長(zhǎng)牡蠣CgNatterin-3重組蛋白的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種長(zhǎng)牡·〇8ΝΒ??θ；Γ；?η-3重組蛋白的應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 無(wú)脊椎動(dòng)物缺乏適應(yīng)性免疫系統(tǒng)(adaptive immunity)，因此僅能依靠固有免疫 (innate immunity)抵御病原入侵。固有免疫主要通過(guò)抗菌肽/蛋白和吞作用殺傷并清除 病原物，其中對(duì)病原物的識(shí)別是誘發(fā)免疫反應(yīng)的關(guān)鍵步驟。病原在入侵宿主過(guò)程中，伴隨其 感染和復(fù)制，會(huì)產(chǎn)生一系列保守組分，稱為病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，這些PAMPs能夠被宿主免疫細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體 (pattern recognition receptors，PRRs)有效識(shí)別，進(jìn)而誘導(dǎo)一系列的免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)。目 前，無(wú)脊椎動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)了十余類識(shí)別受體，如肽聚糖識(shí)別蛋白（PGRP)和Toll樣受體等，它 們通過(guò)結(jié)合不同的病原相關(guān)分子模式完成對(duì)各種病原微生物的識(shí)別，在誘導(dǎo)細(xì)胞因子和炎 癥的產(chǎn)生、抗菌肽的表達(dá)、激活酚氧化酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)和吞噬作用等一系列固有免疫應(yīng)答中發(fā) 揮重要作用。
[0003] 模式識(shí)別受體(PRRs)是一類主要表達(dá)于固有免疫細(xì)胞表面、可識(shí)別一種或多種 PAMPs的識(shí)別分子。PRRs是固有免疫中感知病原入侵的"前哨"，由數(shù)量有限的胚系基因編 碼，進(jìn)化上十分保守，也表明此類受體對(duì)生物體的生存極為重要。其與病原生物表面的病原 相關(guān)分子模式(PAMPs)的相互識(shí)別和作用是啟動(dòng)固有免疫應(yīng)答的關(guān)鍵。和適應(yīng)性免疫中淋 巴細(xì)胞受體相比較，PRRs有四個(gè)特點(diǎn)：（1)全部由胚系基因編碼；（2)組成性地表達(dá)；（3)引起 快速免疫應(yīng)答；（4)能夠識(shí)別各種病原體。模式識(shí)別受體的研究一直是近年來(lái)免疫學(xué)研究的 前沿?zé)狳c(diǎn)領(lǐng)域，因此對(duì)PRRs分子的發(fā)掘和利用有助于我們明確牡蠣免疫系統(tǒng)識(shí)別病原物的 機(jī)制，揭示牡蠣免疫系統(tǒng)誘發(fā)和清除病原物的規(guī)律，最終為牡蠣病害防治、藥物研發(fā)和良種 選育提供理論基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種長(zhǎng)牡·〇8ΝΒ??θ；Γ；?η-3重組蛋白的應(yīng)用。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為：
[0006] 一種長(zhǎng)牡^CgNatterin_3基因重組蛋白的應(yīng)用，所述重組蛋白CgNatterin_3在作 為病原菌識(shí)別制劑中的應(yīng)用。
[0007] 所述長(zhǎng)牡·〇8Να??θ；Γ；?η-3基因重組蛋白的應(yīng)用，所述長(zhǎng)牡·〇8Να??θ；Γ；?η-3重組蛋 白具有病原相關(guān)分子模式結(jié)合活性和病原菌識(shí)別及凝集活性，可用于開(kāi)發(fā)病原菌識(shí)別制 劑。
[0008] 所述長(zhǎng)牡·〇8ΝΒ??θ；Γ；?η-3基因重組蛋白的制備：
[0009] (1)以長(zhǎng)牡蠣CgNatterin-3編碼區(qū)為模板，采用Ρ1和Ρ2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，待用；
[0010] 所述引物？1和?2分別為卩1:5'-厶丁66〇厶6厶6丁666丁厶1'(：-3' ；
[0011] P2:5 '-CTAAATGACTTTATACAG-3 '；
[0012] (2)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與將pEASY-El載體通過(guò)T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化，測(cè)序鑒定重組子；
[0013] (3)將上述構(gòu)建載體轉(zhuǎn)入Transetta(DE3)表達(dá)菌株中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，而后純化，即 得到CgNatterin-3的重組蛋白。
[0014] 本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)：
[0015] 本發(fā)明中的長(zhǎng)牡蠣CgNatterin-3為新型模式識(shí)別受體，其重組蛋白具有病原相關(guān) 分子模式結(jié)合活性和病原菌識(shí)別及凝集活性。對(duì)長(zhǎng)牡蠣CgNatterin-3蛋白的研究，有利于 深入揭示長(zhǎng)牡蠣固有免疫作用機(jī)制，充分挖掘和利用海洋來(lái)源基因資源，為海洋經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖 動(dòng)物的病害防治提供重要物質(zhì)基礎(chǔ)和理論支持。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的長(zhǎng)牡蠣CgNatterin-3基因重組蛋白對(duì)病原相關(guān)分子模 式具有較強(qiáng)結(jié)合活性圖。
[0017] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的長(zhǎng)牡蠣CgNatterin-3基因重組蛋白具有結(jié)合和凝集細(xì) 菌及真菌的活性圖。
【具體實(shí)施方式】：
[0018] 下面的實(shí)驗(yàn)例中將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但本發(fā)明不限于此。
[0019] 本發(fā)明利用體外重組表達(dá)技術(shù)獲得了長(zhǎng)牡·〇8Να??θ；Γ；?η-3重組蛋白（Genbank號(hào) 為:EKC36293.1)，公開(kāi)了所述長(zhǎng)牡蠣CgNatterin-3基因重組蛋白的病原相關(guān)分子模式結(jié)合 活性、病原菌識(shí)別及凝集活性。利用本發(fā)明獲得的重組蛋白可用于開(kāi)發(fā)病原菌識(shí)別制劑。 [00 20] 實(shí)施例1:長(zhǎng)牡基因編碼區(qū)的體外原核重組表達(dá)，包括下列步驟： [0021 ] 1、重組載體的構(gòu)建
[0022]本發(fā)明中采用的重組表達(dá)載體為北京全式金公司的PEASY-E1原核表達(dá)載體。通過(guò) PCR技術(shù)，使用基因特異性引物PI ( 5 ' - ATGGCAGAGTGGGTATC-3 '）和P2 ( 5 ' -CTAAATGACTTTATACAG-3 '）。擴(kuò)增長(zhǎng)牡蠣CgNatterin-3基因的編碼區(qū)片段。反應(yīng)條件為:首先 94°C預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)入下列循環(huán):94°C變性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸30秒，共進(jìn) 行32個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。將PCR產(chǎn)物純化回收，與pEASY-El載體連接。轉(zhuǎn)化后菌落 PCR篩選并測(cè)序，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，完成載體的構(gòu)建。
[0023] 2、重組蛋白的表達(dá)
[0024] 以Transetta(DE3)為重組表達(dá)宿主菌株，將上述構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主 菌株中，挑取單克隆，提取質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證讀碼框正確。挑取單克隆，接種于5mL LB液體培養(yǎng) 基中，37°C震蕩搖床中培養(yǎng)12~16小時(shí)，然后以l:100(v/v)的比例接種200mL LB液體培養(yǎng) 基中，37°C培養(yǎng)至0D600:0.5~0.7。加入IPTG，使終濃度達(dá)到0.5mM mL-1，16°C繼續(xù)培養(yǎng)20小 時(shí)。4°C，6000rpm，離心10min，收集菌體，于-20°C凍存?zhèn)溆?。取lmL菌液離心，棄去上清后，加 入80yL水和20yL 5 X蛋白上樣緩沖液，100°C沸水煮沸10分鐘，SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物。 [0025] 3、重組蛋白的純化
[0026]將上述所得大腸桿菌總蛋白采用甘露糖親和層析柱純化獲得重組蛋白，并透析除 鹽。
[0027] 具體操作步驟如下：
[0028] 甘露糖親和層析柱純化獲得重組蛋白
[0029] (1)甘露糖親和層析柱，1 X 10cm，柱床體積為7mL;
[0030] (2)用TBS緩沖液（20mM Tris-base，150mM NaCl，pH 7.2)，平衡3~5個(gè)床體積，流 速為lmL min-S
[0031 ] (3)將菌體重懸于了85緩沖液（2〇111]\11^8^^86，15〇111]\1他(：14!17.2)中，超聲破 碎，并用〇. 45μπι濾膜過(guò)濾細(xì)胞裂解液，上樣，流速為lmL mirT1;
[0032] (4)TBS緩沖液l(20mM Tris-base，150mM NaCl，pH 7.2)洗 10個(gè)床體積，流速為lmL min-1;
[0033] (5)TBS緩沖液2(20mM Tris-base，150mM NaCl，200mM甘露糖，pH 7.2)洗脫，流速 為lmL mirT1，收集洗脫液，SDS-PAGE分離蛋白并進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，檢測(cè)融合蛋白的純化 效果。
[0034] (6)將純化蛋白加入透析袋(3kDa孔徑）中，置于雙蒸水中透析，每次透析4小時(shí)或 過(guò)夜，共透析4次，即得到長(zhǎng)牡蠣CgNatter in-3基因重組蛋白。
[0035]實(shí)施例2:長(zhǎng)牡蠣CgNatterin-3原核重組蛋白的病原相關(guān)分子模式結(jié)合活性分析 [0036]長(zhǎng)牡蠣CgNatterin-3結(jié)合病原相關(guān)分子模式的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA):將病 原相關(guān)分子模式脂多糖，肽聚糖，甘露聚糖和β-l，3-葡聚糖分別包被至96孔板(20yg/孔），4 °C過(guò)夜，后加入3%BSA于室溫封閉1小時(shí)。將CgNatterin-3蛋白溶于PBS緩沖液中，向每孔加 入不同濃度重組CgNatterin-3蛋白（10 · 00，5 · 00，2 · 50，1 · 25，0 · 63，0 · 32和0 · 16μΜ)，室溫孵 育1小時(shí)。PBSTUBS，0.1 % Tween-20)洗3次，加入大鼠來(lái)源的能夠識(shí)別CgNatterin-3蛋白的 抗體進(jìn)行孵育，室溫1小時(shí)，PBST(roS，0.1 %TWeen-20)洗3次，后用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二 抗進(jìn)行孵育，室溫1小時(shí)，PBST洗3次。加入辣根過(guò)氧化物酶底物進(jìn)行反應(yīng)，15分鐘后，加入2M 濃硫酸終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔反應(yīng)液在450nm處吸光值(參見(jiàn)圖1)。
[0037]結(jié)果如圖1所示，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)表明，CgNatterin-3對(duì)脂多糖、肽聚糖、甘露聚 糖和β-1，3-葡聚糖具有較高的結(jié)合活性。其中A是CgNatterin-3與脂多糖結(jié)合解離常數(shù)1.2 X 10-6M;B是CgNatterin-3與肽聚糖結(jié)合解離常數(shù)2.1 X 10-7M;C是CgNatterin-3與甘露聚 糖結(jié)合解離常數(shù)4.5 X 1(T8M;D是CgNatterin-3與β-l，3-葡聚糖結(jié)合解離常數(shù)1.6 X 10-7Μ。 [0038]實(shí)施例3:長(zhǎng)牡^CgNatterin-3結(jié)合和凝集細(xì)菌及真菌的活性分析
[0039] 將培養(yǎng)的燦爛弧菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌，耶羅維亞酵母和 畢赤酵母進(jìn)行離心收集，4%多聚甲醛固定30分鐘，PBS洗滌菌體3次，并將菌體重懸于含有 FITC(終濃度0. lmg mL-〇的0.01M NaHC03溶液中，避光孵育1小時(shí)。PBS洗滌3次，然后將菌重 懸于PBS中。CgNatterin-3與不同菌體分別室溫孵育1小時(shí)。PBS洗滌3次，加入大鼠來(lái)源的能 夠識(shí)別CgNatterin-3蛋白的抗體，室溫孵育1小時(shí)。PBS洗滌3次，加入綠色熒光標(biāo)記二抗，室 溫孵育1小時(shí)。PBS洗滌3次，分別用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)CgNatterin-3對(duì)不同菌的 凝集和結(jié)合效果(參見(jiàn)圖2)。
[0040] 結(jié)果如圖2顯示，CgNatterin-3能夠顯著性結(jié)合并凝集燦爛弧菌、大腸桿菌、金黃 色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌，耶羅維亞酵母和畢赤酵母。其中，A表示CgNatterin-3能夠凝集 革蘭氏陰性菌燦爛弧菌、大腸桿菌，革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌，真菌耶 羅維亞酵母和畢赤酵母。B表示CgNatterin-3能夠結(jié)合革蘭氏陰性菌燦爛弧菌、大腸桿菌，
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種長(zhǎng)牡·〇8ΝΒ??θ；Γ；?η-3基因重組蛋白的應(yīng)用，其特征在于：所述重組蛋白 CgNa 11 er i η-3在作為病原菌識(shí)別制劑中的應(yīng)用。2. 按權(quán)利要求1所述的長(zhǎng)牡蠣CgNatterin-3基因重組蛋白的應(yīng)用，其特征在于:所述長(zhǎng) 牡·〇8Να??θ；τ;?η-3基因重組蛋白的制備： (1)以長(zhǎng)牡蠣CgNatterin-3編碼區(qū)為模板，采用Ρ1和Ρ2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，待用； 所述引物P1 和P2分別為PI:5'-ATGGCAGAGTGGGTATC-3' ； P2:5 '-CTAAATGACTTTATACAG-3 '； (2 )PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與將pEASY-El載體通過(guò)T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化，測(cè)序鑒定重組子； (3)將上述構(gòu)建載體轉(zhuǎn)入TranSetta(DE3)表達(dá)菌株中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，而后純化，即得到 CgNatterin-3的重組蛋白。
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種長(zhǎng)牡蠣CgNatterin-3重組蛋白的應(yīng)用。本發(fā)明利用體外重組表達(dá)技術(shù)獲得了長(zhǎng)牡蠣CgNatterin-3重組蛋白，公開(kāi)了所述長(zhǎng)牡蠣CgNatterin-3基因重組蛋白的病原相關(guān)分子模式結(jié)合活性、病原菌識(shí)別及凝集活性。利用本發(fā)明獲得的重組蛋白可用于開(kāi)發(fā)病原菌識(shí)別制劑。
【IPC分類】G01N33/569, C12N15/70, G01N33/68
【公開(kāi)號(hào)】CN105510598
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201511025559
【發(fā)明人】王玲玲, 姜帥, 黃萌萌, 宋小瑞, 賈志浩, 宋林生
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院海洋研究所
【公開(kāi)日】2016年4月20日
【申請(qǐng)日】2015年12月31日