專利名稱:一種快速鑒別和診斷豬偽狂犬病病毒強(qiáng)弱毒的納米pcr檢測試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測豬偽狂犬病病毒強(qiáng)弱毒的PCR檢測試劑盒及其應(yīng)用，特別涉及一種快速鑒別和診斷豬偽狂犬病病毒強(qiáng)弱毒的納米PCR檢測試劑盒及其應(yīng)用，本發(fā)明屬于預(yù)防獸醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
偽狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus, PRV)能引起多種家畜和野生動物以發(fā)熱、奇癢(豬除外)及腦脊髓炎為主要癥狀的疾病。豬是PRV的貯存宿主和傳染源，主要引起妊娠期母豬流產(chǎn)，死產(chǎn)和木乃伊胎；初生仔豬多為急性致死性型，具有明顯的神經(jīng)癥狀，死亡率幾乎為100%;成年豬多呈潛伏感染。豬偽狂犬病幾乎在世界所有主要養(yǎng)豬生產(chǎn)地區(qū)都有發(fā)現(xiàn)。在我國，二十多個省、市、自治區(qū)都有本病的感染，并導(dǎo)致了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于大部分豬場對該病有高度的認(rèn)識，且采取了各種有效的綜合防治措施，使得該病的大面積暴發(fā)流行得到了有效控制。但是，仍然有少部分豬場對該病的危害性認(rèn)識不夠，沒有采取有效的預(yù)防措施，典型豬偽狂犬病仍然可見。2011年開始在我國廣泛發(fā)生、流行的豬偽狂犬病，造成了大批仔豬因拉稀、消瘦、脫水而死亡。
在沒有進(jìn)行過豬偽狂犬病疫苗免疫的豬場，豬偽狂犬病野毒感染后，豬群在臨床上表現(xiàn)典型的豬偽狂犬病癥狀:0-4周齡哺乳仔豬感染后發(fā)病最為嚴(yán)重，為最急性型，表現(xiàn)為體溫升高、水樣腹瀉(黃色稀便)、嘔吐、發(fā)抖、流涎、頸部肌肉僵硬、運(yùn)動不協(xié)調(diào)、四肢劃水樣運(yùn)動，最后昏迷死亡，初生仔豬發(fā)病率和死亡率為100%，4周齡仔豬的死亡率下降到40%-60%;斷奶后仔豬的發(fā)病率和死亡率都比哺乳仔豬低，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為體溫升高、腹瀉和嚴(yán)重的呼吸困難；育肥豬感染后大多數(shù)伴有體溫升高、呼吸困難，一般不發(fā)生死亡，耐過后呈長期隱性感染帶毒或排毒；妊娠母豬感染后表現(xiàn)出嚴(yán)重的繁殖障礙綜合征:母豬群中重新發(fā)情、復(fù)配的比例高，有相當(dāng)一部分母豬發(fā)生流產(chǎn)，部分母豬產(chǎn)死胎或木乃伊胎，或者產(chǎn)出弱仔和死仔。
在進(jìn)行過豬偽狂犬病疫苗免疫的豬場，由于所選擇的疫苗不合適，免疫程序安排不恰當(dāng)，以及其他諸多因素，還有相當(dāng)一部分豬場的豬群在野毒感染后出現(xiàn)零星的豬偽狂犬病病例。哺乳仔豬有零星的病豬出現(xiàn)，經(jīng)?？梢妵?yán)重水樣腹瀉，偶爾可見特征性神經(jīng)癥狀病豬，斷奶前仔豬的死亡率最高可達(dá)15% ;斷奶后仔豬主要表現(xiàn)體溫升高、腹瀉和呼吸困難；育肥豬仍然表現(xiàn)體溫升高、呼吸困難，豬群整齊度比較差；母豬群中有一定比例的母豬重新發(fā)情、復(fù)配，有少數(shù)母豬發(fā)生流產(chǎn)、產(chǎn)死胎或木乃伊胎、或者產(chǎn)出弱仔和死仔。
PRV的抗原檢測方法很多，如病毒分離、熒光定量PCR、膠體金抗原檢測試紙條。但病毒分離耗時費(fèi)力，熒光定量PCR檢測成本高且需要借助一些特殊的試驗(yàn)儀器的輔助才能完成，膠體金抗原檢測試紙條雖然快速但敏感性不高。為此，本發(fā)明運(yùn)用納米PCR技術(shù)，根據(jù)中國境內(nèi)使用的各 種豬用PRV基因工程弱毒疫苗株均缺失gE基因這一特征，成功建立了一種新型的納米PRV強(qiáng)弱毒鑒別診斷試劑盒，為PRV感染的早期快速診斷提供了有力的檢測工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測和鑒別豬偽狂犬病病毒(PRV)弱毒株和野毒株的新型納米PCR檢測試劑盒，以解決使用現(xiàn)有試劑盒進(jìn)行檢測時存在的耗時長、繁瑣等缺點(diǎn)，且克服了因PRV存在潛伏感染性，有時會出現(xiàn)漏檢的問題。
為了達(dá)到以上目的本發(fā)明采用的技術(shù)措施為:
本發(fā)明的一種快速鑒別和診斷豬偽狂犬病病毒(PRV)強(qiáng)弱毒的納米PCR檢測試劑盒，其特征在于其組成成分包括:2XNano PCR緩沖液，DNA聚合酶，引物混合物，無核酸ddH20，其中所述的引物混合物由3對引物組成，第I對引物的序列分別為SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示，第2對引物的序列分別為SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示，第3對引物的序列分別為SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示。
引物的設(shè)計是根據(jù)GenBank上已經(jīng)發(fā)表的PRV參考毒株(GeBank序列號:NC_006151)gB, gE和gG基因的保守區(qū)序列，設(shè)計出納米PCR特異性引物。
在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的引物混合物由3對引物按照等摩爾比組成。
為了達(dá)到更好的檢測效果，所述的納米PCR檢測試劑盒，其特征在于還包括偽狂犬病病毒野毒的陽性對照質(zhì)粒及PRV gE缺失疫苗株陽性對照質(zhì)粒，統(tǒng)稱為模板質(zhì)粒。
優(yōu)選的，所述的偽狂犬病病毒野毒的陽性對照質(zhì)粒為含有PRV gE基因及/或含有PRV gB基因的質(zhì)粒；所述的PRV gE缺失疫苗株陽性對照質(zhì)粒為含有PRV gG基因及/或含有PRV gB基因的質(zhì)粒。
在本發(fā)明的一個具體實(shí)施例中，本發(fā)明首先根據(jù)PRV參考毒株NC0061511株gE基因、gB基因和gG基因的保守區(qū)序列設(shè)計了引物，gE基因保守基因序列為PRV野毒所共有，而gE基因缺失疫苗株則沒有。gB基因以及gG基因?yàn)間E缺失疫苗株與野毒株所共有。
在本發(fā)明的一個具體實(shí)施例中，含有PRV gE基因及含有PRV gB基因的質(zhì)粒為分別為PRV-pMD18-T-gE質(zhì)粒及PRV-pMD18_T-gB質(zhì)粒；所述的PRV gE缺失疫苗株陽性對照質(zhì)粒為PRV-pMD18-T-gG。其中PRV-pMD18_T-gE質(zhì)粒以及PRV-pMD18_T-gG質(zhì)粒按照公開號為CN101831506A，發(fā)明名稱為“鑒別PRV gE缺失疫苗株和野毒株的試劑盒”的專利申請中記載的方法制備。
PRV-pMD18-T_gB質(zhì)粒的構(gòu)建方法如下:首先合成PRV-gB基因的引物，引物序列如下:
PRV-gB-上游:CTACAGGGCGTCGGGGTCC (SEQ ID NO: 7)
PRV-gB-下游:ATGCCCGCTGGTGGCGGTC (SEQ ID NO:8)
以PRV野毒PRV-BJ株(也可以從市場上購買，例如:中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心)DNA為模板，PCR擴(kuò)增目的片段，然后分別膠回收目的片段，克隆到PMD18T載體上，然后轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性菌落，搖菌擴(kuò)增，質(zhì)粒提取試劑盒提取目的質(zhì)粒。構(gòu)建的質(zhì)粒易保存，不具有感染性，無散毒的危險性，可以替代全病毒的DNA作為陽性模板。
在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的納米PCR檢測試劑盒還含有穩(wěn)定劑，更優(yōu)選的，所述的穩(wěn)定劑為二甲基亞砜 (DMSO)。
進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的納米PCR檢測試劑盒在制備鑒別豬偽狂犬病病毒(PRV)野毒株及PRV gE基因缺失疫苗株試劑中的應(yīng)用。及
所述的納米PCR檢測試劑盒在制備診斷豬偽狂犬病病毒(PRV)野毒株及PRVgE基因缺失疫苗株試劑中的應(yīng)用。
優(yōu)選的，本發(fā)明檢測試劑盒的各組成成分的體積及保存條件如下:
權(quán)利要求
1.一種快速鑒別和診斷豬偽狂犬病病毒(PRV)強(qiáng)弱毒的納米PCR檢測試劑盒，其特征在于其組成成分包括:2XNano PCR緩沖液，DNA聚合酶，引物混合物，無核酸ddH20，其中所述的引物混合物由3對引物組成，第I對引物的序列分別為SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，第2對引物的序列分別為SEQ ID N0:3和SEQID NO:4所示，第3對引物的序列分別為 SEQ ID N0:5 和 SEQ ID N0:6 所示。
2.按照權(quán)利要求
1所述的納米PCR檢測試劑盒，其特征在于所述的引物混合物由3對引物按照等摩爾比組成。
3.按照權(quán)利要求
1或2所述的納米PCR檢測試劑盒，其特征在于還包括偽狂犬病病毒野毒的陽性對照質(zhì)粒及PRV gE基因缺失疫苗株陽性對照質(zhì)粒。
4.按照權(quán)利要求
3所述的納米PCR檢測試劑盒，其特征在于所述的偽狂犬病病毒野毒的陽性對照質(zhì)粒為含有PRV gE基因及/或含有PRV gB基因的質(zhì)粒；所述的PRV gE基因缺失疫苗株陽性對照質(zhì)粒為含有PRV gG基因及/或含有PRV gB基因的質(zhì)粒。
5.按照權(quán)利要求
1所述的納米PCR檢測試劑盒，其特征在于還含有穩(wěn)定劑。
6.按照權(quán)利要求
5所述的納米PC R檢測試劑盒，其特征在于所述的穩(wěn)定劑為二甲基亞砜(DMSO)。
7.權(quán)利要求
1-6任一項(xiàng)所述的納米PCR檢測試劑盒在制備鑒別豬偽狂犬病病毒(PRV)野毒株及PRV gE基因缺失疫苗株試劑中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求
1-6任一項(xiàng)所述的納米PCR檢測試劑盒在制備診斷豬偽狂犬病病毒(PRV)野毒株及PRV gE基因缺失疫苗株試劑中的應(yīng)用。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種快速鑒別和診斷豬偽狂犬病病毒強(qiáng)弱毒的納米PCR檢測試劑盒及其應(yīng)用，該試劑盒包括2×Nano PCR緩沖液，Taq DNA聚合酶，引物混合物，DNA聚合酶，無核酸ddH2O。為了達(dá)到更好的檢測效果，本發(fā)明的試劑盒還可以含有模板混合物以及穩(wěn)定劑。本發(fā)明試劑盒解決了使用現(xiàn)有試劑盒檢測耗時長，繁瑣、敏感性低的缺點(diǎn)，提高了敏感性，做到早期快速檢出病毒。本發(fā)明試劑盒具有特異性強(qiáng)、靈敏度高，適于早期快速診斷等特點(diǎn)，并且可以鑒別基因缺失株與野毒株感染。同時，本試劑盒能廣泛應(yīng)于基層獸醫(yī)檢測機(jī)構(gòu)，對規(guī)?；B(yǎng)豬場PRV的檢測、確診及鑒別診斷有重要意義。
文檔編號C12Q1/70GKCN103224995SQ201310123092
公開日2013年7月31日 申請日期2013年4月10日
發(fā)明者崔尚金, 仇錚 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan