一種福壽螺血細胞的原代培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種福壽螺血細胞的原代培養(yǎng)方法，屬于淡水生物細胞培養(yǎng)技術領域。它的步驟如下：配制細胞培養(yǎng)液；選取體重40-50克的螺在無菌水中飼養(yǎng)；對福壽螺進行表明消毒；解剖福壽螺；吸取福壽螺血液置于含有HBSS清洗液的細胞培養(yǎng)瓶，清洗血細胞；將清洗好的血細胞加入細胞培養(yǎng)液,將培養(yǎng)瓶置于5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi),28℃恒溫培養(yǎng)進行原代培養(yǎng)；過夜后，再加入細胞培養(yǎng)液，每隔5-7天吸出和換入等量的細胞培養(yǎng)液，直至擴展并增殖的細胞充滿培養(yǎng)瓶；本發(fā)明能在較短時間內(nèi)快速、可重復地建立福壽螺血細胞的原代培養(yǎng)，所需要的細胞培養(yǎng)設備簡單，可操作性強。本發(fā)明是對水生無脊椎動物細胞培養(yǎng)的重要補充，也為水生無脊椎動物的免疫機制研究提供基礎資料。
【專利說明】
一種福壽螺血細胞的原代培養(yǎng)方法
技術領域
[0001]本發(fā)明屬于淡水生物細胞培養(yǎng)技術領域，尤其涉及一種福壽螺血細胞的原代培養(yǎng)方法。
【背景技術】
[0002]自從上世紀初Harrison和Carrel創(chuàng)立動物組織和細胞的體外培養(yǎng)方法以來，細胞培養(yǎng)技術得到了長足的發(fā)展，在基礎理論研究和應用研究中都起到了不可替代的重要作用。然而，到目前為止，對于細胞培養(yǎng)技術本身的研究主要集中于脊椎動物(特別是哺乳動物)和昆蟲，對于水生無脊椎動物細胞培養(yǎng)的關注卻相對較少。在公開刊物發(fā)表的有關細胞培養(yǎng)問題的論文中，絕大多數(shù)是脊椎動物和昆蟲的。
[0003]從20世紀60年代開始，研究者開始關注水生無脊椎動物的細胞培養(yǎng)問題，水生無脊椎動物的多種組織和細胞被嘗試進行體外培養(yǎng)，包括上皮細胞，血細胞，消化腺，體和胚胎組織等。在20世紀70年代便建立了水生無脊椎動物雙臍螺胚胎(B1mphalariaglabrataembryonie, BGE)細胞系(Hansen, 1976)。BGE 細胞系是 Hansen 為了研究血吸蟲胞坳感染細胞機制于1976年從淡水雙臍螺胚胎建立的，后由Bayne等完善了凍存方法并提交給 ATCC(CRL-1494)。
[0004]盡管在水生無脊椎動物細胞培養(yǎng)的早期便獲得如此可喜的成就，但幾十年過去后相對于上個世紀70年代沒有大的進展，到目前為止，除了 BGE細胞系，還沒有成功建系的報道，大部分細胞培養(yǎng)通常在體外只能存活比較短的時間，雖然有些報道細胞可存活數(shù)月但只能分裂幾代便不再分裂，整個培養(yǎng)最后也因微生物污染而告終。
[0005]福壽螺又名大瓶螺、蘋果螺，原產(chǎn)于南美洲亞馬遜河流域。1980年前后，因其蛋白質(zhì)含量豐富，營養(yǎng)成分高且繁殖能力強，而被作為一種水生經(jīng)濟動物被引入臺灣、菲律賓和日本，并迅速擴散到東亞和東南亞其余國家(Halwart，1994)。后來由于市場化失敗，福壽螺遭棄養(yǎng)并迅速擴散結(jié)果暴發(fā)成災，嚴重危害作物生產(chǎn)(Naylor，1996)。2000年，世界自然保護耳關盟(World Conservat1n Un1n; Internat1nal Un1n for Conservat1nof Nature and Natural Resources; IUCN)外來入侵物種專家委員會將福壽螺列為世界100種惡性外來入侵物種之一(Lowe et al,2000),也是其中唯一的一種淡水螺。在我國大陸，福壽螺于1981年引入到廣東養(yǎng)殖，1984年后在廣東、廣西、福建等地開始廣泛養(yǎng)殖，隨后推廣到浙江、江西、云南、四川等地，目前已成為長江以南大部分省區(qū)的嚴重農(nóng)業(yè)害蟲(俞曉平等，2001)。2003年，國家環(huán)?？偩趾椭袊茖W院(2003)將福壽螺列入了首批入侵中國的16種外來物種的“黑名單”
在福壽螺的防治過程中，除農(nóng)業(yè)防治和物理防治外，新型生物農(nóng)藥的篩選和鑒定日益成為研究重點。生物農(nóng)藥的活動生物測定需要大量發(fā)育一致的福壽螺，對飼養(yǎng)場地有嚴格的要求，工作量大，而若有離體培養(yǎng)的福壽螺細胞，則可以在離體條件下研究生物農(nóng)藥對二福壽螺的作用，從而有助于在細胞水平研究殺蟲劑對福壽螺的作用機制，有助于當前殺蟲劑的改進和新殺蟲劑的發(fā)明，關于福壽螺血細胞的培養(yǎng)目前還未見相關報道。因此，通過本發(fā)明，建立福壽螺細胞系，不僅能增加我國細胞系的數(shù)量及種類，還能為日后該類生物細胞系的建立提供借鑒經(jīng)驗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種福壽螺血細胞的原代培養(yǎng)方法，為福壽螺生理生化研究、毒理學研究等提供技術支持和保障。
[0007]本發(fā)明通過以下技術方案完成:
(1)配制細胞培養(yǎng)液；
(2)選取體重40-50克的螺在無菌水中飼養(yǎng)12小時；
(3)將螺表面的粘液用無菌棉簽擦洗干凈，將螺浸沒在0.1%ΚΜη04溶液中，進行表面消毒10-20分鐘；
(4)用無菌蒸餾水清洗螺3-5次；
(5)用無菌濾紙吸干螺表面水分；
(6)將螺置于用75%酒精消毒過的解剖盤中，解剖福壽螺；
(7)用一次性無菌注射器從福壽螺心臟處抽取血液，放入含有l(wèi)_2mLHBSS清洗液的T-25cm2細胞培養(yǎng)瓶，靜置10-15分鐘，待血細胞貼壁后，吸除HBSS，加入新鮮的HBSS，重復3-5 次；
(8)最后I次去除HBSS后，加入細胞培養(yǎng)液1-1.5mL,將培養(yǎng)瓶置于5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，28 °C恒溫培養(yǎng)；
(9)過夜后，再加入2-1.5mL細胞培養(yǎng)液，每隔5_7天吸出和換入60%—70%量的細胞培養(yǎng)液，直至擴展并增殖的細胞充滿培養(yǎng)瓶；
整個操作過程都是在無菌條件下進行的。
[0008]所述的細胞培養(yǎng)液是RPMI1640培養(yǎng)基與青霉素、鏈霉素、兩性霉素B和動物血清的混合物，以及飽和苯基硫脲的混合物，pH值7.0-7.4 ;所述的動物血清為胎牛血清；所述的青霉素含量為200U/ml,鏈霉素含量為0.2 μ g /ml,兩性霉素B含量為0.5 μ g /ml ；所述的動物血清含量為10-20% (體積比);所述的飽和苯基硫脲溶液為高壓滅菌的苯基硫脲固體過量加入到無菌的RPMI1640培養(yǎng)基中配制而成。
[0009]本發(fā)明的有益效果是:
采用上述方案，對福壽螺血細胞進行了原代培養(yǎng)，取得了較好的培養(yǎng)效果。本發(fā)明快速、有效、重復性強，是對淡水無脊椎生物細胞培養(yǎng)的重要補充。福壽螺為重要的外來入侵生物，本發(fā)明有助于在離體條件下研究福壽螺，為其防治途徑的研究和新型生物農(nóng)藥的開發(fā)提供幫助。
[0010]本發(fā)明中福壽螺血細胞系的生物學特征觀察和測定
1.經(jīng)實驗觀察，該細胞系大部分貼壁生長，細胞的形狀大部分圓形，(圖1);
2.以2xl05細胞/mL的濃度接種到T-25cm2培養(yǎng)瓶中，27°C無光照培養(yǎng)，每天取一瓶測定細胞濃度，繪制生長曲線(圖2)，并按照公式T=tlg2/[lg(N/N。)]計算群體倍增時間，經(jīng)過計算第八代的細胞群體倍增時間為96小時。其中
T=在對數(shù)期平均增長一倍所需的時間 t=接種到測定細胞數(shù)的時間 N。=接種時的細胞數(shù) N=時刻t所測定的細胞總數(shù)
3.用醛縮酶設計引物，利用DAF-PCR的方法鑒定了本發(fā)明建立的細胞系的確來源于福壽螺血細胞，而非其他細胞系的污染(圖3)。由細胞系提供的DNA條帶與福壽血液DNA擴增后的帶型相同，而與對照細胞系sf9和s2帶型明顯不同。
【附圖說明】
[0011]
圖1培養(yǎng)40天后血細胞的培養(yǎng)形態(tài)圖2第8代血細胞的生長曲線圖3細胞系的DAF-PCR鑒定
【具體實施方式】
[0012]以下結(jié)合實例對本發(fā)明作進一步的詳細說明:
實施例1
細胞培養(yǎng)液的配制 (配制 500mL):
成分數(shù)量
RPMI1640 培養(yǎng)基400mL
胎牛血清50.0mL
苯基硫脲飽和溶液50.0mL
青霉素100U
鏈霉素0.1 μ g
兩性霉素B0.25 μ g
在無菌操作臺內(nèi)，將上述成分混勻，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0013]
實施例2福壽螺血細胞的原代培養(yǎng):
經(jīng)過下列步驟:
(1)配制細胞培養(yǎng)液；
(2)選取體重40克的螺在無菌水中飼養(yǎng)12小時；
(3)將螺表面的粘液用無菌棉簽擦洗干凈，將螺浸沒在0.1%ΚΜη04溶液中，進行表面消毒10分鐘；
(4)用無菌蒸餾水清洗螺3次；
(5)用無菌濾紙吸干螺表面水分；
(6)將螺置于用75%酒精消毒過的解剖盤中，解剖福壽螺；
(7)用一次性無菌注射器從福壽螺心臟處抽取血液，放入含有ImLHBSS清洗液的T-25cm2細胞培養(yǎng)瓶，靜置10分鐘，待血細胞貼壁后，吸除HBSS，加入新鮮的HBSS，重復3次；
(8)最后I次去除HBSS后，加入細胞培養(yǎng)液lmL，將培養(yǎng)瓶置于5%的0)2培養(yǎng)箱內(nèi)，28°C恒溫培養(yǎng)；
(9)過夜后，再加入2mL細胞培養(yǎng)液，每隔5天吸出和換入60%量的細胞培養(yǎng)液，直至擴展并增殖的細胞充滿培養(yǎng)瓶。
[0014]實施例3福壽螺血細胞的原代培養(yǎng):
經(jīng)過下列步驟:
(1)配制細胞培養(yǎng)液；
(2)選取體重50克的螺在無菌水中飼養(yǎng)12小時；
(3)將螺表面的粘液用無菌棉簽擦洗干凈，將螺浸沒在0.1%ΚΜη04溶液中，進行表面消毒20分鐘；
(4)用無菌蒸餾水清洗螺5次；
(5)用無菌濾紙吸干螺表面水分；
(6)將螺置于用75%酒精消毒過的解剖盤中，解剖福壽螺；
(7)用一次性無菌注射器從福壽螺心臟處抽取血液，放入含有2mLHBSS清洗液的T-25cm2細胞培養(yǎng)瓶，靜置15分鐘，待血細胞貼壁后，吸除HBSS，加入新鮮的HBSS，重復5次；
(8)最后I次去除HBSS后，加入細胞培養(yǎng)液1.5mL,將培養(yǎng)瓶置于5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，28 °C恒溫培養(yǎng)；
(9)過夜后，再加入1.5mL細胞培養(yǎng)液，每隔7天吸出和換入70%量的細胞培養(yǎng)液，直至擴展并增殖的細胞充滿培養(yǎng)瓶；
在上述操作后3天后可觀察到大量增殖的單個細胞并逐漸向外圍擴展直至擴展并增殖的細胞充滿培養(yǎng)瓶；第40天后，增殖細胞鋪滿細胞培養(yǎng)表面(圖1 )，福壽螺血細胞原代培養(yǎng)成功；把含有新增值的細胞，連同全部的細胞培養(yǎng)液吸出放入新培養(yǎng)瓶中，按照1:5(細胞體積:最后培養(yǎng)液體積)進行傳代培養(yǎng)。福壽螺血細胞原代培養(yǎng)初步建立成功。細胞群體倍總時間為96h (圖2)。
[0015]實施例4細胞系的生物學特性觀察和測定；
(O形態(tài)特征:經(jīng)顯微鏡觀察，該細胞系貼壁生長，大部分圓形，少部分梭形，較少似巨噬細胞形(圖1)。圓形細胞占95%，平均直徑21 μ m;
(2)細胞的生長:生長曲線呈典型的“S”，群體倍增時間為96小時(圖2) ;(3)DAF-PCR鑒定:用醛縮酶設計引物，利用DAF-PCR的方法鑒定了本發(fā)明建立的細胞系的確來源于福壽螺的血細胞，而非其他細胞系的污染(圖3)。由細胞系提供的DNA條帶與福壽螺血液DNA擴增后的帶型相同，而與對照細胞系sf9和s2帶型明顯不同。
【主權(quán)項】
1.一種福壽螺血細胞的原代培養(yǎng)方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: (1)配制細胞培養(yǎng)液； (2)選取體重40-50克的螺在無菌水中飼養(yǎng)12小時； (3)將螺表面的粘液用無菌棉簽擦洗干凈，將螺浸沒在0.1%ΚΜη04溶液中，進行表面消毒10-20分鐘； (4)用無菌蒸餾水清洗螺3-5次； (5)用無菌濾紙吸干螺表面水分； (6)將螺置于用75%酒精消毒過的解剖盤中，解剖福壽螺； (7)用一次性無菌注射器從福壽螺心臟處抽取血液，放入含有l(wèi)_2mLHBSS清洗液的T-25cm2細胞培養(yǎng)瓶，靜置10-15分鐘，待血細胞貼壁后，吸除HBSS，加入新鮮的HBSS，重復3-5 次； (8)最后I次去除HBSS后，加入細胞培養(yǎng)液1-1.5mL,將培養(yǎng)瓶置于5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，28 °C恒溫培養(yǎng)； (9)過夜后，再加入2-1.5mL細胞培養(yǎng)液，每隔5_7天吸出和換入60%—70%量的細胞培養(yǎng)液，直至擴展并增殖的細胞充滿培養(yǎng)瓶； 整個操作過程都是在無菌條件下進行的。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的細胞培養(yǎng)液是RPMI1640培養(yǎng)基與青霉素、鏈霉素、兩性霉素B和動物血清的混合物，以及飽和苯基硫脲的混合物，pH值7.0-7.4。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的動物血清為胎牛血清。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的青霉素含量為200U/ml，鏈霉素含量為0.2 μ g /ml,兩性霉素B含量為0.5 μ g /ml。5.根據(jù)權(quán)利要求2、3所述的方法，其特征在于，所述的動物血清含量為10-20%(體積比)。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的飽和苯基硫脲溶液為高壓滅菌的苯基硫脲固體過量加入到無菌的RPMI1640培養(yǎng)基中配制而成。
【文檔編號】C12N5/07GK105820994SQ201510003499
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2015年1月6日
【發(fā)明人】劉光富, 許益鵬, 楊倩倩
【申請人】中國計量學院