov)基因的目標片段區(qū)域均出現(xiàn)了相應(yīng)的峰且信號值大于300。根據(jù)結(jié)果判定標準，說明該患者感染了輪狀病毒。檢測結(jié)果非常直觀。

采用本實施例的試劑盒對樣本4進行pcr反應(yīng)后采用毛細管電泳分析后的圖譜如圖6所示。人rna內(nèi)參、人dna內(nèi)參和系統(tǒng)質(zhì)控內(nèi)參同時出現(xiàn)且信號值大于300，艱難梭菌、鼠傷寒沙門菌和人腸道腺病毒(s.typhimurium、c.difficile、hadv)基因的目標片段區(qū)域均出現(xiàn)了相應(yīng)的峰且信號值大于300。根據(jù)結(jié)果判定標準，說明該患者同時感染了艱難梭菌、鼠傷寒沙門菌和人腸道腺病毒。檢測結(jié)果非常直觀。

實施例2

本實施例的腹瀉病原菌多重基因檢測試劑盒檢測試劑盒其余部分與實施例1相同，不同之處在于:引物混合物中僅包括:分別針對空腸彎曲菌、志賀菌、艱難梭菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌、腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌、腸出血性大腸埃希菌、腸致病性大腸埃希菌、腸黏附性大腸埃希菌、腸侵襲性大腸埃希菌、大腸埃希菌o157、弧菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌進行檢測的正反向pcr擴增引物,以及針對人dna內(nèi)參和系統(tǒng)質(zhì)控內(nèi)參進行檢測的正反向pcr擴增引物。用于同步檢測13種感染性腹瀉常見病原菌。

顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式一一列舉。而這些屬于本發(fā)明的精神所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之中。

sequencelisting

<110>華東醫(yī)院

<120>腹瀉病原菌多重基因檢測體系及其試劑盒和應(yīng)用

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