基于多重pcr快速鑒定我國外來入侵福壽螺的特異引物對及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一組輔助鑒別外來入侵生物福壽螺的特異引物對及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]福壽螺隸屬于軟體動物門(Mollusca)，腹足綱(Gastropoda)，新進腹足目(Caeogastropoda)，瓶螺科(Ampul Iariidae)，福壽螺屬(Pomacea Perry，1810)。福壽螺自20世紀80年代初作為食物引種并定殖到我國，但由于其口味欠佳而被人們棄養(yǎng)，并在田間大量繁殖；目前該螺已迅速擴展到浙江、福建、廣東、廣西、海南、云南、貴州、江西、四川、重慶、湖南和安徽等省份并為害成災(zāi)。福壽螺可為害多種水生農(nóng)作物，對我國南方水稻生產(chǎn)造成嚴重損失；同時福壽螺破壞水生生態(tài)系統(tǒng)平衡，造成生態(tài)危害;寄生多種寄生蟲，包括人畜共患的“廣州管圓線蟲”，該螺的分布直接影響寄生蟲病的流行范圍與傳播強度。因而，研究福壽螺的擴散和發(fā)生具有重大的實際意義。
[0003]小管福壽螺Pomacea canaliculata (Lamarck, 1822)是我國首批公布的外來入侵有害生物，也是世界公認的100種惡性外來入侵物種之一；斑點福壽螺P.maculata(Perry, 1810)于2010年首次在我國報道分布(潘穎瑛等，2010)，近年來在我國多地被檢測到有分布(Lv et al., 2012; Hu et al.，2014)。兩種福壽螺在我國南方主要水稻種植區(qū)廣泛為害，均為我國重要的外來入侵有害生物。小管福壽螺P.canaliculata與斑點福壽螺P.maculata為近緣種，在形態(tài)特征和生活習(xí)性等多方面高度相似;此外，由于福壽螺高度的環(huán)境適應(yīng)能力，易受食物源、外界環(huán)境和發(fā)育期等因素影響，極易發(fā)生螺種內(nèi)形態(tài)特征變異，因而從形態(tài)上鑒別兩種福壽螺存在很大困難和不確定性。
[0004]準確的物種鑒定是一切生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，也是制定有害生物有效防治措施的關(guān)鍵。近年來分子生物學(xué)技術(shù)快速發(fā)展，通過基因序列擴增、不同種間基因變異程度的比較從而完成種類的快速、準確鑒定已成為可能。分子鑒定具有快速準確及簡便快捷的優(yōu)點，同時不受生活史階段及樣品完整性的限制，可以極大地彌補傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定的缺陷。
[0005]本發(fā)明的目的是提供一種基于多重PCR輔助鑒定外來入侵物種小管福壽螺P.canaliculata與斑點福壽螺P.maculata的特異引物對及其應(yīng)用。含有本發(fā)明所述引物對的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護范圍，試劑盒包含上述特異引物對及PCR反應(yīng)體系、擴增程序及產(chǎn)物檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種輔助快速鑒別我國兩種外來入侵福壽螺的多重PCR特異引物對及其應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明提供的輔助鑒定福壽螺的特異引物對，由序列表的序列I所示DNA序列上游引物，序列表的序列2和序列3所示DNA(下游引物)組成。
[0008]所述特異引物對可用于輔助快速鑒別兩種入侵性福壽螺。
[0009]所述特異引物對可用于制備輔助快速鑒別兩種入侵性福壽螺的試劑盒。
[0010]本發(fā)明還保護一種輔助快速鑒別兩種入侵性福壽螺的試劑盒，包括所述多重PCR特異引物對。
[0011]本發(fā)明還保護一種輔助快速鑒別兩種入侵性福壽螺的方法，包括如下步驟:以待測福壽螺的基因組DNA(或所述基因組DNA的稀釋液)為模板，用所述特異引物對進行PCR擴增，經(jīng)電泳成像顯示:如果得到PCR擴增產(chǎn)物條帶且條帶大小為508 bp，則待測福壽螺樣品為小管福壽螺;如果得到PCR擴增產(chǎn)物且條帶大小為299 bp，待測福壽螺樣品為非小管福壽螺;利用PCR產(chǎn)物條帶大小可以快速區(qū)分兩種入侵性福壽螺。
[0012]所述PCR擴增的反應(yīng)體系具體可為(25yl):Taq polymerase 0.25 μ1，10Χ Taqbuffer 2.5 μ? ,Mg2+ buffer 2.5 μ? ,dNTP mixture 2 μ?，所述上游引物(10 μΜ)1 μ?，所述兩條下游引物(10 μΜ)各0.5 μ?，基因組DNA I μI^ddH2O 14.75 μ?。
[0013]所述PCR擴增的反應(yīng)參數(shù)具體可為:94°C預(yù)變性3 min;94°C變性30 sec，55°C退火30 sec，72°C延伸40 sec，35個循環(huán);72°C延伸5 min。
[0014]所述待測福壽螺可為福壽螺屬福壽螺，福壽螺P.canaliculata譯名為“小管福壽螺”、福壽螺P.maculata譯名為“斑點福壽螺”。
[0015]本發(fā)明還保護一種從福壽螺中輔助鑒別兩種入侵性福壽螺的方法，包括如下步驟:以待測福壽螺的基因組DNA為模板，用所述特異引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物為508 bp的待測福壽螺為候選的小管福壽螺，得到PCR擴增產(chǎn)物為299 bp的待測福壽螺為候選的斑點福壽螺。利用擴增條帶的大小可以快速鑒別兩種入侵性福壽螺。
[0016]本發(fā)明的目的是提供一種輔助快速鑒別兩種入侵性福壽螺的特異引物對及其應(yīng)用。含有本發(fā)明所述引物對的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護范圍，試劑盒包含上述特異引物對及PCR反應(yīng)體系、擴增程序及產(chǎn)物檢測方法。
[0017]本發(fā)明針對植物保護及口岸檢疫部門外來入侵福壽螺種類鑒定應(yīng)用的現(xiàn)實需要，設(shè)計篩選了鑒別兩種入侵性福壽螺的特異引物對，并發(fā)明了鑒別和檢測兩種入侵性福壽螺的方法。本發(fā)明的特點是:
(I)種類鑒定過程快速高效，鑒定結(jié)果準確可靠。特異引物試劑盒檢測通過PCR擴增針對兩種入侵性福壽螺特異性地擴增出不同大小的產(chǎn)物，檢測靈敏度高，耗時短，且可以實現(xiàn)高通量檢測。(2)鑒定對象不受種類性別，發(fā)育階段和形態(tài)鑒定特征完整程度的影響。傳統(tǒng)形態(tài)鑒定方法一般只針對成螺的形態(tài)特征，需要專業(yè)的分類學(xué)知識，對樣品完整性等要求高。(3)鑒定過程操作簡便，經(jīng)濟易行。特異引物分子鑒定方法可標準化，操作簡便且所需費用較低，便于無專業(yè)分類學(xué)知識背景的工作人員操作與運用。
【附圖說明】
[0018]圖1多重PCR特異引物對PomF/PcanR/PmacR2檢測不同地理種群的入侵性福壽螺的凝膠電泳圖。
[0019]圖2多重PCR特異引物對PomF/PcanR/PmacR2檢測不同發(fā)育階段的兩種入侵性福壽螺的凝膠電泳圖。
【具體實施方式】
[0020]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0021]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0022]以下實施例進一步說明本
【發(fā)明內(nèi)容】
，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。
[0023]實施樣本包括采自不同地點的小管福壽螺和斑點福壽螺，該兩種福壽螺的中譯名在文獻為“楊倩倩，王正亮，劉光富，俞曉平.我國外來入侵種福壽螺分子生物學(xué)研究進展.中國計量學(xué)院學(xué)報，2014，25 (2): 122-128.”以及“周曉農(nóng)，張儀，呂山.‘福壽螺’學(xué)名中譯名的探討.中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2009，27: 62?64.”中公開過，公眾均可以從中國計量學(xué)院獲得。
[0024]
實施例1:多重PCR特異引物對的設(shè)計
本發(fā)明在獲取兩種外來入侵福壽螺線粒體COI基因DNA條形碼區(qū)段的基礎(chǔ)上，經(jīng)過序列的多重比對分析，針對兩種入侵性福壽螺設(shè)計特異引物對，如表I所示。
[0025]在福壽螺屬的常見福壽螺線粒體細胞色素氧化酶亞基I條形碼(mtDNA COIbarcode)區(qū)段的基礎(chǔ)上，設(shè)計合成可鑒別兩種入侵性福壽螺的多重PCR特異引物對:
PomF(序列表的序列 I): 5 ’ - GTTTACTTATTCGTGCTGAGTTAGG -3 ’ ； Tm=55.6 °C，GC%=40%；PcanR(序列表的序列2):5’_ GCAAGAACCGGCAATGATAAGAGCA -3’ ；Tm=64.1°C，GC%=48%0
[0026]PmacR(序列表的序列3):5’_ AGCTAAAGGAGGGTACACTGTTCAC -3’；Tm=60.3°C，GC%=48% o
[0027]實施例2:應(yīng)用特異性引物檢測兩種入侵性福壽螺實施例中采用如下樣本:
樣本1-2:采集自浙江舟山普陀島種群I的福壽螺P.cana I i cu Iata不同卵塊的卵粒;樣本3-4:采集自浙江舟山普陀島種群2的福壽螺P.canalicuIata不同卵塊的卵粒;樣本5_6:采集自廣東揭陽空港區(qū)的福壽螺P.canaliculata不同卵塊的卵粒;樣本7_8:采集自廣東廣州華南農(nóng)業(yè)大學(xué)的福壽螺P.can