配合淋巴細胞培養(yǎng)基快速誘導大量dc-cik、nk細胞的試劑盒及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種配合淋巴細胞培養(yǎng)基快速誘導大量DC?CIK、NK細胞的試劑盒及其使用方法，包括DC套盒：10ug干粉DC?A、5ug干粉DC?B；CIK套盒：6支干粉CIK?A(30ug/支)、10ug干粉CIK?B、20ug干粉CIK?C；NK套盒：5支干粉NK?A(50ug/支)、10ug干粉NK?B、5ug干粉NK?C。本發(fā)明利用DC?CIK、NK細胞誘導試劑盒能夠配合淋巴細胞培養(yǎng)基在最短的時間內誘導擴增出5*109以上的淋巴細胞，其中CIK細胞(CD3+CD56+)比例達到25％以上，NK細胞(CD3?CD56+)比例達到50％以上。為體外大規(guī)模擴增DC?CIK、NK細胞提供便利的方法，為相關研究及臨床實驗提供便利。
【專利說明】
配合淋巴細胞培養(yǎng)基快速誘導大量DC-CIK、NK細胞的試劑盒及其使用方法
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及一種誘導DC-CIK、NK細胞的試劑盒及其使用方法，尤其是一種配合淋巴細胞培養(yǎng)基快速誘導大量DC-CIK、NK細胞的試劑盒及其使用方法。
【背景技術】
[0002]當前免疫細胞因其高效的腫瘤細胞殺傷活性，其無任何副作用的優(yōu)勢已經逐漸被醫(yī)學界認可。DC-CIK、NK(Cytokine induced killer)細胞作為免疫細胞中最具代表性的兩種細胞，其誘導和擴增的方法各不相同，且誘導出的細胞數量和質量也參差不齊。沒有一套簡單、高效、穩(wěn)定的誘導試劑盒。

【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術問題是，提供一套簡單、高效、穩(wěn)定的配合淋巴細胞培養(yǎng)基快速誘導大量DC-CIK、NK細胞的試劑盒及其使用方法。
[0004]為了解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案是:一種配合淋巴細胞培養(yǎng)基快速誘導大量DC-CIK、NK細胞的試劑盒，包括DC套盒:1ug干粉DC-A、5ug干粉DC-B; CIK套盒:6支干粉CIK-A(30ug/支)、1ug干粉CIK-B、20ug干粉CIK-C; NK套盒:5支干粉NK-A(50ug/支)、1ug干粉NK-B、5ug干粉NK-C，按質量百分比，各種組分的成分如下:
[0005]DC 套盒:
[0006]干粉DC-A: 30 %-50 %白細胞介素_4(4000IU/ug)、50 % -70 %粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(25000IU/ug);
[0007]干粉DC-B:100 % 腫瘤壞死因子-α (16000IU/ug)；
[0008]CIK 套盒:
[0009]干粉CIK-A:60%-75% 白細胞介素_2(15000IU/ug)、25%-40%氨基酸；
[0010]干粉CIK-B:60%-80%CD3單抗、20%-40%干擾素-伽馬(28000IU/ug)；
[0011 ]干粉 CIK-C: 20 % -30 % CD3 單抗、70 % -80 % CD28 單抗；
[0012]NK 套盒:
[0013]干粉爾4:30%-40%白細胞介素-2(1500011]/叫)、20%-30%白細胞介素-12(7000IU/ug)、30%-50% 白細胞介素-15(7000IU/ug)；
[0014]干粉NK-B:70%-80%CD16單抗、20%-30%干擾素-伽馬(40000IU/ug)；
[0015]干粉NK-C:100%CD16 單抗。
[0016]優(yōu)選，按質量百分比，DC套盒:干粉DC-A:40%白細胞介素_4(IL-4)、60%粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF);干粉DC-B:100%腫瘤壞死因子-a(TNF_a);CIK套盒:干粉CIK-A: 70 %白細胞介素-2、30 %氨基酸;干粉CIK-B: 70 % CD3單抗、30 %干擾素-伽馬(IFN-γ );干粉CIK-C: 25 %CD3單抗、75 %CD28單抗;NK套盒:干粉NK-A: 40 %白細胞介素-2、30 %白細胞介素-12(IL-12)、30%白細胞介素-15(IL-15);干粉NK-B:70%CD16單抗、30%干擾素-伽馬(IFN- γ );干粉 NK-C:100% CD 16 單抗。
[0017]上述的配合淋巴細胞培養(yǎng)基快速誘導出大量DC_CIK、NK細胞的試劑盒的使用方法，包括以下步驟:
[0018](I)配置細胞誘導培養(yǎng)基備用
[0019]DC細胞誘導培養(yǎng)基:150ml淋巴細胞培養(yǎng)基中添加干粉DC-A;
[0020]CIK細胞誘導培養(yǎng)基:每500ml淋巴細胞培養(yǎng)基中添加I支干粉CIK-A;
[0021]NK細胞誘導培養(yǎng)基:每500ml淋巴細胞培養(yǎng)基中添加I支干粉NK-A;
[0022](2)使用6毫升淋巴細胞培養(yǎng)基充分溶解試劑盒中的干粉CIK-B，并利用0.22微米孔徑的濾膜過濾溶液，在I個T-17 5培養(yǎng)瓶中分別加入5毫升過濾后的溶液，在CO2培養(yǎng)箱中孵育2小時;再使用6毫升淋巴細胞培養(yǎng)基充分溶解試劑盒中的干粉NK-B，并利用0.22微米孔徑的濾膜過濾溶液，在I個T-17 5培養(yǎng)瓶中分別加入5毫升過濾后的溶液，在CO2培養(yǎng)箱中孵育2小時；
[0023](3)分離獲得的PBMC取(5-10)*107個細胞接種至一個T-175細胞培養(yǎng)瓶中，加入50ml淋巴細胞培養(yǎng)基孵育l-2h后將未貼壁的細胞吸出，貼壁的細胞中加入50ml DC細胞誘導培養(yǎng)基，誘導DC細胞；
[0024](4)將步驟(3)中的未貼壁的細胞加入到未使用的I3BMC中，按照細胞數量比1:1的比例將所有細胞平均加入到分別提前2小時CIK-B預包被T-175細胞培養(yǎng)瓶，以及NK-B預包被的T-175細胞培養(yǎng)瓶中；在預包被CIK-B的培養(yǎng)瓶中加入70ml CIK細胞誘導培養(yǎng)基誘導CIK細胞;在預包被NK-B的培養(yǎng)瓶中加入70ml NK細胞誘導培養(yǎng)基以及終濃度誘導NK細胞；將細胞培養(yǎng)液混合均勻后放置在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0025](5)培養(yǎng)的第3天，用5ml淋巴細胞培養(yǎng)基溶解I支CIK-A，并取出
[0026]Iml補加到CIK細胞誘導體系中繼續(xù)培養(yǎng)，其余4ml廢棄；
[0027](6)培養(yǎng)的第4天，在DC細胞誘導體系中加入50ml DC細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勻后培養(yǎng);同時NK細胞誘導體系中加入100ml NK細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng)；
[0028](7)培養(yǎng)第5天，在CIK細胞誘導體系中加入10mlCIK細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng)；
[0029](8)培養(yǎng)第6天，在DC細胞誘導體系中加入用500ul淋巴細胞培養(yǎng)基溶解的干粉DC-B，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng)；
[0030](9)第7天，將CIK細胞誘導體系中的全部細胞懸液轉移到一個1.8升容量的細胞培養(yǎng)袋中并在培養(yǎng)體系中，補加200ml CIK細胞誘導培養(yǎng)基;與此同時將誘導DC細胞誘導體系中的細胞全部收獲后加入到上述細胞培養(yǎng)袋中與CIK細胞共培養(yǎng)，并且補加用500ul淋巴細胞培養(yǎng)基溶解的干粉CIK-C;同時，將NK細胞誘導體系中的細胞懸液加入到另一個1.8升容量細胞培養(yǎng)袋中，在培養(yǎng)體系中加入400ml的NK細胞誘導培養(yǎng)，并補加用500ul淋巴細胞培養(yǎng)基溶解的干粉NK-C，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng)；
[0031](10)培養(yǎng)的第9天，在DC-CIK細胞的培養(yǎng)袋中加入400mlCIK細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng)；
[0032](I I)培養(yǎng)的第11天，在DC-CIK細胞共培養(yǎng)的培養(yǎng)袋中加入800ml CIK細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng);與此同時在NK細胞的培養(yǎng)袋中加入100ml的NK細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勾后繼續(xù)培養(yǎng)；
[0033](12)培養(yǎng)的第14天，在DC-CIK細胞培養(yǎng)體系中取出800-1000ml的DC-CIK細胞懸液收獲細胞，并加入600ml的CIK細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng);與此同時在NK細胞培養(yǎng)體系中取出800-1000ml的NK細胞懸液收獲細胞，加入600ml的NK細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng)并離心并回收細胞。
[0034](13)第17天，將DC-CIK細胞共培養(yǎng)的培養(yǎng)袋及NK細胞的培養(yǎng)袋中的所有細胞收獲，離心并回收細胞，計算細胞總數并通過流式細胞檢測方法確定其中CIK細胞的比例和NK細胞的比例。
[0035]所述步驟(13)中，所述CIK細胞(CD3+CD56+)的比例達到25%以上，NK細胞(CD3—⑶56+)比例達到50%以上。
[0036]本發(fā)明的有益效果是:配合多種細胞因子及聯合培養(yǎng)技術對DC、CIK及NK分別進行誘導培養(yǎng)，并在一定時間點能夠穩(wěn)定的獲得一定數量和質量的CIK細胞，細胞總量在5*109以上的淋巴細胞，其中CIK細胞(CD3+CD56+)比例達到25%以上，NK細胞(CD3—CD56+)比例達到50%以上。
【附圖說明】
[0037]圖1培養(yǎng)第7天的CIK、NK、DC細胞圖。
[0038]圖2培養(yǎng)第7天的DC細胞的流式檢測結果圖(成熟DC細胞的表面標志物CD1A、CD83、CD86的陽性率分別為75 %、79 %、89 % )。
[0039]圖3誘導第17天CIK及NK細胞誘導結果圖(在各自的培養(yǎng)體系中CIK細胞的比例為26.8% ;NK細胞的比例為52.2%，左圖為CIK細胞流式檢測結果，右圖為NK細胞流式檢測結果)。
【具體實施方式】
[0040]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細說明:
[0041 ]本發(fā)明的配合淋巴細胞培養(yǎng)基快速誘導大量DC-CIK、NK細胞的試劑盒，包括DC套盒:10ug 干粉 DC-A、5ug 干粉 DC-B;CIK 套盒:6 支干粉 CIK-A(30ug/支)、10ug 干粉 CIK-B、20ug干粉CIK-C; NK套盒:5支干粉NK-A(50ug/支)、1ug干粉NK-B、5ug干粉NK-C，按質量百分比，各種組分的成分如下:
[0042]DC 套盒:
[0043]干粉DC-A:30%-50%白細胞介素-4(4000IU/ug)、50%-70%粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(25000IU/ug);
[0044]干粉DC-B:100 % 腫瘤壞死因子-α (16000IU/ug)；
[0045]CIK 套盒:
[0046]干粉CIK-A:60%-75% 白細胞介素_2(15000IU/ug)、25%-40%氨基酸；
[0047]干粉CIK-B:60%-80%CD3單抗、20%-40%干擾素-伽馬(28000IU/ug)；
[0048]干粉CIK-C: 20 % -30 % CD3 單抗、70 % -80 % CD28 單抗；
[0049]NK 套盒:
[0050]干粉NK-A:30%-40%白細胞介素-2(15000IU/ug)、20%-30% 白細胞介素-12(7000IU/ug)、30%-50% 白細胞介素-15(7000IU/ug)；[0051 ]干粉NK-B:70%-80%CD16單抗、20%-30%干擾素-伽馬(40000IU/ug)；
[0052]干粉NK-C:100%CD16 單抗。
[0053]優(yōu)選，按質量百分比，DC套盒:DC套盒:干粉DC-A:40 %白細胞介素_4(IL-4)、60 %粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF);干粉DC-B: 100%腫瘤壞死因子-a(TNF-a) ;CIK套盒:干粉CIK-A: 70 %白細胞介素-2、30 %氨基酸;干粉CIK-B: 70 %⑶3單抗、30 %干擾素-伽馬(IFN- γ )；干粉CIK-C: 25 % CD3單抗、75 % CD28單抗;NK套盒:干粉NK-A: 40 %白細胞介素-
2、30% 白細胞介素-12(IL-12)、30% 白細胞介素-15(IL-15);干粉NK-B:70%CD16單抗、30%干擾素-伽馬(IFN-γ );干粉NK-C: 100%CD16單抗。
[0054]上述的配合淋巴細胞培養(yǎng)基快速誘導出大量DC_CIK、NK細胞的試劑盒的使用方法，包括以下步驟:
[0055](I)配置細胞誘導培養(yǎng)基備用
[0056]DC細胞誘導培養(yǎng)基:150ml淋巴細胞培養(yǎng)基中添加干粉DC-A;
[0057]CIK細胞誘導培養(yǎng)基:每500ml淋巴細胞培養(yǎng)基中添加I支干粉CIK-A;
[0058]NK細胞誘導培養(yǎng)基:每500ml淋巴細胞培養(yǎng)基中添加I支干粉NK-A;
[0059](2)使用6毫升淋巴細胞培養(yǎng)基充分溶解試劑盒中的干粉CIK-B，并利用0.22微米孔徑的濾膜過濾溶液，在I個T-17 5培養(yǎng)瓶中分別加入5毫升過濾后的溶液，在CO2培養(yǎng)箱中孵育2小時;再使用6毫升淋巴細胞培養(yǎng)基充分溶解試劑盒中的干粉NK-B，并利用0.22微米孔徑的濾膜過濾溶液，在I個T-17 5培養(yǎng)瓶中分別加入5毫升過濾后的溶液，在CO2培養(yǎng)箱中孵育2小時；
[0060](3)分離獲得的PBMC取(5-10)*107個細胞接種至一個T-175細胞培養(yǎng)瓶中，加入50ml淋巴細胞培養(yǎng)基孵育l-2h后將未貼壁的細胞吸出，貼壁的細胞中加入50ml DC細胞誘導培養(yǎng)基，誘導DC細胞；
[0061 ] (4)將步驟(3)中的未貼壁的細胞加入到未使用的I3BMC中，按照細胞數量比1:1的比例將所有細胞平均加入到分別提前2小時CIK-B預包被T-175細胞培養(yǎng)瓶，以及NK-B預包被的T-175細胞培養(yǎng)瓶中；在預包被CIK-B的培養(yǎng)瓶中加入70ml CIK細胞誘導培養(yǎng)基誘導CIK細胞;在預包被NK-B的培養(yǎng)瓶中加入70ml NK細胞誘導培養(yǎng)基以及終濃度誘導NK細胞；將細胞培養(yǎng)液混合均勻后放置在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0062](5)培養(yǎng)的第3天，用5ml淋巴細胞培養(yǎng)基溶解I支CIK-A，并取出Iml補加到CIK細胞誘導體系中繼續(xù)培養(yǎng)，其余4ml廢棄；
[0063](6)培養(yǎng)的第4天，在DC細胞誘導體系中加入50ml DC細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勻后培養(yǎng);同時NK細胞誘導體系中加入100ml NK細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng)；
[0064](7)培養(yǎng)第5天，在CIK細胞誘導體系中加入10mlCIK細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng)；
[0065](8)培養(yǎng)第6天，在DC細胞誘導體系中加入用500ul淋巴細胞培養(yǎng)基溶解的干粉DC-B，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng)；
[0066](9)第7天，將CIK細胞誘導體系中的全部細胞懸液轉移到一個1.8升容量的細胞培養(yǎng)袋中并在培養(yǎng)體系中，補加200ml CIK細胞誘導培養(yǎng)基;與此同時將誘導DC細胞誘導體系中的細胞全部收獲后加入到上述細胞培養(yǎng)袋中與CIK細胞共培養(yǎng)，并且補加用500ul淋巴細胞培養(yǎng)基溶解的干粉CIK-C;同時，將NK細胞誘導體系中的細胞懸液加入到另一個1.8升容量細胞培養(yǎng)袋中，在培養(yǎng)體系中加入400ml的NK細胞誘導培養(yǎng)，并補加用500ul淋巴細胞培養(yǎng)基溶解的干粉NK-C，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng)；
[0067](10)培養(yǎng)的第9天，在DC-CIK細胞的培養(yǎng)袋中加入400mlCIK細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng)；
[0068](I I)培養(yǎng)的第11天，在DC-CIK細胞共培養(yǎng)的培養(yǎng)袋中加入800ml CIK細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng);與此同時在NK細胞的培養(yǎng)袋中加入100ml的NK細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勾后繼續(xù)培養(yǎng)；
[0069](12)培養(yǎng)的第14天，在DC-CIK細胞培養(yǎng)體系中取出800-1000ml的DC-CIK細胞懸液收獲細胞，并加入600ml的CIK細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng);與此同時在NK細胞培養(yǎng)體系中取出800-1000ml的NK細胞懸液收獲細胞，加入600ml的NK細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng)并離心并回收細胞。
[0070](13)第17天，將DC-CIK細胞共培養(yǎng)的培養(yǎng)袋及NK細胞的培養(yǎng)袋中的所有細胞收獲，離心并回收細胞，計算細胞總數并通過流式細胞檢測方法確定其中CIK細胞的比例和NK細胞的比例。
[0071 ] 所述步驟(I3)中，所述CIK細胞的比例是指⑶3+⑶56+的比例，NK細胞的比例是指CD3—CD56+的比例。
[0072]實施例1
[0073]如圖1、2、3所示，本發(fā)明的DC-CIK、NK細胞的試劑盒，包括DC套盒:10ug干粉DC-A、5ug干粉DC-B; CIK套盒:6支干粉CIK-A( 30ug/支)、1ug干粉CIK-B、20ug干粉CIK-C ； NK套盒:5支干粉NK-A( 50ug/支)、1ug干粉NK-B、5ug干粉NK-C，按質量百分比，各種組分的成分如下:
[0074]DC 套盒:
[0075]干粉DC_A:40%白細胞介素_4(4000IU/ug)、60%粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(25000IU/ug)；
[0076]干粉DC-B:100 % 腫瘤壞死因子-α (16000IU/ug)；
[0077]CIK 套盒:
[0078]干粉CIK-A:70% 白細胞介素_2(15000IU/ug)、30%氨基酸；
[0079]干粉CIK-B:70%CD3單抗、30%干擾素-伽馬(28000IU/ug)；
[0080]干粉CIK-C: 25 % CD3 單抗、75 % CD28 單抗；
[0081]NK 套盒:
[0082]干粉NK-A:40%白細胞介素-2(15000IU/ug)、30% 白細胞介素-12(7000IU/ug)、30% 白細胞介素-15(7000IU/ug);
[0083]干粉NK-B:70%CD16單抗、30%干擾素-伽馬(40000IU/ug)；
[0084]干粉NK-C:100%CD16 單抗。
[0085]具體實施方案:
[0086](I)配置細胞誘導培養(yǎng)基備用
[0087]DC細胞誘導培養(yǎng)基:150ml淋巴細胞培養(yǎng)基中添加干粉DC-A;
[0088]CIK細胞誘導培養(yǎng)基:每500ml淋巴細胞培養(yǎng)基中添加I支干粉CIK-A;
[0089]NK細胞誘導培養(yǎng)基:每500ml淋巴細胞培養(yǎng)基中添加I支干粉NK-A;
[0090](2)使用6毫升淋巴細胞培養(yǎng)基充分溶解試劑盒中的干粉CIK-B，并利用0.22微米孔徑的濾膜過濾溶液，在I個T-17 5培養(yǎng)瓶中分別加入5毫升過濾后的溶液，在CO2培養(yǎng)箱中孵育2小時;再使用6毫升淋巴細胞培養(yǎng)基充分溶解試劑盒中的干粉NK-B，并利用0.22微米孔徑的濾膜過濾溶液，在I個T-17 5培養(yǎng)瓶中分別加入5毫升過濾后的溶液，在CO2培養(yǎng)箱中孵育2小時；
[0091](3)分離獲得的PBMC取(5-10)*107個細胞接種至一個T-175細胞培養(yǎng)瓶中，加入50ml淋巴細胞培養(yǎng)基孵育l-2h后將未貼壁的細胞吸出，貼壁的細胞中加入50ml DC細胞誘導培養(yǎng)基，誘導DC細胞；
[0092](4)將步驟(3)中的未貼壁的細胞加入到未使用的I3BMC中，按照細胞數量比1:1的比例將所有細胞平均加入到分別提前2小時CIK-B預包被T-175細胞培養(yǎng)瓶，以及NK-B預包被的T-175細胞培養(yǎng)瓶中；在預包被CIK-B的培養(yǎng)瓶中加入70ml CIK細胞誘導培養(yǎng)基誘導CIK細胞;在預包被NK-B的培養(yǎng)瓶中加入70ml NK細胞誘導培養(yǎng)基以及終濃度誘導NK細胞；將細胞培養(yǎng)液混合均勻后放置在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0093](5)培養(yǎng)的第3天，用5ml淋巴細胞培養(yǎng)基溶解I支CIK-A，并取出
[0094]Iml補加到CIK細胞誘導體系中繼續(xù)培養(yǎng)，其余4ml廢棄；
[0095](6)培養(yǎng)的第4天，在DC細胞誘導體系中加入50ml DC細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勻后培養(yǎng);同時NK細胞誘導體系中加入100ml NK細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng)；
[0096](7)培養(yǎng)第5天，在CIK細胞誘導體系中加入10mlCIK細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng)；
[0097](8)培養(yǎng)第6天，在DC細胞誘導體系中加入用500ul淋巴細胞培養(yǎng)基溶解的干粉DC-B，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng)；
[0098](9)第7天，將CIK細胞誘導體系中的全部細胞懸液轉移到一個1.8升容量的細胞培養(yǎng)袋中并在培養(yǎng)體系中，補加200ml CIK細胞誘導培養(yǎng)基;與此同時將誘導DC細胞誘導體系中的細胞全部收獲后加入到上述細胞培養(yǎng)袋中與CIK細胞共培養(yǎng)，并且補加用500ul淋巴細胞培養(yǎng)基溶解的干粉CIK-C;同時，將NK細胞誘導體系中的細胞懸液加入到另一個1.8升容量細胞培養(yǎng)袋中，在培養(yǎng)體系中加入400ml的NK細胞誘導培養(yǎng)，并補加用500ul淋巴細胞培養(yǎng)基溶解的干粉NK-C，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng)；
[0099](10)培養(yǎng)的第9天，在DC-CIK細胞的培養(yǎng)袋中加入400mlCIK細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng)；
[0100](11)培養(yǎng)的第11天，在DC-CIK細胞共培養(yǎng)的培養(yǎng)袋中加入800ml CIK細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng);與此同時在NK細胞的培養(yǎng)袋中加入100ml的NK細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勾后繼續(xù)培養(yǎng)；
[0101](12)培養(yǎng)的第14天，在DC-CIK細胞培養(yǎng)體系中取出800-1000ml的DC-CIK細胞懸液收獲細胞，并加入600ml的CIK細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng);與此同時在NK細胞培養(yǎng)體系中取出800-1000ml的NK細胞懸液收獲細胞，加入600ml的NK細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng)并離心并回收細胞。
[0102](13)第17天，將DC-CIK細胞共培養(yǎng)的培養(yǎng)袋及NK細胞的培養(yǎng)袋中的所有細胞收獲，離心并回收細胞，計算細胞總數為60.2*108，并通過流式細胞檢測方法確定其中CIK細胞(CD3+CD56+)的比例為26.8 %，NK細胞(CD3—CD56+)的比例為52.2 %。
[0103]實施例2
[0104]本發(fā)明的DC-CIK、NK細胞的試劑盒，包括DC套盒:10呢干粉0(:4、51^干粉0(:-8 ； CIK套盒:6支干粉CIK-A(30ug/支)、1ug干粉CIK-B、20ug干粉CIK-C ； NK套盒:5支干粉NK-A(50ug/支)、1ug干粉NK-B、5ug干粉NK-C，按質量百分比，各種組分的成分如下:
[0105]DC 套盒:
[0106]干粉DC-A:50%白細胞介素-4(4000IU/ug)、50%粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(25000IU/ug)；
[0107]干粉DC_B:100% 腫瘤壞死因子-a(16000IU/ug);
[0108]CIK 套盒:
[0109]干粉CIK-A:75%白細胞介素-2(15000IU/ug)、25%氨基酸；
[0110]干粉CIK-B:80%CD3單抗、20%干擾素-伽馬(28000IU/ug)；
[0111]干粉CIK-C: 30 % CD3 單抗、70 % CD28 單抗；
[0112]NK 套盒:
[0113]干粉NK-A:40%白細胞介素-2(15000IU/ug)、30% 白細胞介素-12(7000IU/ug)、30% 白細胞介素-15(7000IU/ug);
[0114]干粉NK-B:80%CD16 單抗、20% 干擾素-伽馬(40000IU/ug);
[0115]干粉NK-C:100%CD16 單抗。
[0116]具體實施方案:
[0117](I)配置細胞誘導培養(yǎng)基備用
[0118]DC細胞誘導培養(yǎng)基:150ml淋巴細胞培養(yǎng)基中添加干粉DC-A;
[0119]CIK細胞誘導培養(yǎng)基:每500ml淋巴細胞培養(yǎng)基中添加I支干粉CIK-A;
[0120]NK細胞誘導培養(yǎng)基:每500ml淋巴細胞培養(yǎng)基中添加I支干粉NK-A;
[0121](2)使用6毫升淋巴細胞培養(yǎng)基充分溶解試劑盒中的干粉CIK-B，并利用0.22微米孔徑的濾膜過濾溶液，在I個T-17 5培養(yǎng)瓶中分別加入5毫升過濾后的溶液，在CO2培養(yǎng)箱中孵育2小時;再使用6毫升淋巴細胞培養(yǎng)基充分溶解試劑盒中的干粉NK-B，并利用0.22微米孔徑的濾膜過濾溶液，在I個T-17 5培養(yǎng)瓶中分別加入5毫升過濾后的溶液，在CO2培養(yǎng)箱中孵育2小時；
[0122](3)分離獲得的PBMC取(5-10)*107個細胞接種至一個T-175細胞培養(yǎng)瓶中，加入50ml淋巴細胞培養(yǎng)基孵育l-2h后將未貼壁的細胞吸出，貼壁的細胞中加入50ml DC細胞誘導培養(yǎng)基，誘導DC細胞；
[0123](4)將步驟(3)中的未貼壁的細胞加入到未使用的I3BMC中，按照細胞數量比1:1的比例將所有細胞平均加入到分別提前2小時CIK-B預包被T-175細胞培養(yǎng)瓶，以及NK-B預包被的T-175細胞培養(yǎng)瓶中；在預包被CIK-B的培養(yǎng)瓶中加入70ml CIK細胞誘導培養(yǎng)基誘導CIK細胞;在預包被NK-B的培養(yǎng)瓶中加入70ml NK細胞誘導培養(yǎng)基以及終濃度誘導NK細胞；將細胞培養(yǎng)液混合均勻后放置在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0124](5)培養(yǎng)的第3天，用5ml淋巴細胞培養(yǎng)基溶解I支CIK-A，并取出Iml補加到CIK細胞誘導體系中繼續(xù)培養(yǎng)，其余4ml廢棄；
[0125](6)培養(yǎng)的第4天，在DC細胞誘導體系中加入50ml DC細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勻后培養(yǎng);同時NK細胞誘導體系中加入100ml NK細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng)；
[0126](7)培養(yǎng)第5天，在CIK細胞誘導體系中加入10mlCIK細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng)；
[0127](8)培養(yǎng)第6天，在DC細胞誘導體系中加入用500ul淋巴細胞培養(yǎng)基溶解的干粉DC-B，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng)；
[0128](9)第7天，將CIK細胞誘導體系中的全部細胞懸液轉移到一個1.8升容量的細胞培養(yǎng)袋中并在培養(yǎng)體系中，補加200ml CIK細胞誘導培養(yǎng)基;與此同時將誘導DC細胞誘導體系中的細胞全部收獲后加入到上述細胞培養(yǎng)袋中與CIK細胞共培養(yǎng)，并且補加用500ul淋巴細胞培養(yǎng)基溶解的干粉CIK-C;同時，將NK細胞誘導體系中的細胞懸液加入到另一個1.8升容量細胞培養(yǎng)袋中，在培養(yǎng)體系中加入400ml的NK細胞誘導培養(yǎng)，并補加用500ul淋巴細胞培養(yǎng)基溶解的干粉NK-C，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng)；
[0129](10)培養(yǎng)的第9天，在DC-CIK細胞的培養(yǎng)袋中加入400mlCIK細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng)；
[0130](I I)培養(yǎng)的第11天，在DC-CIK細胞共培養(yǎng)的培養(yǎng)袋中加入800ml CIK細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng);與此同時在NK細胞的培養(yǎng)袋中加入100ml的NK細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勾后繼續(xù)培養(yǎng)；
[0131](12)培養(yǎng)的第14天，在DC-CIK細胞培養(yǎng)體系中取出800-1000ml的DC-CIK細胞懸液收獲細胞，并加入600ml的CIK細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng);與此同時在NK細胞培養(yǎng)體系中取出800-1000ml的NK細胞懸液收獲細胞，加入600ml的NK細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勾后繼續(xù)培養(yǎng)并尚;L1、并回收細胞；
[0132](13)第17天，將DC-CIK細胞共培養(yǎng)的培養(yǎng)袋及NK細胞的培養(yǎng)袋中的所有細胞收獲，離心并回收細胞，計算細胞總數為59.6*108，并通過流式細胞檢測方法確定其中CIK細胞(CD3+CD56+)的比例為25.6%，爾細胞(0)3—0)56+)的比例為51.7%。
[0133]本發(fā)明立足于免疫細胞DC-CIK、NK細胞的體外大規(guī)模誘導方法，由于其在臨床上巨大的應用前景。本發(fā)明涉及的試劑盒必將為有需求的人員提供一種高效、便捷的DC-CIK、NK細胞獲得方法。
[0134]綜上所述，本發(fā)明的內容并不局限在上述的實施例中，相同領域內的有識之士可以在本發(fā)明的技術指導思想之內可以輕易提出其他的實施例，但這種實施例都包括在本發(fā)明的范圍之內。
【主權項】
1.一種配合淋巴細胞培養(yǎng)基快速誘導大量DC-CIK、NK細胞的試劑盒，其特征在于，包括DC套盒:1ug干粉DC-A，5ug干粉DC-B ； CIK套盒:6支干粉CIK-A、30ug/支，1ug干粉CIK-B，20ug 干粉 CIK-C ； NK 套盒:5 支干粉 NK-A、50ug/支，I Oug 干粉 NK-B，5ug 干粉 NK-C ； 按質量百分比，各種組分的成分如下: DC套盒: 干粉 DC-A: 4000 IU/ug 白細胞介素-430 % -50 % 25000IU/ug粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子50%-70% 干粉DC-B: 16000IU/ug腫瘤壞死因子-α CIK套盒: 干粉CIK-A: 15000IU/ug白細胞介素-2 60%-75%氨基酸25%-40% 干粉 CIK-B:CD3 單抗60%-80% 28000 IU/ug 干擾素-伽馬20%-40% 干粉 CIK-C:CD3 單抗20%-30% CD28 單抗70%-80% NK套盒: 干粉NK-A: 15000IU/ug 白細胞介素_2 30 % -40 % 7000IU/ug 白細胞介素-1220%~30% 7000IU/ug 白細胞介素-1530%~50% 干粉 NK-B:CD16 單抗70%-80% 40000 IU/ug 干擾素-伽馬20%-30% 干粉NK-C:CD16單抗。2.根據權利要求1所述的配合淋巴細胞培養(yǎng)基快速誘導大量DC-CIK、NK細胞的試劑盒，其特征在于，按質量百分比，DC套盒:干粉DC-A:40%白細胞介素_4、60%粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子;干粉DC-B:100%腫瘤壞死因子-a ；CIK套盒:干粉CIK-A:70%白細胞介素_2、30 %氨基酸；干粉CIK-B: 70 % CD3單抗、30 %干擾素-伽馬；干粉CIK-C: 25 %CD3單抗、75 %⑶28單抗;NK套盒:干粉NK-A: 40%白細胞介素_2、30 %白細胞介素-12、30 %白細胞介素-15；干粉NK-B: 70%CDl6單抗、30%干擾素-伽馬；干粉NK-C:100%CDl6單抗。3.如權利要求1中所述的配合淋巴細胞培養(yǎng)基快速誘導出大量DC-CIK、NK細胞的試劑盒的使用方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)配置細胞誘導培養(yǎng)基備用 DC細胞誘導培養(yǎng)基:150ml淋巴細胞培養(yǎng)基中添加干粉DC-A; CIK細胞誘導培養(yǎng)基:每500ml淋巴細胞培養(yǎng)基中添加I支干粉CIK-A; NK細胞誘導培養(yǎng)基:每500ml淋巴細胞培養(yǎng)基中添加I支干粉NK-A; (2)使用6毫升淋巴細胞培養(yǎng)基充分溶解試劑盒中的干粉CIK-B，并利用0.22微米孔徑的濾膜過濾溶液，在I個T-175培養(yǎng)瓶中分別加入5毫升過濾后的溶液，在CO2培養(yǎng)箱中孵育2小時;再使用6毫升淋巴細胞培養(yǎng)基充分溶解試劑盒中的干粉NK-B，并利用0.22微米孔徑的濾膜過濾溶液，在I個T-175培養(yǎng)瓶中分別加入5毫升過濾后的溶液，在CO2培養(yǎng)箱中孵育2小時； (3)分離獲得的PBMC取(5-10)*107個細胞接種至一個T-175細胞培養(yǎng)瓶中，加入50ml淋巴細胞培養(yǎng)基孵育l_2h后將未貼壁的細胞吸出，貼壁的細胞中加入50ml DC細胞誘導培養(yǎng)基，誘導DC細胞； (4)將步驟(3)中的未貼壁的細胞加入到未使用的I3BMC中，按照細胞數量比1:1的比例將所有細胞平均加入到分別提前2小時CIK-B預包被T-175細胞培養(yǎng)瓶，以及NK-B預包被的T-175細胞培養(yǎng)瓶中；在預包被CIK-B的培養(yǎng)瓶中加入70ml CIK細胞誘導培養(yǎng)基誘導CIK細胞;在預包被NK-B的培養(yǎng)瓶中加入70ml NK細胞誘導培養(yǎng)基以及終濃度誘導NK細胞;將細胞培養(yǎng)液混合均勻后放置在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； (5)培養(yǎng)的第3天，用5ml淋巴細胞培養(yǎng)基溶解I支CIK-A，并取出Iml補加到CIK細胞誘導體系中繼續(xù)培養(yǎng)，其余4ml廢棄； (6)培養(yǎng)的第4天，在DC細胞誘導體系中加入50mlDC細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勻后培養(yǎng);同時NK細胞誘導體系中加入100ml NK細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng)； (7)培養(yǎng)第5天，在CIK細胞誘導體系中加入10mlCIK細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng)； (8)培養(yǎng)第6天，在DC細胞誘導體系中加入用500ul淋巴細胞培養(yǎng)基溶解的干粉DC-B，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng)； (9)第7天，將CIK細胞誘導體系中的全部細胞懸液轉移到一個1.8升容量的細胞培養(yǎng)袋中并在培養(yǎng)體系中，補加200ml CIK細胞誘導培養(yǎng)基;與此同時將誘導DC細胞誘導體系中的細胞全部收獲后加入到上述細胞培養(yǎng)袋中與CIK細胞共培養(yǎng)，并且補加用500ul淋巴細胞培養(yǎng)基溶解的干粉CIK-C;同時，將NK細胞誘導體系中的細胞懸液加入到另一個1.8升容量細胞培養(yǎng)袋中，在培養(yǎng)體系中加入400ml的NK細胞誘導培養(yǎng)，并補加用500ul淋巴細胞培養(yǎng)基溶解的干粉NK-C，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng)； (10)培養(yǎng)的第9天，在DC-CIK細胞的培養(yǎng)袋中加入400mlCIK細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng)； (11)培養(yǎng)的第11天，在DC-CIK細胞共培養(yǎng)的培養(yǎng)袋中加入800mlCIK細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng);與此同時在NK細胞的培養(yǎng)袋中加入100ml的NK細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng)； (12)培養(yǎng)的第14天，在DC-CIK細胞培養(yǎng)體系中取出800-1OOOml的DC-CIK細胞懸液收獲細胞，并加入600ml的CIK細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng);與此同時在NK細胞培養(yǎng)體系中取出800-1000ml的NK細胞懸液收獲細胞，加入600ml的NK細胞誘導培養(yǎng)基，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng)并離心并回收細胞。 (13)第17天，將DC-CIK細胞共培養(yǎng)的培養(yǎng)袋及NK細胞的培養(yǎng)袋中的所有細胞收獲，離心并回收細胞，計算細胞總數并通過流式細胞檢測方法確定其中CIK細胞的比例和NK細胞的比例。4.根據權利要求3所述的配合淋巴細胞培養(yǎng)基快速誘導大量DC-CIK、NK細胞的試劑盒的使用方法，其特征在于，所述步驟(13)中，所述CIK細胞的比例是指CD3+CD56+達到25%以上，NK細胞的比例是指⑶3—CD56+達到50%以上。
【文檔編號】C12N5/0784GK105821001SQ201610278809
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月27日
【發(fā)明人】秦臻, 魯振宇, 韓洪起, 張冰晶, 劉俊江, 徐悅
【申請人】天津普瑞賽爾生物科技有限公司