專利名稱:一種自誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種自誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
青霉索G酰胺酶(EC3.5.1.11)是半合成β-內(nèi)酰胺類抗生素工業(yè)的重要酶,主要用于水解青霉素或頭孢菌素分別生成母核6-ΑΡΑ (6-氨綦青霉靛酸)或7-ADCA (7-氨基頭孢烷酸)。
此酶屬于水解酶家族，作用于肽鍵以外的碳-氮鍵，特別是在直鏈酰胺鍵。系統(tǒng)的名字是青霉素水解酶，其他共同的使用的名字包括青霉素酰化酶，脂肪酶Novozym217，α-?；?β-內(nèi)酰胺水解酶，氨芐青霉素?；浮Ｄ壳霸撁敢汛笠?guī)模應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)內(nèi)酰胺類抗生素的關(guān)鍵中間體和半合成內(nèi)酰胺類抗生素。
在基因工程菌中表達(dá)青霉素酰胺酶時，常選用基于強(qiáng)啟動子Τ7的表達(dá)系統(tǒng)。這類表達(dá)系統(tǒng)中，T7RNA聚合酶能特異識別Τ7啟動子，從而開啟下游基因的大量轉(zhuǎn)錄，有效地啟動目的蛋白的表達(dá)。
但是基于Τ7啟動子的表達(dá)系統(tǒng)也有其不足之處。蛋白的表達(dá)需要用IPTG誘導(dǎo)，步驟比較繁瑣。而且，一定濃度的IPTG會對細(xì)菌產(chǎn)生毒性，直接影響蛋白的表達(dá)效率。另夕卜，由于lac mRNA本底水平的組成型合成，可導(dǎo)致目的蛋白的少量表達(dá)。研究表明，非目的性表達(dá)出的目的蛋白可能會導(dǎo)致目的蛋白的不穩(wěn)定、甚至不表達(dá)。此外，目前培養(yǎng)大腸桿菌一般使用LB培養(yǎng)基，其組分之一是胰蛋白胨，由于胰蛋白胨是使用胰酶消化酪蛋白后的產(chǎn)物，而酪蛋白一般是從牛奶或大豆中提取的，因此，胰蛋白胨中存在的微量乳糖成分會促進(jìn)細(xì)菌產(chǎn)生非目的性表達(dá)，從而影響表達(dá)量。
利用自誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌使之表達(dá)外源蛋白的方法解決了上述技術(shù)問題。公開號為CN101235362B的中國專利文獻(xiàn)公開了一種用于原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白的復(fù)合自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基中含有以下重量的各組分:胰蛋白胨10 40g，酵母提取物5 20g,六水琥拍酸鈉O 8.1g, 二水朽1檬酸鈉O 1.5g,甘油15 50g,葡萄糖0.5g,乳糖2g，磷酸二氫鈉3.55g，磷酸二氫鉀3.40g，氯化銨2.68g，硫酸鈉0.71g，七水硫酸鎂0.50g，六水氯化鐵0.03go
在培養(yǎng)基中同時加入葡萄糖和乳糖，大腸桿菌會優(yōu)先利用葡萄糖，在葡萄糖耗盡前不會誘發(fā)Iac啟動子；當(dāng)葡萄糖耗盡時，乳糖發(fā)揮作用，開啟Iac啟動子誘導(dǎo)外源蛋白表達(dá)，而乳糖的代謝產(chǎn)物也同時作為細(xì)菌生長的碳源。自誘導(dǎo)的方法省去了監(jiān)測培養(yǎng)基的菌密度和添加IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的步驟，一方面使得實驗操作更加簡潔，另一方面避免了IPTG對細(xì)菌的毒害作用。
但現(xiàn)有的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方仍可繼續(xù)完善，以提高目的蛋白的表達(dá)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種用于原核表達(dá)系統(tǒng)的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基能高效誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白。
一種用于原核表達(dá)系統(tǒng)的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基，配方為:阿拉伯糖2 10g/L，葡萄糖
0.5 2.5g/L，甘油5 25g/L，蛋白胨8 12g/L，磷酸鹽6.5 7.4g/L，硫酸鹽1.1
1.3g/L，NH4Cl2.6 2.7g/L，痕量元素溶液適量。
更優(yōu)選地,配方為:阿拉伯糖2 5g/L,葡萄糖0.5 lg/L,甘油5 15g/L,蛋白胨9 118/1，磷酸鹽6.7 7.lg/L，硫酸鹽 1.15 1.25g/L，NH4C12.65 2.7g/L，痕量元
素溶液適量。
所述自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加有磷酸鹽，用于保持自誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH，避免pH太低影響細(xì)胞生長。所述磷酸鹽優(yōu)選為KH2PO4和Na2HPO4中的至少一種。當(dāng)同時選用KH2PO4和Na2HPO4時，KH2PO4的添加量優(yōu)選為3.3 3.5g/L，Na2HPO4的添加量優(yōu)選為3.4 3.6g/L。
所述硫酸鹽優(yōu)選為MgSO4和Na2SO4中的至少一種。當(dāng)同時選用MgSO4和Na2SO4時，MgSO4的添加量優(yōu)選為0.45 0.50g/L, Na2SO4的添加量優(yōu)選為0.70 0.75g/L。
痕量元素溶液給菌株生長提供微量元素,促進(jìn)其生長,優(yōu)選的,所述痕量元素溶液為 195 205 μ L/L,包含 48 52 μ M 的 Fe3+，8 12 μ M 的 Mn2+、Zn2+，1.8 2.2 μ M 的 Co2+、Cu2+、Ni2+、Mo7O242' SeO32' B4O廣。
本發(fā)明還提供了所述自誘導(dǎo)培養(yǎng)基在生產(chǎn)青霉素酰胺酶中的應(yīng)用，具體包括:
將含青霉素酰胺酶基因的原核表達(dá)菌株接種到所述自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，發(fā)酵，提取青霉素酰胺酶。
所述的原核表達(dá)菌株包含有T7/lac啟動子。
當(dāng)將該原核表達(dá)菌株置于本發(fā)明的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，葡萄糖促使細(xì)胞的高密度生長，在葡萄糖耗盡前不會誘發(fā)啟動子，有效阻止泄漏表達(dá)；當(dāng)葡萄糖被利用完全、細(xì)胞密度達(dá)到飽和時，啟動子可打開，并開啟下游基因的大量轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)；甘油作為誘導(dǎo)后期良好的碳源，促進(jìn)細(xì)胞生長，增加蛋白表達(dá)量。
原核表達(dá)菌株在表達(dá)青霉素酰胺酶的過程中，要對前體蛋白進(jìn)行翻譯后修飾。與乳糖相比，阿拉伯糖的誘導(dǎo)能力相對較弱，能夠避免前體蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的過度積累，給翻譯后修飾過程以充足的時間，從而減少包涵體的形成，最終提高青霉素酰胺酶的表達(dá)量。
所述原核表達(dá)菌株的宿主細(xì)胞優(yōu)選為大腸桿菌(E.coli)，大腸桿菌是表達(dá)外源蛋白的常用工程菌，適于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。
為使誘導(dǎo)初期菌株的生長狀態(tài)達(dá)到最佳，接種前，需先對菌株進(jìn)行活化，取對數(shù)生長期的菌株進(jìn)行接種，接種量優(yōu)選為0.1% 5%，更優(yōu)選為1%。發(fā)酵溫度為25 27°C，發(fā)酵時間為48 72小時，轉(zhuǎn)速為180 220r/min。
發(fā)酵完成后，收集菌體，于預(yù)冷的無菌水中重懸浮后采用超聲波、高壓或凍融等方法破碎細(xì)胞，離心收集上清液即為初酶液。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:
本發(fā)明的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基利用阿拉伯糖作為底物誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，可調(diào)控性強(qiáng)，蛋白表達(dá)量高；在一個具體實施方式
中，青霉素酰胺酶酶活達(dá)6U/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于使用乳糖誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)量，對開發(fā)生產(chǎn)青霉素酰胺酶的新工藝具有重要的指導(dǎo)意義。
具體實施方式
[0025]下面以含青霉素酰胺酶編碼基因和T7/lac啟動子的重組大腸桿菌(以下簡稱重組大腸桿菌)為例，詳細(xì)說明本發(fā)明自誘導(dǎo)培養(yǎng)基在生產(chǎn)青霉素酰胺酶中的應(yīng)用。
重組大腸桿菌的構(gòu)建方法與文獻(xiàn)(Expressionand purification of penicillinG acylase enzymes from four different micro-organisms, and a comparativeevaluation of their synthesis/hydrolysis ratios for cephalexin.ProteinExpression and Purifi cation.2006，46 (I) 107實施例1LB培養(yǎng)基IPTG誘導(dǎo)
(I)LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L，NaC110g/L,超純水配制，ρΗ7.0 ；
(2)挑取重組大腸桿菌，按1:100的比例接種于5mL含卡那霉素(50μ g/mL)LB液體培養(yǎng)基中，于37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜；
(3)取0.5mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于50mL含氨芐青霉素(50 μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C、200rpm振蕩培養(yǎng)2 4小時，至0D600約為0.6 ；
(4)向培養(yǎng)物中加入誘導(dǎo)物IPTG至終濃度0.lmmol/L,20 30°C下誘導(dǎo)培養(yǎng)12小時；
(5)將發(fā)酵液于IOOOOrpm離心lOmin，收集菌體細(xì)胞，將菌體細(xì)胞重懸浮于預(yù)冷的磷酸緩沖液中進(jìn)行超聲破碎，離心收集上清液，檢測酶活。
具體步驟為:
取上清液20 μ L加入980μ L50mmol/L的磷酸緩沖液(pH7.5)中，37°C保溫；再加入ImL已在37°C下預(yù)熱的0.9mg/mL NIPAB溶液，精確反應(yīng)4min，加入ImL乙醇終止反應(yīng)；取反應(yīng)液在分光光度計下 波長檢測405nm處的吸光值。
酶活力定義:在上述反應(yīng)條件下，Imin水解I μ mo I的NIPAB所需要青霉素酰胺酶的量為I個酶活力單位U。
酶活力計算公式如下:
酶活力(U/mL)=103*A405*V0/t/p/Vl ；
其中:
t:反應(yīng)時間(min) ；p:標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；V0:反應(yīng)體系總體積；A405:樣品光密度讀數(shù)與空白樣品光密度讀數(shù)差；V1:酶液體積(mL);比色皿厚度默認(rèn)為1，單位為Cm。
利用LB培養(yǎng)基和IPTG誘導(dǎo)方式，獲得發(fā)酵液的青霉素酰胺酶酶活力為0.5U/mL。
實施例2乳糖自誘導(dǎo)
(I)自誘導(dǎo)培養(yǎng)基:α -乳糖 2g/L,葡萄糖 0.5g/L,甘油 5g/L, KH2P043.4g/L,MgSO40.49g/L，蛋白胨 10g/L，Na2HP043.55g/L，Na2SO40.71g/L，NH4Cl2.67g/L，痕量元素溶液200 μ L/L，用超純水配制；
其中，痕量元素溶液為:50μ M FeC13,20yM CaCl2.2Η20，10 μ MMnCl2.4Η20，10 μ MZnSO4.7Η20, 2 μ M CoCl2.6Η20, 2 μ M CuCl2, 2 μ MNiCl2, 2 μ M Na2Mo7O24, 2 μ M Na2SeO3, 2 μ MH3B4O7,用超純水配制；
(2)將重組大腸桿菌接種于裝有5mL含卡那霉素(50 μ g/mL)的LB培養(yǎng)基中，置于37°C、200rpm搖床中震蕩培養(yǎng)，至0D600達(dá)到2.0 3.0左右；
(3)將(2)中的種子培養(yǎng)液以1%的接種量接種于裝有50mL自誘導(dǎo)培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于25°C培養(yǎng)40小時；
(4)采用實施例1步驟(5)的方法獲取發(fā)酵液并檢測酶活。青霉素酰胺酶酶活達(dá)到 2.955U/mL。
實施例3乳糖、阿拉伯糖共同自誘導(dǎo)
(I)自誘導(dǎo)培養(yǎng)基:α-乳糖2g/L，葡萄糖0.5g/L，甘油5g/L，阿拉伯糖2g/L，ΚΗ2Ρ043.4g/L, MgSO40.49g/L，蛋白胨 10g/L，Na2HP043.55g/L，Na2SO40.71g/L, NH4C12.67g/L,痕量元素溶液200 μ L/L，用超純水配制；
痕量元素溶液組成如實施例2步驟(I)所示；
(2)將重組大腸桿菌接種于裝有5mL含卡那霉素(50 μ g/mL)的LB培養(yǎng)基中，置于37°C、200rpm搖床中震蕩培養(yǎng)，至0D600達(dá)到2.0 3.0左右；
(3)將此種子培養(yǎng)液以1%的接種量接種于裝有50mL步驟(I)的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于25°C培養(yǎng)40小時；
(4)采用實施例1步驟(5)的方法獲取發(fā)酵液并檢測酶活。青霉素酰胺酶酶活達(dá)到 3.375U/mL。
實施例4乳糖、阿拉伯糖共同自誘導(dǎo)，無蛋白胨
(I)自誘導(dǎo)培養(yǎng)基:α -乳糖2g/L,葡萄糖0.5g/L,甘油5g/L,阿拉伯糖2g/L,KH2P043.4g/L，MgSO40.49g/L，Na2HP043.55g/L，Na2SO40.71g/L，NH4Cl2.67g/L，痕量元素溶液200 μ L/L，用超純 水配制；
痕量元素溶液組成如實施例2步驟(I)所示；
(2)將重組大腸桿菌接種于裝有5mL含卡那霉素(50 μ g/mL)的LB培養(yǎng)基中，置于37°C、200rpm搖床中震蕩培養(yǎng)，至0D600達(dá)到2.0 3.0左右；
(3)將此種子培養(yǎng)液以1%的接種量接種于裝有50mL步驟(I)的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于25°C培養(yǎng)40小時；
(4)采用實施例1步驟(5)的方法獲取發(fā)酵液并檢測酶活。青霉素酰胺酶酶活達(dá)到 2.955U/mL。
實施例5阿拉伯糖自誘導(dǎo)
(I)自誘導(dǎo)培養(yǎng)基:葡萄糖lg/L，甘油15g/L，阿拉伯糖5g/L，KH2P043.5g/L，MgSO40.5g/L，蛋白胨 llg/L，Na2HP043.6g/L，Na2SO40.75g/L，NH4Cl2.7g/L，痕量元素溶液195 μ L/L，用超純水配制；
痕量元素溶液組成如實施例2步驟(I)所示；
(2)將重組大腸桿菌接種于裝有5mL含卡那霉素(50 μ g/mL)的LB培養(yǎng)基中，置于37°C、200rpm搖床中震蕩培養(yǎng)，至0D600達(dá)到2.0 3.0左右；
(3)將此種子培養(yǎng)液以1%的接種量接種于裝有50mL步驟(I)的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于25°C培養(yǎng)40小時；
(4)采用實施例1步驟(5)的方法獲取發(fā)酵液并檢測酶活。青霉素酰胺酶酶活達(dá)到 3.735U/mL。
實施例6阿拉伯糖自誘導(dǎo)500mL發(fā)酵
(I)自誘導(dǎo)培養(yǎng)基:葡萄糖0.8g/L,甘油10g/L,阿拉伯糖3g/L, KH2P043.3g/L,MgSO40.45g/L，蛋白胨 9g/L，Na2HP043.4g/L，Na2SO40.70g/L，NH4Cl2.65g/L，痕量元素溶液200 μ L/L，用超純水配制；
痕量元素溶液組成如實施例2步驟(I)所示；
(2)將重組大腸桿菌接種于裝有5mL含卡那霉素(50 μ g/mL)的LB培養(yǎng)基中，置于37°C、200rpm搖床中震蕩培養(yǎng)，至0D600達(dá)到2.0 3.0左右；
(3)將此種子培養(yǎng)液以1%的接種量接種于裝有500mL步驟(I)的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基的2L三角瓶中，于25°C培養(yǎng)60小時；
(4)采用實施例1步驟(5)的方法獲取發(fā)酵液并檢測酶活。青霉素酰胺酶酶活達(dá)到 5.250U/mL。
實施例7阿拉伯糖自誘導(dǎo)3.5L發(fā)酵
(I)自誘導(dǎo)培養(yǎng)基:葡萄糖0.5g/L，甘油5g/L，阿拉伯糖2g/L，KH2P043.4g/L，MgSO40.49g/L，蛋白胨 10g/L，Na2HP043.55g/L，Na2SO40.71g/L，NH4Cl2.67g/L，痕量元素溶液205 μ L/L，用超純水配制；
痕量元素溶液組成如實施例2步驟(I)所示；
(2)將重組大腸桿菌接種于裝有5mL含卡那霉素(50 μ g/mL)的LB培養(yǎng)基中，置于37°C、200rpm搖床中震蕩培養(yǎng)，至0D600達(dá)到2.0 3.0左右；
(3)將此種子培養(yǎng)液以0.1%的接種量接種于裝有3.5L步驟(I)的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基的5L三角瓶中，于25°C培養(yǎng)72小時；
(4)采用實施例1步驟(5)的方法獲取發(fā)酵液并檢測酶活。青霉素酰胺酶酶活達(dá)到 6.0U/mL。
表I不同誘導(dǎo)物存在下青霉素酰胺酶的表達(dá)量
權(quán)利要求
1.一種自誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于，配方為:阿拉伯糖2 10g/L,葡萄糖0.5 2.5g/L，甘油5 25g/L，蛋白胨8 12g/L，磷酸鹽6.5 7.4g/L，硫酸鹽1.1 1.3g/L，NH4Cl2.6 2.7g/L，痕量元素溶液適量。
2.如權(quán)利要求
1所述的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于，配方為:阿拉伯糖2 5g/L，葡萄糖0.5 lg/L,甘油5 15g/L,蛋白胨9 llg/L,磷酸鹽6.7 7.lg/L,硫酸鹽1.15 1.25g/L，NH4Cl2.65 2.7g/L，痕量元素溶液適量。
3.如權(quán)利要求
2所述的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于，所述磷酸鹽為KH2PO4和Na2HPO4中的至少一種。
4.如權(quán)利要求
2所述的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于，所述硫酸鹽為MgSO4和Na2SO4中的至少一種。
5.如權(quán)利要求
1所述的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于，所述痕量元素溶液為195 205 μ L/L,包含 48 52 μ M 的 Fe3+，8 12 μ M 的 Mn2+、Zn2+，L 8 2.2 μ M 的 Co2+、Cu2+、Ni2+、Mo7O242、SeO32、B4O73。
6.如權(quán)利要求
1 5任一所述的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基在生產(chǎn)青霉素酰胺酶中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求
6所述的應(yīng)用，其特征在于，包括:將含青霉素酰胺酶基因的原核表達(dá)菌株接種到如權(quán)利要求
1 5任一所述的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，發(fā)酵，提取青霉素酰胺酶。
8.如權(quán)利要求
7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述原核表達(dá)菌株包含有T7/lac啟動子。
9.如權(quán)利要求
7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述原核表達(dá)菌株的接種量為0.1% 5%。
10.如權(quán)利要求
7所述的應(yīng)用，其特征在于，發(fā)酵溫度為25 27°C，發(fā)酵時間為48 72小時。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種自誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其應(yīng)用。所述自誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為阿拉伯糖2～10g/L，葡萄糖0.5～2.5g/L，甘油5～25g/L，蛋白胨8～12g/L，磷酸鹽6.5～7.4g/L，硫酸鹽1.1～1.3g/L，NH4Cl2.6～2.7g/L，痕量元素溶液適量。所述應(yīng)用為該自誘導(dǎo)培養(yǎng)基在生產(chǎn)青霉素酰胺酶中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基利用阿拉伯糖作為底物誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，可調(diào)控性強(qiáng)，蛋白表達(dá)量高；在一個具體實施方式
中，青霉素酰胺酶酶活達(dá)6U/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于使用乳糖誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)量，對開發(fā)生產(chǎn)青霉素酰胺酶的新工藝具有重要的指導(dǎo)意義。
文檔編號C12R1/19GKCN103146669SQ201310074573
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月8日
發(fā)明者陳振明, 周碩, 賴敦岳, 李蘭杰, 陳亮 申請人:浙江普洛得邦制藥有限公司, 杭州師范大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan