技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，屬于檢測(cè)山羊支原體山羊肺炎亞種的熒光定量pcr試劑盒。

背景技術(shù)：
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山羊支原體山羊肺炎亞種(mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae,mccp)是山羊傳染性胸膜肺炎(contagiouscaprinepleuropneumonia,ccpp)的病原體，同時(shí)也是絲狀支原體簇(mycoplasmamycoidescluster,mmcluster)的主要成員之一。其它絲狀支原體簇成員包括絲狀支原體絲狀亞種小菌落型(mycoplasmamycodiessubsp.mycodiessmallcolony,mmmsc)、絲狀支原體絲狀亞種大菌落型(mycoplasmamycodiessubsp.mycodieslargecolony,mmmlc)、絲狀支原體山羊亞種(mycoplasmamycodiessubspcapri,mmc)、山羊支原體山羊亞種(mycoplasmacapricolumsubsp.capricolum,mcc)和牛群支原體7型(mycoplasmabovinegroup7,mbg7)等。由于這些支原體之間具有非常相似或相近的生化和血清學(xué)特性，使得由山羊支原體山羊肺炎亞種(mccp)引起的山羊傳染性胸膜肺炎(ccpp)的診斷較為困難，容易將ccpp與由其它支原體引起的疾病混淆，或者將由mmc、mmmlc等支原體引起的山羊呼吸道疾病錯(cuò)誤地歸類于ccpp。

目前，對(duì)山羊支原體山羊肺炎亞種的檢測(cè)方法主要是分離培養(yǎng)、血清學(xué)檢測(cè)、常規(guī)pcr檢測(cè)以及利用傳統(tǒng)平板培養(yǎng)相結(jié)合的方法進(jìn)行檢測(cè)。山羊支原體山羊肺炎亞種對(duì)營養(yǎng)要求苛刻、生長(zhǎng)緩慢而且難以分離培養(yǎng)，判斷結(jié)果時(shí)只靠肉眼觀察，沒有足夠的可靠依據(jù)，影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性；血清學(xué)檢測(cè)既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力，而且靈敏度不高；常規(guī)pcr檢測(cè)雖然避免了上述兩類方法的缺陷，但存在引物特異性不高、容易污染和臨床樣品中pcr抑制物存在造成的假陰性等問題，限制了在快速檢測(cè)診斷上的推廣應(yīng)用。

taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法憑借特異性引物和探針，有效地增加了檢測(cè)的特異性和敏感性，同時(shí)大大提高了檢測(cè)速度和檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確率，在病原體檢測(cè)上有廣闊的應(yīng)用前景。目前，國內(nèi)外尚沒有建立一種檢測(cè)山羊支原體山羊肺炎亞種的taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法與試劑盒。2008年，lorenzon等人發(fā)表了一種基于sybrgreen染料的實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法(lorenzon,s.,manso-silvan,l.,thiaucourt,f.,2008,specificreal-timepcrassaysforthedetectionandquantificationofmycoplasmamycoidessubsp.mycoidesscandmycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae.molcellprobes22,324-328.)，但是sybrgreen染料法其本身特異性、敏感性均遠(yuǎn)不及taqman探針方法。因此，本發(fā)明利用taqman探針技術(shù)、通過優(yōu)化設(shè)計(jì)新的引物和探針，建立了一種靈敏度高、特異性強(qiáng)和穩(wěn)定性好的快速檢測(cè)山羊支原體山羊肺炎亞種的實(shí)時(shí)熒光定量pcr試劑盒。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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針對(duì)上述問題，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測(cè)山羊支原體山羊肺炎亞種的熒光定量pcr試劑盒。

本發(fā)明的一種檢測(cè)山羊支原體山羊肺炎亞種的熒光定量pcr試劑盒包含引物和探針，所述的引物為：

mccp-specific-forward：5′-gtagcagctatattcttaatca-3′

mccp-specific-reverse：5′-gctacaaataattcttgcatac-3′

所述探針為：

mccp-specific-probe：5′-f-aagtaataccagcagcaacagcaag-q-3′，其中f為熒光報(bào)告基團(tuán)，q為熒光淬滅基團(tuán)；其中，探針5′端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)fam，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)tamra。

作為優(yōu)選，所述試劑盒還包括premixextaq(probeqpcr)(2×)，roxreferencedyeii(5×)和nuclease-freewater。

作為優(yōu)選，所述試劑盒還包括陽性標(biāo)準(zhǔn)模板，所述陽性標(biāo)準(zhǔn)模板為構(gòu)建的pmd18-t/arcd陽性質(zhì)粒，該質(zhì)粒是引物擴(kuò)增的山羊支原體山羊肺炎亞種arcd基因的部分序列，所述的基因序列為

gtagcagctatattcttaatcagctcaattttattagcaattgttaactctttaggagaagaaaaatttattaaagaatttatggctggtgcttgcgatcttttaggagtatgtttagttgaatattaaaagtaacgcgtatgcaagaattatttgtagc

注：字體加粗且有下劃線的序列為上下游引物，字體加粗且有著重號(hào)的序列為探針反向互補(bǔ)序列。

長(zhǎng)度為185bp，克隆至pmd18-t載體，命名為pmd18-t/arcd。

本發(fā)明中檢測(cè)山羊支原體山羊肺炎亞種的熒光定量pcr試劑盒的使用方法包括以下實(shí)驗(yàn)步驟：

步驟一、提取樣品組織中的總dna；

步驟二、以步驟一中的總dna為模板，mccp-specific-forward和mccp-specific-reverse為引物，mccp-specific-probe為探針，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增反應(yīng)；

步驟三、分析數(shù)據(jù)，包括標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒和模板dna的cq值、拷貝數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)參數(shù)，其中，taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)體系為20μl，各物質(zhì)濃度及用量為premixextaq(probeqpcr)(2×)10μl，mccp-specific-forward(10um)0.4μl，mccp-specific-reverse(10um)0.4μl，probe(0.5um)0.8μl，roxreferencedyeⅱ(5×)0.2μl，ddh2o6.2μl，dnatemplate2μl，其中taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)采用兩步法擴(kuò)增程序：stage1：95℃預(yù)變性30s；stage2：95℃變性10s，60℃退火30s，40個(gè)循環(huán)；

本發(fā)明的有益效果：選取山羊支原體山羊肺炎亞種arcd基因的一段序列，基于該基因序列，設(shè)計(jì)特異性pcr引物和taqman探針，建立了山羊支原體山羊肺炎亞種的taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)試劑盒，此種試劑盒檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性較好，變異系數(shù)均小于1％，因此此種試劑盒檢測(cè)方法穩(wěn)定，數(shù)據(jù)可靠。

附圖標(biāo)記：

圖1為本發(fā)明中檢測(cè)山羊支原體山羊肺炎亞種的熒光定量pcr試劑盒中各物質(zhì)濃度及用量圖；

圖2為實(shí)施例中山羊支原體山羊肺炎亞種taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量pcr重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果圖；

圖3不同稀釋梯度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒(5.96×10⁸拷貝/μl～5.96×10²拷貝/μl)的擴(kuò)增曲線；

圖4不同稀釋梯度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建的山羊支原體山羊肺炎亞種taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量pcr標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖5山羊支原體山羊肺炎亞種taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量pcr靈敏性檢測(cè)結(jié)果圖；

圖6山羊支原體山羊肺炎亞種taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量pcr特異性檢測(cè)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式：

本具體實(shí)施方式采用以下技術(shù)方案和實(shí)施例對(duì)發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)說明。

實(shí)施例：一種檢測(cè)山羊支原體山羊肺炎亞種的實(shí)時(shí)熒光定量pcr試劑盒

1.材料和方法

1.1菌株和部分支原體、細(xì)菌基因組dna

山羊支原體山羊肺炎亞種(mccp)m1601、山羊支原體山羊亞種(mcc)c.kid、絲狀支原體絲狀亞種小菌落型(mmmsc)pg1、絲狀支原體絲狀亞種大菌落型(mmmlc)y98、y-goat、絲狀支原體山羊亞種(mmc)pg3、牛生殖道支原體pg11、豬肺炎支原體mhp、綿羊肺炎支原體mo、牛支原體08m、無乳支原體p2、腐敗支原體、牛沙門氏菌、雞大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，副豬嗜血桿菌hps、鴨疫李默氏桿菌、志賀桿菌等的基因組dna均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供。

1.2主要儀器設(shè)備與試劑

安捷倫mx3000p熒光定量pcr儀、高速離心機(jī)eppendorfcentrifuge5804r、核酸濃度測(cè)定儀nanodrop-2000，細(xì)菌基因組dna提取試劑盒(tianampbacqeriadnakit)購自天根生化科技(北京)有限公司，質(zhì)粒dna提取試劑盒、pmd18-tcloningkit、premixextaq(probeqpcr)(2×)購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3引物、探針的設(shè)計(jì)與合成

從ncbi數(shù)據(jù)庫中獲取山羊支原體山羊肺炎亞種的arcd基因序列(genbank登錄號(hào)：ay529462.1)，應(yīng)用dnaman軟件(version5.2.10,lynnonbiosoft,vaudreuil,canada)分析基因序列，根據(jù)引物和探針設(shè)計(jì)原則，在多態(tài)位點(diǎn)較豐富區(qū)域設(shè)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為185bp的一對(duì)引物，并在該引物的擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)一條熒光探針。引物和探針由寶生物工程(大連)有限公司合成。引物和探針序列分別為：

mccp-specific-forward：5′-gtagcagctatattcttaatca-3′

mccp-specific-reverse：5′-gctacaaataattcttgcatac-3′

mccp-specific-probe：5′-f-aagtaataccagcagcaacagcaag-q-3′

其中，5′端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)fam，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)tamra。

1.4標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建及質(zhì)?？截悢?shù)的計(jì)算

以mccp-specific-forward和mccp-specific-reverse為引物，山羊支原體山羊肺炎亞種的arcd基因?yàn)槟０?，pcr擴(kuò)增得到大小為185bp的目的片段。pcr產(chǎn)物切膠回收純化后連接到pmd18-t載體上，然后將連接產(chǎn)物導(dǎo)入到dh-5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選出陽性克隆子，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后提取質(zhì)粒并測(cè)定濃度。

dna拷貝數(shù)＝質(zhì)粒濃度(ng/μl)×10^-9/(660×標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒堿基數(shù))×阿伏伽德羅常數(shù)。用nanodrop-2000測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度為188.43ng/μl，pmd18-t載體的堿基數(shù)為2692bp，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為185bp，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的堿基數(shù)為2877bp(2692bp+185bp)，每個(gè)堿基的平均分子量為660da，阿伏伽德羅常熟為6.02×10²³copy/mol。根據(jù)前述公式，計(jì)算得出標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度為5.96×10¹⁰拷貝/μl。

1.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用tebuffer將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒依次稀釋成5.96×10⁹拷貝/μl～5.96×10⁰拷貝/μl等10個(gè)梯度，以5.96×10⁸拷貝/μl～5.96×10²拷貝/μl為模板，按照上述pcr反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr。

1.6反應(yīng)體系及反應(yīng)程序

taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)體系為20μl，其中premixextaq(probeqpcr)2×10μl，上、下游引物(10um)各0.4μl，探針(0.5um)0.8μl，roxreferencedyeⅱ5×0.2μl，ddh2o6.2μl，dna模板2μl。

taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)采用兩步法擴(kuò)增程序：stage1:95℃預(yù)變性30s；stage2:95℃變性10s，60℃退火30s，40個(gè)循環(huán)。1.7引物與探針敏感性分析

以10×倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒(5.96×10⁹拷貝/μl～5.96×10⁰拷貝/μl)為模板，引物、探針濃度分別為10μm和0.5μm檢測(cè)本試劑盒的敏感性。

1.8特異性檢測(cè)

以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pmd18-t/arcd為陽性對(duì)照，nuclease-freewater為空白對(duì)照，按上述反應(yīng)體系分別加入山羊支原體山羊肺炎亞種、其它支原體和部分細(xì)菌共18種菌株的基因組dna為模板，檢測(cè)引物和探針的特異性。

1.9重復(fù)性分析

按引物、探針濃度分別為10μm和0.5μm配制熒光定量pcr檢測(cè)反應(yīng)體系，以構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒(5.96×10⁸拷貝/μl～5.96×10³拷貝/μl)為模板進(jìn)行穩(wěn)定性檢測(cè)。在同一次實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)中，每個(gè)稀釋度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒做3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，以分析組內(nèi)差異；用上述相同條件分別進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，分析組間差異，計(jì)算其變異系數(shù)。變異系數(shù)(cv)＝標(biāo)準(zhǔn)偏差(sd)/平均數(shù)(x)。并采用spss19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，方差分析用于比較不同樣本之間的差異，p＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

反應(yīng)結(jié)束后，利用分析軟件自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中圖3為不同濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的擴(kuò)增曲線圖；圖4為不同濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒cq值與其拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)所構(gòu)成的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度與cq值之間呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r²為1.000，擴(kuò)增效率為97.5％。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為：y＝-3.384*log(x)+42.60，其中y為cq值，x為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的拷貝數(shù)。

2.2引物與探針敏感性分析

以10×倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒(5.96×10⁹拷貝/μl～5.96×10⁰拷貝/μl)為模板，引物、探針濃度分別為10μm和0.5μm檢測(cè)其敏感性，最低檢出濃度為5.96×10⁰拷貝/μl，即檢測(cè)靈敏度達(dá)5.96個(gè)拷貝的目的基因，參照?qǐng)D5。

2.3重復(fù)性檢測(cè)

組內(nèi)各孔之間變異系數(shù)在0.17％～0.79％之間，組間重復(fù)測(cè)定變異系數(shù)在0.14％～0.79％之間，均小于1％(圖2)。圖2為山羊支原體山羊肺炎亞種taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量pcr重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果圖；

注：圖中ycq為平均值，se為標(biāo)準(zhǔn)差，cv為變異系數(shù)。

2.4特異性檢測(cè)

以構(gòu)建的重組質(zhì)粒(pmd18-t/arcd)作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，以山羊支原體山羊肺炎亞種和其它支原體及細(xì)菌共18種菌株的基因組dna作為陰性對(duì)照，以nuclease-freewater為空白對(duì)照，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽性對(duì)照(pmd18-t/arcd)和山羊支原體山羊肺炎亞種(m1601株)的基因組dna有明顯的擴(kuò)增信號(hào)(cq值小于22)，檢測(cè)結(jié)果為陽性；其余支原體和細(xì)菌的基因組dna有微弱的擴(kuò)增信號(hào)(cq值均大于31)，檢測(cè)結(jié)果為陰性，空白對(duì)照ntc無擴(kuò)增信號(hào)參照?qǐng)D6。

本發(fā)明選取山羊支原體山羊肺炎亞種arcd基因的一段序列，基于該基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物和taqman探針，建立了山羊支原體山羊肺炎亞種的taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明以構(gòu)建的重組質(zhì)粒(pmd18-t/arcd)為陽性對(duì)照，以山羊支原體山羊肺炎亞種和其它支原體及細(xì)菌共18種菌株的基因組dna作為陰性對(duì)照，以nuclease-freewater為空白對(duì)照，檢測(cè)本試劑盒的特異性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：山羊支原體山羊肺炎亞種(m1601株)呈典型的陽性擴(kuò)增，cq值為21.93；其余支原體和細(xì)菌的cq值均大于31，且空白對(duì)照nuclease-freewater無擴(kuò)增信號(hào)。表明該試劑盒具有較好的特異性，能夠滿足一般臨床樣品的檢測(cè)要求。本發(fā)明以10×倍比稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒(5.96×10⁹拷貝/μl～5.96×10⁰拷貝/μl)為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr，以檢測(cè)本試劑盒的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該試劑盒具有較高的敏感性，檢測(cè)靈敏度達(dá)5.96個(gè)拷貝的目的基因。為了檢測(cè)本試劑盒的穩(wěn)定性，本發(fā)明選擇5.96×10⁸拷貝/μl～5.96×10³拷貝/μl的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，每個(gè)稀釋度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒做3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，同時(shí)用上述相同條件分別進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，分析組內(nèi)差異和組間差異，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性較好，變異系數(shù)均小于1％，表明該試劑盒穩(wěn)定，數(shù)據(jù)可靠。因而，本發(fā)明建立的taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)試劑盒是一種快速、較為準(zhǔn)確的山羊支原體山羊肺炎亞種的檢測(cè)試劑盒。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。