本發(fā)明涉及dna糖基化酶檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用固有熒光核苷酸超靈敏同時(shí)檢測(cè)多種dna糖基化酶的方法。

背景技術(shù)：

內(nèi)源性dna損傷是各種內(nèi)部和環(huán)境因素作用的結(jié)果，會(huì)引起dna突變和復(fù)制錯(cuò)誤，進(jìn)一步引發(fā)癌癥。堿基切除修復(fù)(ber)是處理由氧化、烷基化和脫氨基所引起的內(nèi)源性dna堿基損傷的主要修復(fù)途徑。ber通路由dna糖基化酶引發(fā)，它可以催化損傷/錯(cuò)配堿基的切割，并產(chǎn)生作用于下游ber修復(fù)過程的脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)。

dna糖基化酶的異常表達(dá)與人類疾病密切相關(guān)，對(duì)dna糖基化酶的準(zhǔn)確檢測(cè)對(duì)于了解dna損傷修復(fù)過程和臨床診斷有重要意義。傳統(tǒng)的dna糖基化酶檢測(cè)方法中，放射性標(biāo)記的方法靈敏度偏低，而且同位素標(biāo)記探針會(huì)引起放射性污染；凝膠電泳方法靈敏度低，需要樣品量大，對(duì)操作技巧要求高，不適合定量分析；酶聯(lián)免疫吸附法和免疫印跡法需要與蛋白結(jié)合的特異性抗體，操作步驟繁瑣。色譜法定性能力較差，當(dāng)被分離物極性相差較小時(shí)分離效果不好，洗脫時(shí)使用溶劑較多，造成溶劑浪費(fèi)；鏈霉親和素順磁珠捕獲技術(shù)需要分離步驟，操作程序復(fù)雜，無法進(jìn)行均相檢測(cè)，并且標(biāo)記較為昂貴。熒光方法具有安全、簡(jiǎn)單、靈敏度高的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。然而，熒光方法依賴于用熒光團(tuán)和猝滅劑進(jìn)行外部標(biāo)記，用于均相測(cè)定，涉及到復(fù)雜的設(shè)計(jì)且費(fèi)用高。此外，目前所報(bào)道的熒光方法僅能檢測(cè)到單一類型的dna糖基化酶。事實(shí)上，所有的哺乳動(dòng)物會(huì)表達(dá)多種dna糖基化酶來維持基因組的穩(wěn)定，每種dna糖基化酶具有底物特異性。多種dna糖基化酶，如hogg1和udg，都參與ber途徑處理內(nèi)源性dna堿基損傷，而hogg1和udg的異常表達(dá)對(duì)于分析多種類型的癌癥具有深刻的意義。因此，開發(fā)同時(shí)檢測(cè)多種dna糖基化酶的方法，能為解釋dna損傷修復(fù)過程和提高早期臨床診斷準(zhǔn)確性提供新機(jī)會(huì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種利用固有熒光核苷酸超靈敏同時(shí)檢測(cè)多種dna糖基化酶的方法。

本發(fā)明通過2-氨基嘌呤(2-ap)和吡咯-脫氧胞苷(p-dc)作為熒光基團(tuán)，dna分子作為固有猝滅劑，結(jié)合外切酶協(xié)助的循環(huán)信號(hào)放大同時(shí)檢測(cè)多種dna糖基化酶的快速、靈敏的熒光方法，不需要額外的熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)標(biāo)記，不僅達(dá)到實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單、直觀、高靈敏度、檢測(cè)實(shí)際樣本的目的，更重要的是實(shí)現(xiàn)了多種dna糖基化酶同時(shí)檢測(cè)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一方面，提供一種用于同時(shí)檢測(cè)多種dna糖基化酶的探針組合，包括：雙功能dna探針、觸發(fā)探針1、觸發(fā)探針2、2-ap信號(hào)探針和p-dc信號(hào)探針；

所述雙功能dna探針的核苷酸序列如seqidno.1所示；

觸發(fā)探針1的核苷酸序列如seqidno.2所示；

觸發(fā)探針2的核苷酸序列如seqidno.3所示；

2-ap信號(hào)探針的核苷酸序列如seqidno.4所示；

p-dc信號(hào)探針的核苷酸序列如seqidno.5所示。

本發(fā)明的第二方面，提供上述探針組合在制備同時(shí)檢測(cè)多種dna糖基化酶的試劑盒或芯片中的用途。

本發(fā)明的第三方面，提供一種同時(shí)檢測(cè)多種dna糖基化酶的試劑盒，該試劑盒中包含上述的探針組合。

進(jìn)一步的，本發(fā)明的試劑盒中還包括：反應(yīng)緩沖液、nb.btsi內(nèi)切酶和lambda核酸外切酶。

優(yōu)選的，所述反應(yīng)緩沖液中含有：10×neb緩沖液2、bsa、10×udg反應(yīng)緩沖液、10×lambda核酸外切酶反應(yīng)緩沖液。

本發(fā)明的第四方面，提供一種同時(shí)檢測(cè)hogg1和udg的方法，步驟如下：

(1)將雙功能dna探針、觸發(fā)探針1和觸發(fā)探針2在含有nacl、tris-hcl和edta的緩沖液中孵育，孵育后冷卻，形成三明治雜交dna底物；

(2)分別將2-ap信號(hào)探針和p-dc信號(hào)探針在含有mgcl2和tris-hcl的緩沖液中孵育，孵育后冷卻，使2-ap信號(hào)探針和p-dc信號(hào)探針折疊，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；

(3)向反應(yīng)緩沖液中加入三明治雜交dna底物和待檢測(cè)樣品，孵育，孵育后加入步驟(2)中形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的2-ap信號(hào)探針和p-dc信號(hào)探針，以及nb.btsi內(nèi)切酶和lambda核酸外切酶，黑暗條件下繼續(xù)孵育，將孵育后的反應(yīng)產(chǎn)物分別在365nm和450nm處進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測(cè)，分別用于hogg1和udg的定量分析。

步驟(1)中，孵育的溫度為95℃，孵育的時(shí)間為5min。

優(yōu)選的，步驟(1)中，所述緩沖液中含有50毫摩爾每升nacl，10毫摩爾每升tris-hcl(ph8.0)和1毫摩爾每升乙二胺四乙酸(edta)。

步驟(2)中，孵育的溫度為95℃，孵育的時(shí)間為5min。

優(yōu)選的，步驟(2)中，所述緩沖液中含有1.5毫摩爾每升氯化鎂(mgcl2)和10毫摩爾每升tris-hcl(ph8.0)。

步驟(3)中，孵育的溫度為37℃，孵育的時(shí)間為60min。

步驟(3)中，黑暗條件下孵育的溫度為37℃，孵育的時(shí)間為60min。

本發(fā)明的第五方面，提供上述探針組合或試劑盒在篩選dna糖基化酶抑制劑中的用途。

本發(fā)明的有益效果：

(1)本發(fā)明通過巧妙地設(shè)計(jì)雙功能探針，可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種dna糖基化酶的同時(shí)檢測(cè)。

迄今為止的文獻(xiàn)報(bào)道，只能檢測(cè)單一的糖基化酶。本發(fā)明成功設(shè)計(jì)了一個(gè)有一個(gè)8-氧代鳥嘌呤和五個(gè)尿嘧啶堿基修飾的雙功能dna探針，它可以與觸發(fā)探針1和觸發(fā)探針2雜交，形成hogg1和udg作用的三明治雜交dna底物，通過以下兩個(gè)步驟：1)hogg1引發(fā)的8-氧代鳥嘌呤切除修復(fù)和udg引發(fā)的尿嘧啶切除修復(fù)，2)lambda核酸外切酶介導(dǎo)的信號(hào)探針的循環(huán)切割和熒光信號(hào)的釋放，能夠同時(shí)檢測(cè)這兩種糖基化酶，并能保證很好的特異性。

(2)不需額外的熒光染料標(biāo)記。

傳統(tǒng)的熒光方法依賴于用熒光團(tuán)和猝滅劑進(jìn)行外部標(biāo)記，涉及到復(fù)雜的設(shè)計(jì)且標(biāo)記費(fèi)用高。本發(fā)明使用2-ap和p-dc作為熒光基團(tuán)，dna分子作為固有猝滅劑，由于堿基之間有效的堆積相互作用，2-ap和p-dc在摻入雙鏈dna時(shí)表現(xiàn)出弱熒光，但經(jīng)過nb.btsi內(nèi)切酶和lambda核酸外切酶切割，釋放出游離的2-ap和p-dc分子，使得熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)。與傳統(tǒng)的分子信標(biāo)相比，2-ap和p-dc熒光的猝滅是由于與相鄰堿基的更有效的堆疊相互作用，避免了使用較大的有機(jī)猝滅劑。另外，2-ap和p-dc可以標(biāo)記在信號(hào)探針的任何位置，在2-ap(365納米)和p-dc(450納米)的發(fā)射光譜之間沒有明顯的光譜重疊和串?dāng)_。

(3)不需要復(fù)雜的dna擴(kuò)增步驟，即可達(dá)到信號(hào)放大的目的，且靈敏度高。

傳統(tǒng)的dna擴(kuò)增需要設(shè)計(jì)模板、引物，加入原料，還需要有熱力學(xué)循環(huán)，這樣使得實(shí)驗(yàn)復(fù)雜，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，耗費(fèi)勞動(dòng)力。本發(fā)明設(shè)計(jì)了lambda核酸外切酶介導(dǎo)的信號(hào)探針的循環(huán)切割和熒光信號(hào)的放大。觸發(fā)探針與雙功能探針分離后，與信號(hào)探針結(jié)合，通過酶切，釋放游離的熒光分子，同時(shí)，觸發(fā)探針又可以與新的信號(hào)探針結(jié)合，形成了切割-消化-雜交的新循環(huán)，實(shí)現(xiàn)了觸發(fā)探針的重復(fù)利用和熒光信號(hào)的放大，提高了靈敏度。

附圖說明

構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分的說明書附圖用來提供對(duì)本申請(qǐng)的進(jìn)一步理解，本申請(qǐng)的示意性實(shí)施例及其說明用于解釋本申請(qǐng)，并不構(gòu)成對(duì)本申請(qǐng)的不當(dāng)限定。

圖1：2-ap和p-dc的歸一化吸收和發(fā)射光譜；圖中：曲線1為2-ap吸收光譜；曲線2為2-ap發(fā)射光譜；曲線3為p-dc吸收光譜；曲線4為p-dc發(fā)射光譜。

圖2：本發(fā)明同時(shí)檢測(cè)多種dna糖基化酶的原理圖。

圖3：(a)存在hogg1(曲線1)和不存在hogg1(曲線2)的情況下2-ap的歸一化熒光發(fā)射光譜。(b)存在udg(曲線3)和不存在udg(曲線4)的情況下p-dc的歸一化熒光發(fā)射光譜。(c)存在和不存在hogg1和udg的情況下，2-ap和p-dc的歸一化熒光發(fā)射光譜。hogg1濃度為32u每毫升，udg濃度為50u每毫升。

圖4：(a)不同濃度的hogg1對(duì)應(yīng)的歸一化的熒光發(fā)射光譜圖。(b)365納米處的歸一化熒光強(qiáng)度隨hogg1濃度變化的曲線。內(nèi)置圖為365納米處的歸一化熒光強(qiáng)度與hogg1濃度的對(duì)數(shù)線性圖，線性范圍從0.005u每毫升至1u每毫升。(c)不同濃度的udg對(duì)應(yīng)的歸一化的熒光發(fā)射光譜圖。(d)450納米處的歸一化熒光強(qiáng)度隨udg濃度變化的曲線。內(nèi)置圖為450納米處的歸一化熒光強(qiáng)度與udg濃度的對(duì)數(shù)線性圖，線性范圍從0.005u每毫升至5u每毫升。誤差棒表示三組實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

圖5：特異性檢測(cè)。hogg1濃度為32u每毫升，udg濃度為50u每毫升，tdg濃度為100u每毫升。f和f0分別是存在和不存在dna糖基化酶時(shí)的熒光信號(hào)。誤差棒表示三組實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

圖6：動(dòng)力學(xué)分析。(a)對(duì)于hogg1，初始速度隨著dna底物濃度的變化。(b)對(duì)于udg，初始速度隨著dna底物濃度的變化。誤差棒表示三組實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

圖7：實(shí)際樣品分析。(a)365納米處的歸一化熒光強(qiáng)度與hela細(xì)胞數(shù)之間的線性關(guān)系。hela細(xì)胞數(shù)分別為5,10,100,1000，10000個(gè)細(xì)胞。(b)450納米處歸一化熒光強(qiáng)度與hela細(xì)胞數(shù)之間的線性關(guān)系。細(xì)胞數(shù)分別為5,10,100,1000，10000個(gè)細(xì)胞。誤差棒表示三組實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

圖8：抑制劑分析。(a)hogg1對(duì)于不同濃度5-fu的相對(duì)活性的變化。(b)udg對(duì)于不同濃度5-fu的相對(duì)活性的變化。hogg1濃度為32u每毫升，udg濃度為50u每毫升。誤差棒表示三組實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

具體實(shí)施方式

應(yīng)該指出，以下詳細(xì)說明都是例示性的，旨在對(duì)本申請(qǐng)?zhí)峁┻M(jìn)一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本申請(qǐng)所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

需要注意的是，這里所使用的術(shù)語僅是為了描述具體實(shí)施方式，而非意圖限制根據(jù)本申請(qǐng)的示例性實(shí)施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復(fù)數(shù)形式，此外，還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)在本說明書中使用術(shù)語“包含”和/或“包括”時(shí)，其指明存在特征、步驟、操作、器件、組件和/或它們的組合。

正如背景技術(shù)所介紹的，現(xiàn)有技術(shù)中熒光方法僅能檢測(cè)到單一類型的dna糖基化酶。基于此，本發(fā)明提出了一種利用固有熒光核苷酸超靈敏同時(shí)檢測(cè)多種dna糖基化酶的方法。

在本申請(qǐng)的一種實(shí)施方案中，提供了一種用于同時(shí)檢測(cè)多種dna糖基化酶的探針組合，包括：雙功能dna探針、觸發(fā)探針1、觸發(fā)探針2、2-ap信號(hào)探針和p-dc信號(hào)探針；

所述雙功能dna探針的核苷酸序列如seqidno.1所示；

觸發(fā)探針1的核苷酸序列如seqidno.2所示；

觸發(fā)探針2的核苷酸序列如seqidno.3所示；

2-ap信號(hào)探針的核苷酸序列如seqidno.4所示；

p-dc信號(hào)探針的核苷酸序列如seqidno.5所示。

具體如下：

*表示硫代磷酸酯修飾。雙功能dna探針中加粗的g和u堿基分別表示損傷的鳥嘌呤(8-氧代鳥嘌呤)和尿嘧啶脫氧核糖核苷酸。雙功能dna探針的下劃線區(qū)域和下劃線斜體區(qū)分別與表示觸發(fā)探針1和觸發(fā)探針2的結(jié)合序列。觸發(fā)探針1的下劃線加粗區(qū)域和觸發(fā)探針2的下劃線斜體加粗區(qū)域表示與雙功能dna探針的結(jié)合序列。2-ap信號(hào)探針和p-dc信號(hào)探針中的箭頭表示nb.btsi內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)。2-ap信號(hào)探針和p-dc信號(hào)探針的加粗區(qū)域表示該發(fā)夾探針內(nèi)的互補(bǔ)區(qū)域。

在本申請(qǐng)的另一種實(shí)施方案中，提供了一種同時(shí)檢測(cè)hogg1和udg的方法，步驟如下：

(1)將雙功能dna探針、觸發(fā)探針1和觸發(fā)探針2在含有nacl、tris-hcl和edta的緩沖液中，在95℃下孵育5分鐘，然后緩慢冷卻到室溫以形成三明治雜交dna底物；

(2)分別將2-ap信號(hào)探針和p-dc信號(hào)探針在含有mgcl2和tris-hcl的緩沖液中，95℃孵育5分鐘，然后緩慢冷卻至室溫使2-ap信號(hào)探針和p-dc信號(hào)探針折疊形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；

(3)向反應(yīng)緩沖液中加入三明治雜交dna底物和待檢測(cè)樣品，37℃孵育60分鐘，孵育后加入步驟(2)中形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的2-ap信號(hào)探針和p-dc信號(hào)探針，以及nb.btsi內(nèi)切酶和lambda核酸外切酶，黑暗中37℃繼續(xù)孵育60分鐘，將孵育后的反應(yīng)產(chǎn)物分別在365nm和450nm處進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測(cè)，分別用于hogg1和udg的定量分析。

本申請(qǐng)以hogg1和udg作為模型，以2-ap和p-dc作為熒光基團(tuán)，結(jié)合外切酶協(xié)助的循環(huán)信號(hào)放大技術(shù)，開發(fā)了一種同時(shí)檢測(cè)多種dna糖基化酶的快速、靈敏的熒光方法。dna分子作為固有猝滅劑，由于堿基之間有效的堆積相互作用，一些熒光的核苷酸類似物如2-ap和p-dc在摻入雙鏈dna(dsdna)時(shí)表現(xiàn)出弱熒光，但在溶液中游離時(shí)熒光顯著增強(qiáng)。與傳統(tǒng)的分子信標(biāo)相比，2-ap和p-dc熒光的猝滅是由于與相鄰堿基的更有效的堆疊相互作用，避免了使用較大的有機(jī)猝滅劑。另外，2-ap和p-dc可以標(biāo)記在信號(hào)探針的任何位置，在2-ap(365納米)和p-dc(450納米)的發(fā)射光譜之間沒有明顯的光譜重疊和串?dāng)_(圖1)。我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)有一個(gè)8-氧代鳥嘌呤和五個(gè)尿嘧啶堿基修飾的雙功能dna探針，它可以與觸發(fā)探針雜交，形成hogg1和udg作用的三明治雜交dna底物，從而能夠區(qū)別hogg1和udg與其他dna糖基化酶。在hogg1和udg存在時(shí)，通過循環(huán)的lambda外切核酸酶消化來啟動(dòng)信號(hào)擴(kuò)增過程，產(chǎn)生不同的熒光信號(hào)，其中2-ap指示hogg1，p-dc指示udg。本方法能夠高靈敏度、高選擇性的同時(shí)檢測(cè)多種dna糖基化酶，甚至可以在單細(xì)胞水平上測(cè)定dna糖基化酶。

本申請(qǐng)的檢測(cè)原理(圖2)為：我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)有一個(gè)8-氧代鳥嘌呤和五個(gè)尿嘧啶堿基修飾的雙功能dna探針，它可以與觸發(fā)探針1和觸發(fā)探針2雜交，形成hogg1和udg作用的三明治雜交dna底物。觸發(fā)探針1和觸發(fā)探針2都具有包含nb.btsi內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)的3'突出末端。上述探針的5'末端均用硫代磷酸酯修飾以防止lambda核酸外切酶消化。2-ap信號(hào)探針和p-dc信號(hào)探針是發(fā)夾結(jié)構(gòu)，有莖、環(huán)兩部分，其中2-ap熒光基團(tuán)和p-dc熒光基團(tuán)標(biāo)記在莖中，5'突出末端用硫代磷酸酯修飾。由于堿基的堆積相互作用，2-ap信號(hào)探針和p-dc信號(hào)探針都顯示出弱熒光，但在溶液中游離時(shí)熒光顯著增強(qiáng)。2-ap信號(hào)探針和p-dc信號(hào)探針的5'末端含有nb.btsi內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，當(dāng)形成雙鏈dna(dsdna)時(shí)可被nb.btsi內(nèi)切酶識(shí)別。

此方法包括兩個(gè)步驟：(1)hogg1引發(fā)的8-氧代鳥嘌呤切除修復(fù)和udg引發(fā)的尿嘧啶切除修復(fù)，(2)lambda核酸外切酶介導(dǎo)的信號(hào)探針的循環(huán)切割和熒光信號(hào)的釋放。hogg1可以促進(jìn)從三明治雜交dna底物中的8-氧代鳥嘌呤/胞嘧啶堿基對(duì)中去除受損的8-氧代鳥嘌呤，隨后水解無堿基位點(diǎn)的3'-磷酸二酯鍵，導(dǎo)致雙功能探針與觸發(fā)探針1分離并釋放觸發(fā)探針1。釋放的觸發(fā)探針1可以與2-ap信號(hào)探針雜交以形成具有nb.btsi內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的新的穩(wěn)定的雙鏈dna。通過nb.btsi內(nèi)切酶切割2-ap信號(hào)探針，產(chǎn)生可使lambda核酸外切酶切割的位點(diǎn)。通過lambda核酸外切酶消化雙鏈dna釋放游離的2-ap分子和觸發(fā)探針1，觸發(fā)探針1可以與新的2-ap信號(hào)探針雜交，引發(fā)切割-消化-雜交的新循環(huán)，產(chǎn)生大量游離的2-ap分子，在發(fā)射波長(zhǎng)365納米處的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。類似地，udg可以切除三明治雜交dna底物的五個(gè)尿嘧啶堿基，雙鏈dna變得不穩(wěn)定，導(dǎo)致雙功能探針-觸發(fā)探針2雙鏈的解離和觸發(fā)探針2的釋放。釋放的觸發(fā)探針2可以與p-dc信號(hào)探針雜交并啟動(dòng)切割-消化-雜交的循環(huán)，在發(fā)射波長(zhǎng)450納米處的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。當(dāng)同時(shí)存在hogg1和udg時(shí)，可以分別通過hogg1和udg從三明治雜交dna底物中切除一個(gè)8-氧代鳥嘌呤和五個(gè)尿嘧啶堿基，導(dǎo)致觸發(fā)探針1和觸發(fā)探針2的釋放。釋放的觸發(fā)探針1和觸發(fā)探針2可分別與2-ap信號(hào)探針和p-dc信號(hào)探針雜交，啟動(dòng)信號(hào)放大過程，在發(fā)射波長(zhǎng)365納米和450納米處的熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)。在沒有hogg1和udg的情況下，既不能切除8-氧代鳥嘌呤堿基，釋放觸發(fā)探針1，也不能切除尿嘧啶堿基，釋放觸發(fā)探針2。結(jié)果不會(huì)發(fā)生切割和消化反應(yīng)，在2-ap和p-dc對(duì)應(yīng)發(fā)射波長(zhǎng)處沒有熒光增強(qiáng)。

為了驗(yàn)證本發(fā)明技術(shù)方案的可行性，我們進(jìn)行了熒光測(cè)量。在hogg1存在的情況下，觀察到在發(fā)射波長(zhǎng)365納米處有明顯的2-ap的熒光信號(hào)(圖3a，曲線1)，但是在450納米的發(fā)射波長(zhǎng)處沒有觀察到p-dc的熒光信號(hào)。在沒有hogg1的情況下，沒有觀察到明顯的2-ap熒光信號(hào)(圖3a，曲線2)。由此表明，hogg1可以特異性地從8-氧代鳥嘌呤/胞嘧啶堿基對(duì)中切除受損的8-氧代鳥嘌呤堿基，并從雙功能探針-觸發(fā)探針1雜交鏈中釋放觸發(fā)探針1，啟動(dòng)信號(hào)放大過程，產(chǎn)生放大的2-ap熒光信號(hào)。在udg存在的情況下，觀察到在發(fā)射波長(zhǎng)450納米處有明顯的p-dc的熒光信號(hào)(圖3b，曲線3)，但沒有觀察到顯著的2-ap熒光信號(hào)。在沒有udg的情況下，沒有觀察到明顯的p-dc信號(hào)(圖3b，曲線4)。此結(jié)果表明udg可以從腺嘌呤/尿嘧啶堿基對(duì)中特異性地切除尿嘧啶，并從雙功能探針-觸發(fā)探針2雜交鏈中釋放觸發(fā)探針2，啟動(dòng)信號(hào)放大過程，并產(chǎn)生放大的p-dc熒光信號(hào)。值得注意的是，只有當(dāng)hogg1和udg的共存時(shí)可以同時(shí)產(chǎn)生明顯的2-ap和p-dc熒光信號(hào)(圖3c，曲線1和曲線3)。這些結(jié)果清楚地表明，此實(shí)驗(yàn)方法可以用于同時(shí)檢測(cè)多種dna糖基化酶。

為了評(píng)估本發(fā)明技術(shù)方案檢測(cè)dna糖基化酶的靈敏度，我們?cè)谧罴褜?shí)驗(yàn)條件下測(cè)定各種濃度的hogg1和udg。圖4a表示的是不同濃度的hogg1對(duì)應(yīng)的歸一化的熒光發(fā)射光譜圖。365納米處的熒光強(qiáng)度隨著的hogg1濃度(從0至40u每毫升)的增加而增強(qiáng)。此外，在hogg1濃度為0.005u每毫升至1u每毫升范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度與濃度呈對(duì)數(shù)線性相關(guān)(圖4b的插圖)?；貧w方程為f＝0.5012+0.1552log10c，相關(guān)系數(shù)為0.9909，其中f為歸一化熒光強(qiáng)度，c為hogg1的濃度。通過計(jì)算空白信號(hào)加3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差，計(jì)算出檢測(cè)限為0.0035u每毫升。我們所提出的方法的靈敏度與基于納米金的比色分析(0.7u每毫升)相比，提高了2個(gè)數(shù)量級(jí)；與基于dna酶的比色測(cè)定(0.01u每毫升)相比，提高一個(gè)數(shù)量級(jí)；與exoiii輔助等溫?cái)U(kuò)增熒光法(0.001u每毫升)相當(dāng)。圖4c表示的是不同濃度的udg對(duì)應(yīng)的歸一化的熒光發(fā)射光譜圖。發(fā)射波長(zhǎng)為450納米處的熒光強(qiáng)度隨著udg濃度(從0至50u每毫升)的增加而增強(qiáng)。此外，在udg濃度為0.005u每毫升至5u每毫升范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度與濃度呈對(duì)數(shù)線性相關(guān)(圖4d的插圖)?；貧w方程為f＝0.602+0.1377log10c，相關(guān)系數(shù)為0.9902，其中f是歸一化熒光強(qiáng)度，c是udg的濃度。計(jì)算得出檢測(cè)限為0.0025u每毫升，與基于g-四倍體發(fā)光測(cè)定(0.02u每毫升)和無標(biāo)記的比色法(0.02u每毫升)相比，檢測(cè)限提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)；與滾環(huán)擴(kuò)增介導(dǎo)的dna核酶方法(0.002u每毫升)相當(dāng)。

為了評(píng)估本發(fā)明技術(shù)方案檢測(cè)dna糖基化酶的特異性，我們以胸腺嘧啶糖基化酶(tdg)作為干擾酶。tdg是一種單功能酶，可以從鳥嘌呤/胸腺嘧啶錯(cuò)配堿基對(duì)中選擇性切除胸腺嘧啶。如圖5所示，在hogg1和udg存在下，2-ap和p-dc的熒光信號(hào)可以同時(shí)檢測(cè)到。只有hogg1存在下，僅觀察到明顯的2-ap的熒光信號(hào)。只有udg存在的情況下，僅觀察到p-dc的熒光信號(hào)。但是僅有tdg存在時(shí)，不能觀察到2-ap和p-dc的熒光信號(hào)。此結(jié)果清楚地表明該檢測(cè)方法有良好的特異性。

我們進(jìn)一步應(yīng)用此方法來測(cè)定hogg1和udg的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)。我們分別測(cè)量了5u每毫升hogg1和10u每毫升udg與不同濃度的三明治雜交dna底物在37℃反應(yīng)10分鐘的初始速度。如圖6所示，hogg1(圖6a)和udg(圖6b)的初始速度均隨著三明治雜交dna底物濃度的增加而增加。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合為米氏方程v＝vmax[s]/(km+[s])，其中vmax是最大初始速度，[s]是三明治雜交dna底物的濃度，km是米氏常數(shù)。得到hogg1的最大初速度為0.6184每秒，km為0.01472微摩爾每升，與基于單量子點(diǎn)的傳感器所得到的一致(10.7納摩爾每升)。udg的最大初速度為0.8981每秒，km為0.1641微摩爾每升，與通過熒光測(cè)定獲得的相一致(0.12±0.02微摩爾每升)。

為了使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更加清楚地了解本申請(qǐng)的技術(shù)方案，以下將結(jié)合具體的實(shí)施例詳細(xì)說明本申請(qǐng)的技術(shù)方案。

本發(fā)明實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料均為本領(lǐng)域常規(guī)的試驗(yàn)材料，均可通過商業(yè)渠道購(gòu)買得到。

實(shí)施例1：hogg1和udg的檢測(cè)

(1)dna儲(chǔ)備溶液的制備：將10微摩爾每升的雙功能dna探針，10微摩爾每升的觸發(fā)探針1和10微摩爾每升的觸發(fā)探針2加入含有50毫摩爾每升氯化鈉(nacl)，10毫摩爾每升tris-hcl(ph8.0)和1毫摩爾每升乙二胺四乙酸(edta)的緩沖液中，在95℃下孵育5分鐘，然后緩慢冷卻到室溫以形成三明治結(jié)構(gòu)。將10微摩爾每升的2-ap信號(hào)探針和10微摩爾每升的p-dc信號(hào)探針分別在含有1.5毫摩爾每升氯化鎂(mgcl2)和10毫摩爾每升tris-hcl(ph8.0)的緩沖液中，95℃孵育5分鐘，然后緩慢冷卻至室溫使2-ap信號(hào)探針和p-dc信號(hào)探針折疊形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。將獲得的dna儲(chǔ)備溶液儲(chǔ)存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

(2)hogg1和udg的熒光測(cè)定：hogg1和udg的檢測(cè)包括兩個(gè)連續(xù)的步驟。首先，在20微升含有2微升10×neb緩沖液2,100微克每毫升bsa，2微升10×udg反應(yīng)緩沖液中加入0.4微升10微摩爾每升的三明治雜交dna底物，加入不同濃度的hogg1和udg，37℃孵育60分鐘。然后，將0.8微升10微摩爾每升的2-ap信號(hào)探針和p-dc信號(hào)探針，3unb.btsi，2ulambda核酸外切酶，3微升10×lambda核酸外切酶反應(yīng)緩沖液加入反應(yīng)體系中，加超純水至總體積30微升，在黑暗中37℃孵育60分鐘。用超純水將30微升反應(yīng)產(chǎn)物稀釋至終體積為60微升。使用日立f-7000熒光分光光度計(jì)(日本，東京)測(cè)量熒光光譜，記錄2-ap和p-dc的光譜。2-ap和p-dc的激發(fā)波長(zhǎng)分別為310納米和350納米，發(fā)射波長(zhǎng)分別為365納米和450納米。發(fā)射波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度分別用于hogg1和udg的定量分析。

實(shí)施例2：實(shí)際樣品分析

利用人宮頸癌細(xì)胞(hela)進(jìn)行hogg1和udg的檢測(cè)。

1.試驗(yàn)方法：

(1)細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞提取物的制備：將人宮頸癌細(xì)胞系(hela)放入含有10％胎牛血清(fbs)和1％青霉素-鏈霉素的dulbecco改良的eagle培養(yǎng)基(dmem)，在37℃，含5％co2的潮濕氣氛中培養(yǎng)。細(xì)胞數(shù)由countstar細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。使用核提取試劑盒(activemotif)根據(jù)說明書進(jìn)行細(xì)胞提取物的提取。

(2)按實(shí)施例1的方法對(duì)細(xì)胞提取物中的hogg1和udg進(jìn)行檢測(cè)。

2.試驗(yàn)結(jié)果：

對(duì)于hogg1，歸一化的熒光強(qiáng)度隨著hela細(xì)胞數(shù)量增加而增加，在5至10000個(gè)細(xì)胞的范圍內(nèi)呈線性相關(guān)(圖7a)?；貧w方程為f＝0.3803+0.1473log10n，相關(guān)系數(shù)為0.9855，其中f為歸一化熒光強(qiáng)度，n為hela細(xì)胞數(shù)。通過計(jì)算空白信號(hào)加3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差，得出檢測(cè)限為4個(gè)細(xì)胞，與基于單個(gè)量子點(diǎn)的方法相當(dāng)(5個(gè)細(xì)胞)。對(duì)于udg，歸一化熒光強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)在5至10000個(gè)細(xì)胞呈線性相關(guān)(圖7b)?；貧w方程為f＝0.2760+0.1724log10n，相關(guān)系數(shù)為0.9931，其中f為歸一化熒光強(qiáng)度，n為hela細(xì)胞數(shù)。計(jì)算出檢測(cè)限為3個(gè)細(xì)胞，這與酶介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增熒光方法相當(dāng)(3個(gè)細(xì)胞)。此結(jié)果清楚地表明，該方法可用于在實(shí)際樣品中定量檢測(cè)多種dna糖基化酶，具有進(jìn)一步應(yīng)用于臨床診斷的巨大潛力。

實(shí)施例3：dna糖基化酶抑制劑分析

我們選擇5-氟尿嘧啶(5-fu)作為抑制劑進(jìn)行研究。一些化學(xué)藥物如5-fu和慶大霉素可與dna糖基化酶相互作用并影響其活性。其中5-fu是最廣泛用于治療各種腫瘤的化療藥物。

將不同濃度的5-氟尿嘧啶(5-fu)與三明治雜交dna底物在25℃孵育15分鐘，然后加入hogg1和udg，37℃孵育60分鐘。隨后的反應(yīng)過程和熒光測(cè)量遵循上述步驟。根據(jù)公式：

來計(jì)算dna糖基化酶的相對(duì)活性(ra)。其中f0是不存在hogg1或udg的熒光強(qiáng)度，ft是存在32u每毫升hogg1或50u每毫升udg時(shí)的熒光強(qiáng)度，而fi是在hogg1和5-fu存在下或在udg和5-fu存在下的熒光強(qiáng)度。從ra曲線和5-fu濃度可得到ic50值。

我們用ic50值評(píng)估5-fu對(duì)hogg1和udg的抑制作用。ic50值是酶活性降低50％時(shí)所需的抑制劑濃度。如圖8a所示，隨著5-fu濃度的增加，hogg1的相對(duì)活性降低。根據(jù)hogg1相對(duì)活性與5-fu濃度關(guān)系圖，計(jì)算得ic50為4.9667毫摩爾每升。如圖8b所示，udg的相對(duì)活性隨著5-fu濃度的增加而降低。計(jì)算出ic50為4.6304毫摩爾每升，此結(jié)果與基于四倍體的分子信標(biāo)測(cè)定獲得的ic50值(5毫摩爾每升)一致。此結(jié)果清楚地表明本方法可用于篩選hogg1和udg的抑制劑。

以上所述僅為本申請(qǐng)的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本申請(qǐng)，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本申請(qǐng)可以有各種更改和變化。凡在本申請(qǐng)的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本申請(qǐng)的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>山東師范大學(xué)

<120>一種利用固有熒光核苷酸超靈敏同時(shí)檢測(cè)多種dna糖基化酶的方法

<130>2017

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>44

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ttatgcaacggacaacaagttttttttatgccuuacuuagcutc44

<210>2

<211>25

<212>dna

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atcttgttgtccgttgcagtgagtt25

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aaaactcactgcaacggacaacaatccgttgcag34

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