專利名稱:紐蟲重組鐵結(jié)合蛋白及制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及重組鐵結(jié)合蛋白，具體涉及紐蟲重組鐵結(jié)合蛋白及紐蟲的體外重組鐵結(jié)合蛋白的制備方法。
背景技術：
鐵結(jié)合蛋白(鐵蛋白)是 一種具有儲存數(shù)千鐵離子和數(shù)百磷分子能力的蛋白質(zhì)，其分子結(jié)構(gòu)被認為是由高度對稱性亞基所組合的蛋白質(zhì)，外殼可以包裹著由鐵磷化合物組成的鐵核。鐵核結(jié)構(gòu)起著供給和存儲鐵的“倉庫作用”，鐵蛋白的蛋白殼上含有兩種橫跨蛋白殼的隧道，即三相(X.Y.Z)物質(zhì)交換隧道和電子隧道，前者的作用供無機磷鐵及其他小分子進出，后者的功能起著接收及傳遞電子的作用。脊椎動物的鐵蛋白由兩種不同類型的亞基組成，即H和L亞基，L型亞基與H型亞基相互作用使氧化型鐵礦化為一個鐵核。。目前大部份是脊椎動物的重組鐵蛋白，如申請?zhí)枮镃N為200510048963.X的發(fā)明專利申請就公開了利用基因工程技術，通過人乳鐵蛋白基因的克隆、重組桿狀病毒的構(gòu)建、家蠶體內(nèi)表達和人乳鐵蛋白純化得到重組人乳鐵蛋白。也有無脊椎動物的重組鐵蛋白，如公開號為CN102051363的發(fā)明專利申請，則公開了文蛤鐵蛋白基因、編碼蛋白、體外重組產(chǎn)物等，通過文蛤RNA提取和純化、cDNA構(gòu)建及鐵蛋白基因的篩選、RACE獲得鐵蛋白基因序列，再利用鐵蛋白基因進行PCR擴增、克隆至表達載體、轉(zhuǎn)化至大腸桿菌、LB培養(yǎng)劑培養(yǎng)、菌體用雞蛋清溶菌酶處理、超聲破碎、從包涵體體中純化得到目的蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種紐蟲重組鐵結(jié)合蛋白及紐蟲的體外重組鐵結(jié)合蛋白的制備方法，該重組紐蟲鐵結(jié)合蛋白具有存儲鐵功能外，還具有富集重金屬和有機磷的功能。
本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案為:紐蟲重組鐵結(jié)合蛋白，該紐蟲重組鐵結(jié)合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示。
紐蟲的體外重組鐵結(jié)合蛋白的制備方法，其步驟如下:
a、RNA提取:取紐蟲體壁80-100mg速凍于液氮中,研磨成粉,用RNAisoplus 提取試劑盒提取得到紐蟲RNA，具體提取方法依照提取試劑盒說明書進行操作；
b、cDNA合成:將紐蟲RNA用cDNA試劑盒合成cDNA，具體合成方法依該cDNA試劑盒說明操作，得到cDNA文庫質(zhì)粒，然后用下述引物對合成的cDNA進行PCR擴增，上游引物:5’ C、重組質(zhì)粒:對上述陽性克隆質(zhì)粒進行PCR擴增，擴增體系:上述陽性克隆質(zhì)粒l.0yL, 10XPCR 緩沖液 2.5 μ L，濃度 25mM 的 MgCl2L 5 μ L，濃度 IOmM 的 dNTP2.5yL，濃度ΙΟμΜ的正向引物1.0μ L，濃度ΙΟμΜ的反向引物1.0μ L，濃度5U/μ L的DNA聚合酶 0.2μ L，超純水 15.3μ L ;擴增條件:94°C 4 min,94°C lmin、58°C lmin、72°C Imin，共35個循環(huán)，最后72°C延伸10 min ;其中正向引物序列為5’-ACGCAAGCTT TTAAGAAGAGTTCCTT-3’，反向引物序列為 5’ -CGGGATCCAT GTCACTCTGT CGT-3’，擴增產(chǎn)物經(jīng) QIAquickGel Extraction純化試劑盒純化后,再用I和III內(nèi)切酶酶切,酶切產(chǎn)物與載體pET-28a(+)連接，獲得重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.Cb7i BL21(DE3)中，再接種到卡那霉素濃度為50 μ g/mL的LB培養(yǎng)液中，37 °C、120r/min振蕩培養(yǎng)至菌液A600值為0.6^0.8時，加入異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)使其終濃度為lmmol/L，37°C誘導表達3_6h，收集菌液經(jīng)12000r/min離心5min，棄上清液，得到細菌沉淀物，4°C保存；
d、蛋白純化:細菌沉淀物用IX磷酸緩沖液漂洗，再在4°C、12000 r/min離心5min，得漂洗后細菌沉淀物，每克漂洗后細菌沉淀物中加入5ml的I X磷酸緩沖液，混勻后4°C下，用450W超聲波，超聲破碎lOmin，12000 r/min離心5min得到包涵體沉淀；每克包涵體沉淀加入200 μ L緩沖液B，0.5 μ L β -巰基乙醇和4 μ L濃度為20mM的咪唑，輕微混勻后，在室溫放置lh，12000 r/min離心IOmin保留上清液，在每毫升上清液中加入鎳珠10 μ L，輕微混勻30min, 12000 r/min離心10s,去上清得到鎳珠-鐵合結(jié)蛋白沉淀，10毫克鎳珠-鐵合結(jié)蛋白沉淀中加入250 μ L緩沖液C和5 μ L濃度為20mM的咪唑，輕微混勻后，12000 r/min離心10s，去上清，在2-5毫克沉淀中加入25 μ L緩沖液E和5 μ L濃度為160mM的咪唑，輕微混勻后，12000 r/min離心10s，取上清，得到含重組鐵結(jié)合蛋白的洗脫液，濃縮洗脫液得到如序列表SEQ ID N0.1所示的紐蟲重組鐵結(jié)合蛋白；所述緩沖液B的pH為8.0，所述緩沖液B含有濃度為IOOmM的NaH2PO4，濃度為IOmM的三羥甲基氨基甲烷，濃度為6M的鹽酸胍；所述緩沖液C的pH為6.3，所述緩沖液C含有濃度為IOOmM的NaH2PO4,濃度為IOmM的三羥甲基氨基甲烷，濃度為8M的尿素；所述緩沖液E的pH為4.5，所述緩沖液E含有濃度為IOOmM的NaH2PO4，濃度為IOmM的三羥甲基氨基甲烷，濃度為8M的尿素。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于紐蟲重組鐵結(jié)合蛋白及制備方法，該紐蟲重組鐵結(jié)合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示；該紐蟲重組鐵結(jié)合蛋白是從紐蟲體壁中，通過RNA提取，再合成為cDNA，對cDNA的載體擴大培育得到陽性克隆質(zhì)粒，陽性克隆質(zhì)粒擴增、酶切后，與載體連接培育得到重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒培育后破碎及蛋白純化得到紐蟲重組鐵結(jié)合蛋白；該方法得到的紐蟲重組鐵結(jié)合蛋白產(chǎn)量遠遠高于目前從動物腎臟提取的鐵結(jié)合蛋白，用N1-NTA得到的鐵結(jié)合蛋白純度較高，鐵結(jié)合蛋白結(jié)合鐵能力較好，還具有富集重金屬和有機磷的作用。
具體實施方式

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。實施例
RNA提取:取紐蟲體壁80_100mg速凍于液氮中，研磨成粉，用RNAiso plus提取
試劑盒(購于Takara公司)提取得到紐蟲RNA，具體提取方法依照提取試劑盒說明書進行操作:體壁研磨成粉后，加入RNAiso裂解液，樣品與裂解液的重量體積比為1:15-20，勻漿，室溫下靜置5分鐘，4°C，12000 rpm,離心5min，取第一上清液，加入氯仿，上清液與氯仿的體積比為4-5:1，待溶液充分乳化后，室溫下靜置5min，4°C，12000 rpm/min離心15min，得第二上清液，加入異丙醇，第二上清液與異丙醇的體積比為1:1，室溫下靜置lOmin, 4°C, 12000 rpm/min 離心 IOmin,棄上清，沉淀用 75% 乙醇振蕩洗漆,4°C, 12000 rpm/min離心IOmin,干燥沉淀就得紐蟲RNA ；
cDNA合成:將紐蟲RNA用cDNA試劑盒(購于Takara公司)合成cDNA，具體合成方法依該cDNA試劑盒說明操作，得到cDNA文庫質(zhì)粒，然后用下述引物對合成的cDNA進行PCR擴增,上游引物:5’1.0 μ L，10 μ M的反向引物1.0 μ L，5U/μ L的DNA聚合酶0.2 μ L，超純水15.3 μ L，總體積 25.Ομ L ;擴增條件:94°C 4 min, 94 °C lmin、58°C lmin、72°C Imin ,共 35 個循環(huán)，最后72°C延伸10 min ;正向引物序列為5’-ACGCAAGCTT TTAAGAAGAG TTCCTT-3’，反向引物序列為 5’-CGGGATCCAT GTCACTCTGT CGT-3’，擴增產(chǎn)物經(jīng)QIAquick Gel Extraction純化試劑盒(購于QIAquick公司)純化后,再用I和III內(nèi)切酶酶切,酶切產(chǎn)物(dz ferritin)與載體pET-28a(+)連接，獲得重組質(zhì)粒(pET-28 a ( + ) /dz ferritin),重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.Coli BL21(DE3)中，再接種到卡那霉素濃度為50 μ g/mL的LB培養(yǎng)液中，37°C、120r/min振蕩培養(yǎng)至菌液A600值為0.6、.8時，加入IPTG使其終濃度為lmmol/L，37°C誘導表達3-6h (4小時為好)，收集菌液經(jīng)12000r/min離心5min，棄上清液，得到細菌沉淀物，4°C保存；正反向引物是根據(jù)已克隆到的鐵合結(jié)蛋白cDNA序列設計，重組質(zhì)粒陽性篩選和測序用常規(guī)方法進行；
蛋白純化:細菌沉淀物用IX磷酸緩沖液(PBS)漂洗，再在4 °C、12000 r/min離心5min，每克漂洗后的細菌沉淀物中加入5ml的I XPBS，混勻后4°C下，用450W超聲波，超聲破碎IOmin, 12000 r/min離心5min得到包涵體沉淀；每克包涵體沉淀加入200 μ L緩沖液Β，0.5 μ LP-巰基乙醇和4 μ L濃度為20mM的咪唑，輕微混勻后，在室溫放置lh，12 000 r/min離心IOmin保留上清液，在每毫升上清液中加入鎳珠(N1-NTA) 10 μ L，輕微混勻30min，12000 r/min離心10s，去上清得到N1-NTA-鐵合結(jié)蛋白沉淀，10毫克N1-NTA-鐵合結(jié)蛋白沉淀中加入250 μ L緩沖液C和5 μ L濃度為20mM的咪唑，輕微混勻后，12000 r/min離心IOs,去上清，在2-5毫克沉淀中加入25 μ L緩沖液E和5 μ L濃度為160mM的咪唑，輕微混勻后，12000 r/min離心10s，取上清，得到含重組鐵結(jié)合蛋白的洗脫液，濃縮洗脫液得到如序列表SEQ ID N0.1所示的紐蟲重組鐵結(jié)合蛋白；其中緩沖液B的pH為8.0，緩沖液B含有濃度為IOOmM的NaH2PO4,濃度為IOmM的三羥甲基氨基甲烷(Tris)，濃度為6M的鹽酸胍；緩沖液C的pH為6.3，緩沖液C含有濃度為IOOmM的NaH2PO4,濃度為IOmM的Tris，濃度為8M的尿素；緩沖液E的pH為4.5，緩沖液E含有濃度為IOOmM的NaH2PO4,濃度為IOmM的Tris，濃度為8M的尿素。
上述引物由上海生工合成，BamH I和Hind III，載體pMD18_T，載體pET_28a(+)，E.Coli BL21(DE3)，E.Coli DH5 α等載體、酶，購于寶生物工程(大連)有限公司，地址:遼寧省大連市經(jīng)濟技術開發(fā)區(qū)東北二街19號，聯(lián)系電話:0411-87641681, 87641683。10XPCR緩沖液，dNTP，DNA聚合酶，LB平板培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)液，PBS,鎳珠等市售。
試驗例
蛋白結(jié)合鐵能力:以BSA作為空白對照，將紐蟲鐵結(jié)合蛋白和牛血清白蛋白配成濃度為I μ g/mL, 2 μ g/mL, 4 μ g/mL, 6 μ g/mL系列溶液，各取ImL的溶液，分別加入20 μ L的2mMFeCl2溶液,22°C反應IOmin,再加入40 μ L的5mM ferrozine,再反應15min后用分光光度計在波長為562nm處測其吸光值；其中空白對照的吸光值為1.3，I μ g/mL的紐蟲鐵結(jié)合蛋白的吸光值為1.3, 2 μ g/mL的紐蟲鐵結(jié)合蛋白的吸光值為1.15,4 μ g/mL的紐蟲鐵結(jié)合蛋白的吸光值為0.6，6 μ g/mL的紐蟲鐵結(jié)合蛋白的吸光值為0.4，從中可以看出紐蟲鐵結(jié)合蛋白具有結(jié)合鐵能力。
對重金屬的富集:ImL濃度為2 μ g/mL牛血清白蛋白為空白樣觀察，再在三份ImL濃度為2μ g/mL紐蟲鐵結(jié)合蛋白中分別加入20μ L的2mM FeCl2、20 μ L的2mM CuCl2與20yL的2mM CdCl2, 22°C培養(yǎng)Ih后觀察，觀察用的是美國Veeco公司的原子力顯微鏡，使用輕敲(Tapping)模式觀察；觀察用探針型號為NSCll (三角形懸臂，MikroMash公司)，彈性常數(shù)為50 N/m,共振頻率為330 kHz，掃描速率為I 1.5 Hz，觀察結(jié)果顯示Ferritin空白樣，絕大部分蛋白都是 分散較好的單個蛋白分子，直徑10(T300nm，加入Fe2+、Cu2+、Cd2+的Ferritin空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，單個蛋白分子之間相互作用并連接成網(wǎng)狀，加入Fe2+后的蛋白直徑約為300 700nm，加入Cu2后的蛋白直徑為400 1000 nm，加入Cd2后的蛋白對鎘核進行團聚裝富集包裹，蛋白的直徑約為40(Tll00nm。說明紐蟲鐵結(jié)合蛋白可以富集金屬離子。同樣方法也可以看到紐蟲鐵結(jié)合蛋白對有機磷有富集作用。
權利要求
1.蟲重組鐵結(jié)合蛋白，其特征在于該紐蟲重組鐵結(jié)合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1 所示。
2.權利要求
1所述的紐蟲重組鐵結(jié)合蛋白的制備方法，其特征在于步驟如下: a、RNA提取:取紐蟲體壁80-100mg速凍于液氮中,研磨成粉,用RNAisoplus提取試劑盒提取得到紐蟲RNA，具體提取方法依照提取試劑盒說明書進行操作； b、cDNA合成:將紐蟲RNA用cDNA試劑盒合成cDNA，具體合成方法依cDNA試劑盒說明書操作，得到cDNA文庫質(zhì)粒，然后用下述引物對合成的cDNA進行PCR擴增，上游引物的核苷酸序列為 AAGGGCATGA AGGTCCAAGA GGG,下游引物序列為 GTGGAAGCCA TCAGGGAA ； PCR擴增體系:CDNA文庫質(zhì) 粒1.0yL，10XPCR緩沖液2.5 μ L，濃度25mM的MgCl22.0 μ L，濃度IOmM的dNTP2.Ομ L，濃度10 μ M的上游引物1.0 μ L，濃度10 μ M的下游引物1.0 μ L，濃度5U/yL的 DNA聚合酶(λ 2μ L，超純水:15.3μ L ;擴增條件:94°C 5 min、94°C 30 s、58°C 3sO、72°C Imin，共35個循環(huán)，最后72°C延伸10 min ;擴增反應后，用回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，然后PCR產(chǎn)物與載體pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.DH5 α后，在含有氨芐濃度為80-100mg/L的LB平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)8_12h，挑取陽性克隆菌落，得到陽性克隆質(zhì)粒； C、重組質(zhì)粒:對上述陽性克隆質(zhì)粒進行PCR擴增，擴增體系:上述陽性克隆質(zhì)粒l.0yL, 10XPCR 緩沖液 2.5 μ L，濃度 25mM 的 MgCl2L 5 μ L，濃度 IOmM 的 dNTP2.5 μ L，濃度ΙΟμΜ的正向引物l.0yL，濃度ΙΟμΜ的反向引物l.0yL，濃度5U/yL的DNA聚合酶(λ 2μ L，超純水 15.3μ L ;擴增條件:94°C 4 min, 94 °C lmin、58°C lmin、72°CImin，共35個循環(huán)，最后72°C延伸10 min ;其中正向引物的核苷酸序列為ACGCAAGCTTTTAAGAAGAG TTCCTT，反向引物序列為 CGGGATCCAT GTCACTCTGT CGT，擴增產(chǎn)物經(jīng) QIAquickGel Extraction純化試劑盒純化后,再用I和III內(nèi)切酶酶切,酶切產(chǎn)物與載體pET-28a(+)連接，獲得重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.Cb7i BL21(DE3)中，再接種到卡那霉素濃度為50 μ g/mL的LB培養(yǎng)液中，37 °C、120r/min振蕩培養(yǎng)至菌液A600值為0.6^0.8時，加入異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷使其終濃度為lmmol/L，37°C誘導表達3_6h，收集菌液經(jīng)12000r/min離心5min，棄上清液，得到細菌沉淀物，4°C保存； d、蛋白純化:細菌沉淀物用IX磷酸緩沖液漂洗，再在4°C、12000 r/min離心5min，得漂洗后細菌沉淀物，每克漂洗后細菌沉淀物中加入5ml的I X磷酸緩沖液，混勻后4°C下，用450W超聲波，超聲破碎lOmin，12000 r/min離心5min得到包涵體沉淀；每克包涵體沉淀加入200 μ L緩沖液B，0.5 μ L β -巰基乙醇和4 μ L濃度為20mM的咪唑，輕微混勻后，在室溫放置lh，12000 r/min離心IOmin保留上清液，在每毫升上清液中加入鎳珠10 μ L，輕微混勻30min, 12000 r/min離心10s,去上清得到鎳珠-鐵合結(jié)蛋白沉淀，10毫克鎳珠-鐵合結(jié)蛋白沉淀中加入250 μ L緩沖液C和5 μ L濃度為20mM的咪唑，輕微混勻后，12000 r/min離心10s，去上清，在2-5毫克沉淀中加入25 μ L緩沖液E和5 μ L濃度為160mM的咪唑，輕微混勻后，12000 r/min離心10s，取上清，得到含重組鐵結(jié)合蛋白的洗脫液，濃縮洗脫液得到如序列表SEQ ID N0.1所示的紐蟲重組鐵結(jié)合蛋白；所述緩沖液B的pH為8.0，所述緩沖液B含有濃度為IOOmM的NaH2PO4，濃度為IOmM的三羥甲基氨基甲烷，濃度為6M的鹽酸胍；所述緩沖液C的pH為6.3，所述緩沖液C含有濃度為IOOmM的NaH2PO4,濃度為IOmM的三羥甲基氨基甲烷，濃度為8M的尿素；所述緩沖液E的pH為4.5，所述緩沖液E含有濃度為IOOmM的NaH2PO4，濃度為IOmM的三羥甲基氨基甲烷，濃度為8M的尿素。
專利摘要
本發(fā)明公開了紐蟲重組鐵結(jié)合蛋白及制備方法，該紐蟲重組鐵結(jié)合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQIDNO.1所示；該紐蟲重組鐵結(jié)合蛋白是從紐蟲體壁中，通過RNA提取，cDNA合成，對cDNA的載體擴大培育得到陽性克隆質(zhì)粒，陽性克隆質(zhì)粒擴增、酶切后，與載體連接培育得到重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒培育后破碎及蛋白純化得到紐蟲重組鐵結(jié)合蛋白；該方法得到的紐蟲重組鐵結(jié)合蛋白產(chǎn)量遠遠高于目前從動物腎臟提取的鐵結(jié)合蛋白，用Ni-NTA得到的鐵結(jié)合蛋白純度較高，鐵結(jié)合蛋白結(jié)合鐵能力較好，還具有富集重金屬和有機磷的作用。
文檔編號C12N15/12GKCN103087186SQ201310018470
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月18日
發(fā)明者蘇秀榕, 周君, 李曄, 張春丹, 李成華, 劉艷, 李振, 張云云 申請人:寧波大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan