本發(fā)明涉及生物學領域，特別是涉及核酸檢測領域，更具體地說，是涉及egfr基因20外顯子t790m和c797s突變的檢測。

背景技術：

目前，肺癌被公認為是“癌中之王”。在我國，肺癌的死亡率是癌癥中上升速度最快的。肺癌中約80％是非小細胞肺癌(non-smallcelllungcancer，nsclc)。雖然傳統(tǒng)的化療和放療在肺癌治療中占主流，但因缺乏特異性，取得療效的同時也帶來較大的副作用，nsclc對其更為敏感，因此，人們急需研究新的治療方法。其中，分子靶向治療越來越受到重視，而以腫瘤細胞增殖分化相關的信號轉導通路的關鍵酶為作用靶點的藥物是nsclc治療的重要方向，表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor，egfr)成為目前最主要的靶點。

egfr基因位于人類的7號染色體短臂7p12～14區(qū)域，它由28個外顯子組成，成熟的含1186個氨基酸，相對分子質量為170kd，屬于受體絡氨酸激酶(tki)家族。egfr與配體結合后能導致其二聚體化和胞內區(qū)磷酸化，進而激活其下游的一系列信號通路，主要包括src/stat通路、pi3k/akt通路和ras-raf-mek-erk/mapk通路等，從而調控細胞的生長、分化、侵襲和抗凋亡等多個生理過程。

目前針對egfr的靶向治療已是國際腫瘤個體化治療領域的關注焦點，臨床上使用的egfr靶向藥物包括作用于egfr激酶區(qū)域的絡氨酸激酶抑制劑(egfr-tki)，如吉非替尼(gefitinib，又叫易瑞沙)和厄洛替尼(erlotinib，又叫特羅凱)；以及作用于egfr胞外域的單克隆抗體(mab)，如西妥昔單抗(cetuximab)和帕尼單抗(vectibix)。其中egfr-tki已被推薦為治療晚期nsclc患者的一線藥物，但在實踐中，egfr-tki并非對所有患者都有效，耐藥是其治愈肺癌的瓶頸。egfr基因20外顯子t790m突變是第一代tki常見耐藥突變。新一代治療，包括azd9291，靶向性地針對t790m突變，是一種新的nsclc治療方式。最近，egfr20外顯子c797s突變(c.2389t>a和c.2390g>c)被定義為第三代tki的耐藥突變。對于第三代tki耐藥的nsclc患者的治療來講，尋找一種高敏感度的方法來檢測c797s和t790m突變顯得十分重要。

目前egfr突變檢測一般采用的是組織。組織活檢對于一些不適合手術的患者，就需要進行穿刺活檢。然而存在腫瘤的位置較為特殊不適合穿刺，或者患者對于穿刺不耐受的情況，而且更嚴重的是，穿刺會對腫瘤進一步刺激，容易激發(fā)癌細胞的快速增長或誘發(fā)轉移。這些情況下，液體活檢是組織活檢的替代方案，可以精確反映腫瘤實時信息，達到指導用藥、療效和耐藥監(jiān)測等目的。液態(tài)活檢的研究對象主要包括外周血循環(huán)中存在的循環(huán)腫瘤細胞(ctcs)、游離dna(cfdna)和外泌體三大類。循環(huán)腫瘤dna(ctdna)，是指腫瘤細胞釋放的、帶有腫瘤信息的dna片段，是血漿游離dna的一部分。ctdna在cfdna中的比例波動范圍較大(0.01％～90％)，受腫瘤分期、轉移等影響，大部分在千分之幾的數(shù)量級，導致cfdna中能檢測到的腫瘤突變頻率很低。因此，需要開發(fā)出靈敏度高、快捷、無創(chuàng)、方便的生物分子檢測手段。

微滴式數(shù)字pcr是一種核酸分子絕對定量的方法。微滴發(fā)生器將含有核酸分子模板的熒光反應體系分割成數(shù)萬個納升級的微滴，核酸分子在各微滴中隨機分裝，每個微滴不含或者至少含一個待檢核酸靶分子，而且每個微滴都是一個獨立的pcr反應器。經(jīng)過pcr擴增之后，對每個微滴進行檢測，有熒光信號的微滴判讀為“1”，沒有熒光信號的微滴判讀為“0”，最終根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴比例，給出待檢測靶分子的拷貝數(shù)濃度。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術問題之一是提供一種特異性擴增egfr基因20外顯子t790m和c797s位點的引物對。

為解決上述技術問題，本發(fā)明的特異性擴增egfr基因20外顯子t790m和c797s位點的引物對，包括正向引物和反向引物，所述正向引物具有如seqidn0:1所示的序列，所述反向引物具有如seqidn0:2所示的序列。

本發(fā)明要解決的技術問題之二是提供一種特異性檢測egfr基因20外顯子t790m和c797s位點的探針組。

為解決上述技術問題，本發(fā)明的特異性檢測egfr基因20外顯子t790m和c797s位點的探針組，包含有：檢測t790m位點的野生型探針，序列如seqidno:3所示；檢測t790m位點的突變型探針，序列如seqidno:4所示；檢測c797s位點的野生型探針，序列如seqidno:5所示；檢測c797s位點的c.2389t>a和c.2390g>c突變型探針，序列分別如seqidno:6和seqidno:7所示。所述探針的5’端帶有熒光報告基團，3’端帶有小溝結合物和非熒光淬滅基團。

本發(fā)明要解決的技術問題之三是提供一種檢測egfr基因20外顯子t790m和c797s位點突變的試劑盒，該試劑盒包含有上述引物對和探針組。

所述試劑盒還可以進一步包含有ddpcr核酸擴增試劑混合物、陰性對照和陽性對照。所述陰性對照為野生型質粒，所述陽性對照為突變型質粒。

本發(fā)明要解決的技術問題之四是提供一種檢測egfr基因20外顯子t790m和c797s突變的方法。

為解決上述技術問題，本發(fā)明的檢測egfr基因20外顯子t790m和c797s突變的方法，包括以下步驟：

1)提取樣本dna；

2)以步驟1)提取的樣本dna為模板，使用上述引物對和探針組，進行微滴式數(shù)字pcr擴增反應；

3)根據(jù)熒光信號判斷dna模板中是否含有egfr基因20外顯子t790m和c797s突變，計算突變的dna模板的數(shù)量和含量。

所述步驟2)的pcr擴增體系中，正向引物和反向引物的最終濃度分別為800～1000nm，優(yōu)選900nm；各探針的最終濃度分別為200～400nm，優(yōu)選250nm。

pcr擴增反應條件優(yōu)選為：95℃10分鐘；94℃30秒，60℃1分鐘，共40個循環(huán)；98℃10分鐘；12℃持續(xù)。

相比現(xiàn)有檢測方法，本發(fā)明的egfr基因20外顯子t790m和c797s突變檢測方法，具有以下優(yōu)點和有益效果：

1.使用taqmanmgb探針，并在3’端采用非熒光性的淬滅基團，由于非熒光性的淬滅基團吸收熒光報告基團的能量后不發(fā)光，因此大大降低了本底信號的干擾。

2.taqmanmgb探針的3’端連接小溝結合物，可以大大穩(wěn)定探針和模板的雜交，提高探針的tm值，使較短的探針同樣能達到較高的tm值，并且短探針的熒光報告基團和淬滅基團的距離更近，淬滅效果更好，熒光背景更低，從而提高了檢測的靈敏度(突變檢出率可達到0.02％)，可以對egfr基因t790m突變和c797s突變進行突變頻率的準確檢測，并能檢測出低頻突變。

3.應用范圍廣，不僅適用于腫瘤組織、石蠟包埋組織來源的核酸檢測，而且適用于低濃度的血液循環(huán)游離核酸中的egfr基因t790m突變和c797s突變的檢測，可用于非小細胞肺癌病人靶向用藥如易瑞沙、特羅凱、wz4002、co-1686和azd9291等的評估、病情監(jiān)測和預后評估，為臨床提供有效的指導。

附圖說明

圖1為檢測egfr基因t790m突變陽性對照的檢測結果。

圖2為檢測egfr基因t790m突變陰性對照的檢測結果。

圖3為檢測egfr基因t790m突變靈敏度線性擬合圖。

圖4為檢測egfr基因c797s突變陽性對照的檢測結果。

圖5為檢測egfr基因c797s突變陰性對照的檢測結果。

圖6為檢測測egfr基因c797s突變靈敏度線性擬合圖。

具體實施方式

為對本發(fā)明的技術內容、特點與功效有更具體的了解，現(xiàn)結合附圖和具體實施例，對本發(fā)明作進一步詳細的說明。

實施例1egfr基因20外顯子t790m和c797s的突變檢測

1.設計并合成引物和探針

從ncbi上搜索到人egfr(nm_005228)基因的dna序列，設計并合成能分別擴增出egfr基因20外顯子t790m和c797s位點位置的引物和相應的taqman探針。

其中，所述引物包括正向引物和反向引物，序列分別為：

正向引物：5’-gcctgctgggcatctg-3’(seqidno:1)

反向引物：5’-tctttgtgttcccggacatagtc-3’(seqidno:2)

所述探針包括與野生型模板dna結合的野生型探針和與突變型模板dna結合的突變型探針，序列分別為(其中，vic和fam為熒光報告基團，mgb為小溝結合物，nfq為非熒光淬滅基團)：

檢測t790m位點的野生型探針：5’-vic-atgagctgcgtgatgag-mgb-nfq-3'(seqidno:3)

檢測t790m位點的突變型探針：5’-fam-atgagctgcatgatgag-mgb-nfq-3'(seqidno:4)

檢測c797s位點的野生型探針：5′-vic-ttcggctgcctcctg-mgb-nfq-3′(seqidno:5)

檢測c797s位點的突變型(c.2389t>a)探針：5′-fam-ttcggcagcctcc-mgb-nfq-3′(seqidno:6)

檢測c797s位點的突變型(c.2390g>c)探針：5′-fam-cttcggctccctcctg-mgb-nfq-3′(seqidno:7)

2.制備陰性(野生型)對照質粒和陽性(突變型)對照質粒

(1)制備陰性對照質粒

以293t質粒為模板，以前述正向引物和反向引物為pcr引物，進行pcr擴增反應。

pcr擴增反應體系：2×kapahifihsreadymix5μl，10μm正向引物0.5μl，10μm反向引物0.5μl，模板20～40ng，加水至10μl。

pcr擴增條件：95℃3分鐘；95℃10秒，68℃15秒，72℃1分鐘，共25個循環(huán)；72℃2分鐘；12℃保持。

pcr擴增反應結束后，在pcr原液中加入0.2μl的taqextra酶，使pcr產(chǎn)物加上“a”接頭，然后進行t克隆。待測序結果正確后進行菌種保存，并提取陰性對照質粒。

(2)制備陽性對照質粒

以上述提取的相應陰性對照質粒為模板，以前述正向引物和反向引物為pcr引物，進行pcr擴增反應。pcr擴增體系和條件同上述陰性對照質粒的制備。

擴增結束后，在pcr原液中加入0.2μl的taqextra酶，使pcr產(chǎn)物加上“a”接頭，然后進行t克隆。待測序結果正確后進行菌種保存，并提取陽性對照質粒。

3.假陽性實驗

將構建的野生型質粒分別稀釋到600拷貝/μl和2000拷貝/μl，備用。

按以下配比配制pcr擴增反應體系：2xddpcr預混液10μl，10μm正向引物1.8μl，10μm反向引物1.8ul，10μm野生型探針0.5μl，10μm突變型探針0.5μl，模板(稀釋的野生型質粒檢測樣本)5μl，加水至20μl。

將配制好的pcr擴增反應液加入到8道微滴制作板內，然后加入70μl微滴生成油，用qx200微滴生成器制備pcr微滴反應液。將制備好的pcr微滴反應液加入96孔pcr板中，并用封膜板進行熱封膜。然后將96孔pcr板放入pcr儀器中進行擴增。

pcr擴增條件：95℃10分鐘；94℃30秒，60℃1分鐘，共40個循環(huán)；98℃10分鐘；12℃保持。

pcr擴增結束后，將pcr板放置在微滴信號讀取儀器(qx200dropletreader)上，檢測fam和vic熒光信號，用qunatasoft軟件計算突變dna的絕對含量以及比例。

野生型質粒樣本每種濃度重復檢測四次。檢測結果顯示：

純野生型探針投入3000拷貝，t790m點突變信號平均出現(xiàn)0.6拷貝，3sd為1.5拷貝；c797s點突變(c.2389t>a和c.2390g>c)信號平均出現(xiàn)0拷貝，3sd為0拷貝。即樣本dna投入10ng，t790m點突變信號檢出在1.5拷貝以上為檢出陽性；c797s點突變信號檢出在0拷貝以上為檢出陽性。

純野生型探針投入10000拷貝，t790m點突變信號平均出現(xiàn)1拷貝，3sd為1.8拷貝；c797s點突變(c.2389t>a和c.2390g>c)信號平均出現(xiàn)0拷貝，3sd為0拷貝。即樣本dna投入30ng，t790m點突變信號檢出在1.8拷貝以上為檢出陽性；c797s點突變信號在0拷貝以上為檢出陽性。

4.t790m和c797s突變檢測

1)提取樣本dna

采集5例非小細胞肺癌患者的組織樣本及其配對的術前血漿樣本。

組織樣本的dna采用unigenedx試劑盒進行抽提，血漿樣本的dna(cfdna)用thermo血漿游離dna試劑盒抽提，抽提后進行定量，并保存于-80℃的冰箱內。

2)以步驟1)提取的樣本dna為模板，分別用qx200ddpcr系統(tǒng)進行微滴式數(shù)字pcr擴增反應。

pcr擴增反應體系為：2xddpcr預混液(即ddpcr核酸擴增試劑混合物)10μl，10μm正向引物1.8μl，10μm反向引物1.8μl，10μm野生型探針0.5μl，10μm突變型探針0.5μl，dna模板1μl(dna30ng/μl；cfdna10ng/μl)，用水補足20μl。

將上述pcr擴增反應體系加入到8道微滴制作板內，加入70μl微滴生成油，用qx200微滴生成器制備pcr微滴反應液。將制備好的pcr微滴反應液加入96孔pcr板中，用封膜板進行熱封膜后，將96孔pcr板放入pcr儀中進行擴增反應。

pcr擴增反應條件為：95℃10分鐘；94℃30秒，60℃1分鐘，共40個循環(huán)；98℃10分鐘；12℃保持。

3)放入qx200dropletreader讀取熒光信號，根據(jù)不同的熒光信號類型判斷模板中是否含有egfr基因20外顯子t790m和c797s點突變，用qunatasoft軟件計算確定egfr基因20外顯子t790m和c797s點突變的dna模板的數(shù)量和含量。結果如表1所示。

表1非小細胞肺癌患者組織和血漿樣本t790m和c797s突變檢測結果

表1結果顯示，使用本發(fā)明的方法可以檢測組織樣本和血漿樣本是否存在egfr基因20外顯子t790m和c797s點突變，并且組織樣本和血漿樣本檢出結果符合率為100％。

實施例2檢測靈敏度(突變檢出率)實驗

1)將實施例1構建的突變型質粒和野生型質粒分別按以下比例混合備用：1:20；1:50；1:100；1:200；1:500；1:1000；1:5000。

2)按照以下配比配制pcr擴增反應液：2xddpcr預混液10μl，10μm正向引物1.8μl，10μm反向引物1.8μl，10μm野生型探針0.5μl，10μm突變型探針0.5μl，dna模板5μl(30ng，10000拷貝)，加水至20μl。

3)將配制好的pcr擴增反應液加入到8道微滴制作板內，然后加入70μl微滴生成油，用qx200微滴生成器制備pcr微滴反應液。將制備好的pcr微滴反應液加入96孔pcr板中，并用封膜板進行熱封膜。

4)將96孔pcr板放入pcr儀器中進行擴增，擴增條件為：95℃10分鐘；94℃30秒，60℃1分鐘，共40個循環(huán)；98℃10分鐘；12℃保持。

5)pcr擴增結束后，將pcr反應板放置在微滴信號讀取儀器(qx200dropletreader)上，收集fam和vic熒光信號。用qunatasoft軟件計算突變dna的絕對含量以及比例。

結果參見圖3、6所示，投入30ngdna，egfr基因t790m突變和c797s突變的檢出拷貝數(shù)比例(即檢測靈敏度)均為0.02％。

<110>上海捷易生物科技有限公司

<120>檢測egfr基因20外顯子t790m和c797s突變的引物、探針及方法

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