專利名稱:枯草芽孢桿菌pts-394的發(fā)酵培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種枯草芽孢桿菌PTS-394的發(fā)酵培養(yǎng)方法，尤其是一種利用Plackett-Burman法和響應(yīng)曲面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件后實(shí)現(xiàn)對(duì)枯草芽孢桿菌PTS-394的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
隨著種植業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，設(shè)施蔬菜種植面積逐年增加，高產(chǎn)、連作的設(shè)施蔬菜種植布局為病蟲(chóng)害提供了充裕的營(yíng)養(yǎng)和繁殖條件。近年來(lái)設(shè)施茄果類蔬菜土傳病害(青枯病、疫病、根結(jié)線蟲(chóng)等)頻繁暴發(fā)。青枯病是一種毀滅性土傳細(xì)菌病害，發(fā)病初期地上部分雖表現(xiàn)為萎垂但葉片仍保持綠色，故名“青枯”。青枯病是世界上危害最大、分布最廣、造成損失最嚴(yán)重的植物病害之一，被稱為植物的“癌癥”。在我國(guó)主要農(nóng)作物中以番茄、辣椒等茄科植物受青枯病的危害最為嚴(yán)重。一般田塊的發(fā)病率為10%-15%，重病田的發(fā)病率高達(dá)80%-100%。
目前，生產(chǎn)上防治設(shè)施茄·果類蔬菜青枯病主要依靠化學(xué)農(nóng)藥。這不僅造成生態(tài)環(huán)境嚴(yán)重污染，而且直接增加蔬菜中有毒化學(xué)物質(zhì)的殘留，對(duì)人類健康帶來(lái)嚴(yán)重危害。為了解決蔬菜產(chǎn)量和質(zhì)量之間矛盾，達(dá)到防治植物病害、減少化學(xué)農(nóng)藥的使用量的目的，使用生物防治控制植物病害的方法越來(lái)越受到各國(guó)政府和人民的關(guān)注。
江蘇省農(nóng)科院植保所篩選獲得的、對(duì)茄果類蔬菜青枯病有很好防效的枯草芽孢桿菌PTS-394，并于2011年11月I日申請(qǐng)了專利，公開(kāi)號(hào)為CN102550607A。其中公開(kāi)的形態(tài)特征記載為:菌株?duì)I養(yǎng)體為桿狀，兩端橢圓，周生鞭毛。大小為(0.7-0.8)微米X (2.0-3.0)微米。無(wú)莢膜。芽孢中生，橢圓形，大小為(0.6-0.9)微米X (1.0-1.5)微米?？莶菅挎邨U菌PTS-394在牛肉汁蛋白胨瓊脂平板上培養(yǎng)時(shí)，菌落邊緣波浪形，米色，表面有皺褶。質(zhì)地為不透明狀，不產(chǎn)生色素。革蘭氏反應(yīng)陽(yáng)性。H2O2酶反應(yīng)陽(yáng)性，V.P.反應(yīng)陽(yáng)性。L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露醇利用為陽(yáng)性。淀粉水解、明膠液化、檸檬酸鈉利用、二羥基丙酮形成反應(yīng)也均為陽(yáng)性。此外，枯草芽孢桿菌PTS-394還具有許多優(yōu)良性能，如:有較廣的抑菌譜，對(duì)多種植物病原菌有很強(qiáng)的抑制作用；生長(zhǎng)速度快，適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)，能在土壤和植物表面定殖，并形成優(yōu)勢(shì)種群；誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗病性；分泌產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)。目前，江蘇省揚(yáng)州市綠源生物有限公司已生產(chǎn)了 200億枯草芽孢桿菌PTS-394活菌水劑。
枯草芽孢桿菌PTS-394活菌制劑中的菌含量是產(chǎn)品的一個(gè)重要技術(shù)和經(jīng)濟(jì)指標(biāo)。要提高發(fā)酵液中菌含量，就必須對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基成分及配比、培養(yǎng)條件各個(gè)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。
近年來(lái),研究人員利用Plackett-Burman(PB)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法可以快速?gòu)挠绊懸蛩刂泻Y選出對(duì)目標(biāo)值影響最大的關(guān)鍵因子，并能為爬坡實(shí)驗(yàn)指出方向和變化步長(zhǎng)，已廣泛應(yīng)用于微生物發(fā)酵培養(yǎng)基成分和工藝參數(shù)的篩選。響應(yīng)曲面法(Response Surface Method,RSM)是一種適用性強(qiáng)且簡(jiǎn)易可靠的統(tǒng)計(jì)學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化方法，是一種優(yōu)化生物過(guò)程的綜合技術(shù)。國(guó)內(nèi)已有許多關(guān)于采用響應(yīng)曲面法對(duì)微生物發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化的報(bào)道。
目前,利用Plackett-Burman法和響應(yīng)曲面法優(yōu)化獲得的以提高枯草芽孢桿菌PTS-394發(fā)酵菌液中活菌量為目的的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，未見(jiàn)諸報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于:針對(duì)目前枯草芽孢桿菌PTS-394活菌制劑中的菌含量較低的實(shí)際問(wèn)題，提供一種基于傳統(tǒng)的枯草芽孢桿菌PTS-394發(fā)酵培養(yǎng)方法，對(duì)其中的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，提高發(fā)酵液中菌含量。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:一種枯草芽孢桿菌PTS-394的發(fā)酵培養(yǎng)方法，包括在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種枯草芽孢桿菌PTS-394種子液，在搖床上發(fā)酵培養(yǎng)2d，其特征在于:發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源為玉米淀粉，氮源為大豆粉，影響菌含量預(yù)測(cè)值的三個(gè)關(guān)鍵因子為玉米淀粉、大豆粉和酵母粉，在發(fā)酵培養(yǎng)基中的三個(gè)關(guān)鍵因子含量依次為11.48 g/L、13.35 g/L和0.90 g/L,發(fā)酵培養(yǎng)條件中影響菌含量和抑菌圈直徑的三個(gè)關(guān)鍵因子為溫度、初始PH值和裝液量，它們?cè)诎l(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中選擇:溫度30.84°C，初始PH 6.93，裝液量65.15 mL/250mL。。
在本發(fā)明中:發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為:玉米淀粉11.48 g/L、大豆粉13.35 g/L和酵母粉0.90 g/L、CaC03 3 g，NaCl 0.5 g，魚粉10 g ;發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為65.15 mL/250mL,發(fā)酵培養(yǎng)基中接種枯草芽孢桿菌PTS-394的種子液后，初始pH 6.93，置于30.84°C，搖
床發(fā)酵培養(yǎng)。
在本發(fā)明中:發(fā)酵培養(yǎng)2d，發(fā)酵液中的菌含量為(6.38±0.16)E+10 cfu/mL，對(duì)青枯病菌抑菌圈直徑為32.12±0.08 mm。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:由于枯草芽孢桿菌PTS-394活菌制劑中的有效菌含量是產(chǎn)品的一個(gè)重要技術(shù)和經(jīng)濟(jì)指標(biāo)。本發(fā)明利用改良后的優(yōu)化培養(yǎng)基組分及配比和培養(yǎng)條件，提高枯草芽孢桿菌PTS-394發(fā)酵菌液中菌含量，為枯草芽孢桿菌PTS-394高效防治青枯病提供理論依據(jù)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1確定培養(yǎng)基碳源、氮源
枯草芽孢桿菌PTS-394的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(由公開(kāi)號(hào)為CN102550607A的專利申請(qǐng)中實(shí)施例3公開(kāi)):玉米粉20 g，豆餅粉10 g，大豆粉5 g，酵母粉1.5 g，CaCO3 3 g，NaCl 0.5g，魚粉 10 g，補(bǔ)水至 1000 mL, pH 7.5。
將上述基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的20 g/L玉米粉以蔗糖，可溶性淀粉，玉米淀粉，麥芽糖，乳糖，木糖6種不同碳源等量(20 g/L)替換，配成不同碳源的培養(yǎng)基。將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的10 g/L豆餅粉以大豆粉，胰蛋白胨，酵母浸粉，牛肉膏，蛋白胨，魚粉6種不同氮源等量(10g/L)替換，配成不同氮源的培養(yǎng)基。
將不同碳、氮源的培養(yǎng)基pH調(diào)中性后分裝，裝液量為100 mL/250 mL三角瓶，滅菌。以2%的接種量接種枯草芽孢桿菌PTS-394種子液(菌含量為2.11E+10 cfu/mL)后，置于28°C，150 rpm的搖床中搖培48 h，采用平板稀釋法檢測(cè)發(fā)酵液菌含量，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，取平均值。碳源、氮源篩選試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表I。
表I不同碳源、氮源對(duì)PTS-394發(fā)酵液菌含量的影響
權(quán)利要求
1.枯草芽孢桿菌PTS-394的發(fā)酵培養(yǎng)方法，包括在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種枯草芽孢桿菌PTS-394種子液，在搖床上發(fā)酵培養(yǎng)2d，其特征在于:發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源為玉米淀粉，氮源為大豆粉，影響菌含量預(yù)測(cè)值的三個(gè)關(guān)鍵因子為玉米淀粉、大豆粉和酵母粉，在發(fā)酵培養(yǎng)基中的三個(gè)關(guān)鍵因子含量依次為11.48 g/L、13.35 g/L和0.90 g/L，發(fā)酵培養(yǎng)條件中影響菌含量和抑菌圈直徑的三個(gè)關(guān)鍵因子為溫度、初始PH值和裝液量，它們?cè)诎l(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中選擇:溫度 30.84。。，初始 PH 6.93，裝液量 65.15 mL/250 mL。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的枯草芽孢桿菌PTS-394的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于:發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為:玉米淀粉11.48 g/L、大豆粉13.35 g/L和酵母粉0.90 g/L、CaCO3 3 g，NaCl 0.5 g，魚粉10 g ;發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為65.15 mL/250 mL，發(fā)酵培養(yǎng)基中接種枯草芽孢桿菌PTS-394的種子液后，初始pH 6.93，置于30.84°C，搖床發(fā)酵培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1 或2所述的枯草芽孢桿菌PTS-394的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于:發(fā)酵培養(yǎng)2d，發(fā)酵液中 的菌含量為(6.38±0.16)E+10 cfu/mL，對(duì)青枯病菌抑菌圈直徑為.32.12±0.08 mm。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種枯草芽孢桿菌PTS-394的發(fā)酵培養(yǎng)方法，包括在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種枯草芽孢桿菌PTS-394種子液，在搖床上發(fā)酵培養(yǎng)2d，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源為玉米淀粉，氮源為大豆粉，影響菌含量預(yù)測(cè)值的三個(gè)關(guān)鍵因子為玉米淀粉、大豆粉和酵母粉，在發(fā)酵培養(yǎng)基中的三個(gè)關(guān)鍵因子含量依次為11.48g/L、13.35g/L和0.90g/L，發(fā)酵培養(yǎng)條件中影響菌含量和抑菌圈直徑的三個(gè)關(guān)鍵因子為溫度、初始PH值和裝液量，它們?cè)诎l(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中選擇溫度30.84℃，初始PH6.93，裝液量65.15mL/250mL。
文檔編號(hào)C12R1/125GKCN103146613SQ201310081080
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月14日
發(fā)明者劉郵洲, 喬俊卿, 陳志誼, 王治林 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan