本發(fā)明涉及基因檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種brca1/2基因檢測(cè)文庫(kù)的構(gòu)建方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
：根據(jù)國(guó)家癌癥中心在《臨床醫(yī)師癌癥雜志》上公布的2015年癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，中國(guó)婦女卵巢癌年發(fā)病5.21萬(wàn)例，年死亡2.25萬(wàn)例，死亡率約為43％，為婦科三大腫瘤之首。乳腺癌年發(fā)病27.2萬(wàn)例，年死亡7.07萬(wàn)例，死亡率約為26％。另外，美國(guó)癌癥學(xué)會(huì)研究顯示，i型乳腺癌的患者5年生存率達(dá)到88％，iv型乳腺癌的5年生存率只有15％，這說(shuō)明級(jí)別越高，生存率越低；發(fā)現(xiàn)越早，生存率越高。因此，采用合理的預(yù)防措施對(duì)于乳腺癌及卵巢癌的“早發(fā)現(xiàn)，早診斷，早治療”具有重要意義。隨著人類(lèi)基因密碼的解開(kāi)，愈來(lái)愈多的疾病被發(fā)現(xiàn)與遺傳因子有關(guān)，尤其對(duì)于癌癥而言，遺傳物質(zhì)的差異對(duì)疾病的發(fā)生率、疾病的臨床過(guò)程、以及對(duì)不同治療的反應(yīng)程度都將有一定程度的影響?；蜃鳛檫z傳信息的記錄體和傳遞者可以反映出個(gè)體腫瘤的遺傳攜帶情況并用于評(píng)估個(gè)體易感風(fēng)險(xiǎn)。brca1/2是兩種具有抑制惡性腫瘤發(fā)生的基因，在調(diào)節(jié)人體細(xì)胞的復(fù)制、遺傳物質(zhì)dna損傷修復(fù)、細(xì)胞的正常生長(zhǎng)方面有重要作用。目前在esmo及nccn指南中對(duì)于乳腺癌和卵巢癌高危人群進(jìn)行brca1/2基因檢測(cè)均有推薦。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，約有5％～10％的乳腺癌和10～18％的卵巢癌是由生殖系brca1/2突變引起的。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約有50％的遺傳性乳腺癌和90％的遺傳性卵巢癌有生殖細(xì)胞上的brca1突變；約有40％的遺傳性乳腺癌和5％～10％的遺傳性卵巢癌伴有brca2的突變。在家族遺傳性乳腺癌和/或卵巢癌患者親屬中，brca1攜帶者、brca2攜帶者和非brca1/brca2攜帶者的比例分別約為65％、75％、43.5％。此外，一項(xiàng)綜合研究調(diào)查結(jié)果表明：在brca1突變攜帶者中，70歲時(shí)發(fā)生乳腺癌的機(jī)率為65％，發(fā)生卵巢癌的機(jī)率為39％；在brca2突變攜帶者中，70歲時(shí)發(fā)生乳腺癌的和卵巢癌的機(jī)率分別為45％和11％。因此，brca1/2基因突變檢測(cè)對(duì)于高危人群乳腺癌和卵巢癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有積極的作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)多聚adp-核糖聚合酶(parp)抑制劑可以通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞dna損傷修復(fù)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而增強(qiáng)放療以及烷化劑和鉑類(lèi)藥物化療的療效。不僅如此，parp抑制劑作為單藥對(duì)brca突變的患者也有顯著療效。由于brca有害突變的癌癥患者體內(nèi)基因重組功能已經(jīng)缺失，再通過(guò)parp抑制劑抑制dna的修復(fù)，就可以通過(guò)協(xié)同致死作用殺死腫瘤細(xì)胞。2014年12月，fda已經(jīng)批準(zhǔn)parp抑制劑奧拉帕尼(olaparib)單藥治療brca1/2有害胚系突變的晚期卵巢癌患者。另外還有其他多種parp抑制劑在臨床第一、二、三期科研階段。檢測(cè)brca基因的突變可以指導(dǎo)未來(lái)parp抑制劑的合理用藥。因此，進(jìn)行brca1/2的基因突變檢測(cè)尤其對(duì)于卵巢癌的“早發(fā)現(xiàn)，早診斷，早治療”具有重要的臨床意義。brca1/2基因大、序列長(zhǎng)。根據(jù)bic數(shù)據(jù)庫(kù)(breastcancerinformationcore,http://research.nhgri.nih.gov/bic/)，brca1/2基因目前已報(bào)道的變異類(lèi)型包括無(wú)義突變、移碼突變、非移碼插入、非移碼缺失、錯(cuò)義突變、同義突變、剪接位點(diǎn)突變，以及發(fā)生在非翻譯區(qū)和內(nèi)含子區(qū)域的突變，涉及到近4000個(gè)變異位點(diǎn)，而這些突變多數(shù)基本上散布于各個(gè)外顯子，沒(méi)有證據(jù)表明存在突變熱點(diǎn)區(qū)域，只存在少數(shù)幾個(gè)相對(duì)高頻的變異位點(diǎn)。如果采用傳統(tǒng)的sanger測(cè)序或qpcr檢測(cè)的方法來(lái)對(duì)brca1/2整個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)，則需要耗費(fèi)大量的時(shí)間且價(jià)格不菲。相比之下，二代測(cè)序技術(shù)可則更為高效快速且價(jià)格低廉的，可以一次性對(duì)brca1/2基因整個(gè)外顯子及鄰近內(nèi)含子進(jìn)行變異檢測(cè)，變異類(lèi)型可包括點(diǎn)突變(snp)、插入缺失(indel)、基因融合及拷貝數(shù)變化(cnv)，檢測(cè)十分全面。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)合sanger測(cè)序檢測(cè)brca1/2突變，以myriadgenetics公司的bracanalysiscdx試劑盒為例，根據(jù)檢測(cè)目標(biāo)設(shè)計(jì)大量引物對(duì)對(duì)血液來(lái)源gdna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，從而對(duì)brca1/2基因進(jìn)行富集，隨后采用一代測(cè)序法進(jìn)行檢測(cè)，再根據(jù)已知的原始序列找出對(duì)應(yīng)的突變。針對(duì)不同的變異類(lèi)型如單核苷酸變異、短片段插入缺失與大片段缺失或重復(fù)，需要設(shè)計(jì)不同的引物。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)合sanger測(cè)序檢測(cè)brca1/2突變存在很大局限性，表現(xiàn)在：該方法更適合于候選致病位點(diǎn)明確的疾病，而對(duì)于候選基因或位點(diǎn)數(shù)目較多的大樣本病例篩查是難以完成的，該方法本身是高成本、高人工投入的。另外，sanger測(cè)序不能檢測(cè)出大片段缺失或拷貝數(shù)變異等基因突變的類(lèi)型；對(duì)于連續(xù)多個(gè)堿基的小片段插入、缺失檢出準(zhǔn)確度下降或者不能檢出；檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜，同一次檢測(cè)中單核苷酸變異、短片段插入缺失與大片段缺失與重復(fù)需要兩次pcr反應(yīng)單獨(dú)檢測(cè)。二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)brca1/2突變，需要制備二代測(cè)序文庫(kù)。制備文庫(kù)中的基因組dna片段化方法主要是通過(guò)物理打斷或化學(xué)打斷來(lái)實(shí)現(xiàn)的。物理打斷需要借助打斷儀，基于超聲剪切原理可將dna打斷成100-1500bp片段；化學(xué)打斷法主要依賴(lài)于酶打斷法，經(jīng)酶打斷后能產(chǎn)生100-800bp的片段。dna雙鏈片段化利用的是一種時(shí)間依賴(lài)型酶，根據(jù)不同的反應(yīng)時(shí)間，將雙鏈dna切割成100-800片段。文庫(kù)構(gòu)建一般需要分步驟進(jìn)行，物理打斷法及常規(guī)的酶打斷法進(jìn)行片段化后需要進(jìn)一步通過(guò)凝膠電泳或磁珠選擇合適大小的片段篩選，隨后進(jìn)行末端修復(fù)、加a、加接頭等步驟，步驟多且繁瑣，操作時(shí)間長(zhǎng)，容易造成污染。通過(guò)物理打斷法對(duì)dna進(jìn)行打斷需要投入打斷儀，增加建庫(kù)成本、儀器維護(hù)成本以及人工操作成本，而且打斷需求的原始進(jìn)樣體積較大。因此必須要經(jīng)過(guò)磁珠純化富集dna片段，才能進(jìn)行后續(xù)的建庫(kù)步驟，進(jìn)一步增加了人工操作及片段損失。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種brca1/2基因檢測(cè)文庫(kù)的構(gòu)建方法和試劑盒，建庫(kù)步驟簡(jiǎn)便快速，有效降低成本，減少工作量，變異類(lèi)型全面、準(zhǔn)確、通量高。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供一種brca1/2基因檢測(cè)文庫(kù)的構(gòu)建方法，包括：(1)在dna片段化及末端修復(fù)反應(yīng)體系中，在打斷酶、末端修復(fù)酶的作用下，將均一化的dna樣本片段化并末端修復(fù)；(2)在接頭連接體系中，在dna連接酶的作用下，將步驟(1)所得的產(chǎn)物與接頭序列連接；(3)以步驟(2)所得的接頭連接產(chǎn)物為模板，在dna聚合酶的作用下，使用接頭序列的引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增；(4)使用包含brca1/2基因的探針序列與步驟(3)的產(chǎn)物進(jìn)行雜交以捕獲含有上述brca1/2基因的dna片段，并洗脫以獲取雜交捕獲產(chǎn)物；(5)在單鏈環(huán)化體系中，在連接酶的作用下，使上述雜交捕獲產(chǎn)物的單鏈實(shí)現(xiàn)環(huán)化，得到上述brca1/2基因檢測(cè)文庫(kù)。進(jìn)一步地，上述接頭序列帶有用于區(qū)分不同dna樣本的條形碼序列，每一上述條形碼序列對(duì)應(yīng)一種dna樣本；相應(yīng)地，在步驟(3)之后，將來(lái)源于多個(gè)dna樣本的上述步驟(3)的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物混合在一起并純化，以用于步驟(4)中的雜交捕獲。進(jìn)一步地，在步驟(4)和步驟(5)之間，還包括：(4’)以步驟(4)所得的雜交捕獲產(chǎn)物為模板，在dna聚合酶的作用下，使用接頭序列的引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，以增加上述雜交捕獲產(chǎn)物的量。進(jìn)一步地，上述末端修復(fù)酶包括：klenow片段、taq酶和t4多聚核苷酸激酶；任選地，上述打斷酶為dna片段化酶。進(jìn)一步地，上述接頭序列按照5’端至3’端的順序如下所示：長(zhǎng)鏈序列：agtcggaggccaagcggtcttaggaagacaannnnnnnnnncaactccttggctcaca(seqidno：1)，其中nnnnnnnnnn表示上述條形碼序列；短鏈序列：ttgtcttcctaaggaacgacatggctacgatccgactt(seqidno：2)；相應(yīng)地，上述接頭序列的引物按照5’端至3’端的順序如下所示：上游引物：gaacgacatggctacga(seqidno：13)；下游引物：tgtgagccaaggagttg(seqidno：14)。進(jìn)一步地，步驟(4)的雜交之前先使用阻斷序列對(duì)步驟(3)的產(chǎn)物進(jìn)行處理，以阻斷非特異性結(jié)合；優(yōu)選地，上述阻斷序列至少包括：gaacgacatggctacga(seqidno：3)；和agtcggaggccaagcggtcttaggaagacaaaccaaatgatcaactccttggctcaca(seqidno：4)。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供一種brca1/2基因檢測(cè)文庫(kù)的構(gòu)建試劑盒，包括：(1)打斷酶、末端修復(fù)酶，用于在dna片段化及末端修復(fù)反應(yīng)體系中，將均一化的dna樣本片段化并末端修復(fù)；(2)接頭序列，用于在接頭連接體系中，在dna連接酶的作用下，與片段化并末端修復(fù)的產(chǎn)物進(jìn)行連接；(3)接頭序列的引物，用于以接頭連接產(chǎn)物為模板，在dna聚合酶的作用下進(jìn)行pcr擴(kuò)增；(4)包含brca1/2基因的探針序列，用于與來(lái)源于多個(gè)dna樣本的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的混合物進(jìn)行雜交以捕獲含有上述brca1/2基因的dna片段；(5)連接酶，用于連接接頭序列和上述片段化并末端修復(fù)的產(chǎn)物，以及用于在單鏈環(huán)化體系中，使雜交捕獲產(chǎn)物的單鏈環(huán)化。進(jìn)一步地，上述接頭序列帶有用于區(qū)分不同dna樣本的條形碼序列，每一上述條形碼序列對(duì)應(yīng)一種dna樣本。進(jìn)一步地，上述末端修復(fù)酶包括：klenow片段、taq酶和t4多聚核苷酸激酶；任選地，上述打斷酶為dna片段化酶。進(jìn)一步地，上述接頭序列按照5’端至3’端的順序如下所示：長(zhǎng)鏈序列：agtcggaggccaagcggtcttaggaagacaannnnnnnnnncaactccttggctcaca(seqidno：1)，其中nnnnnnnnnn表示上述條形碼序列；短鏈序列：ttgtcttcctaaggaacgacatggctacgatccgactt(seqidno：2)；相應(yīng)地，上述接頭序列的引物按照5’端至3’端的順序如下所示：上游引物：gaacgacatggctacga(seqidno：13)；下游引物：tgtgagccaaggagttg(seqidno：14)。進(jìn)一步地，還包括：阻斷序列，用于在上述雜交之前對(duì)來(lái)源于多個(gè)dna樣本的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的混合物進(jìn)行處理，以阻斷非特異性結(jié)合；優(yōu)選地，上述阻斷序列至少包括：gaacgacatggctacga(seqidno：3)；和agtcggaggccaagcggtcttaggaagacaaaccaaatgatcaactccttggctcaca(seqidno：4)。本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在如下至少一個(gè)方面：(1)本發(fā)明的建庫(kù)方法將酶法打斷和末端修復(fù)在一管內(nèi)一步完成，減少了磁珠純化操作，雜交前建庫(kù)步驟半天即可完成，因此建庫(kù)步驟簡(jiǎn)便快速，有效降低成本，減少工作量；(2)采用酶法打斷片段化dna替代傳統(tǒng)物理打斷方法，減少了儀器投入及維護(hù)成本，且節(jié)省了人力操作；(3)使用本發(fā)明方法構(gòu)建的文庫(kù)檢測(cè)brca1/2基因突變，檢測(cè)變異類(lèi)型全面、準(zhǔn)確、通量高、成本低；采用探針捕獲技術(shù)可一次性富集brca1/2基因全部外顯子及鄰近內(nèi)含子序列，結(jié)合二代測(cè)序技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)全面，包含多種變異類(lèi)型如突變、缺失、插入及拷貝數(shù)擴(kuò)增，不僅降低了人工及成本投入并且克服了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)合一代測(cè)序法難以檢測(cè)五個(gè)核苷酸以上的插入或缺失及拷貝數(shù)變異檢測(cè)準(zhǔn)確度低的缺點(diǎn)。(4)此外，本發(fā)明方法的具體實(shí)施例中對(duì)多個(gè)建庫(kù)步驟條件進(jìn)行優(yōu)化(例如pcr條件、磁珠純化條件等)，提高了對(duì)100-300bp小片段的富集，更加適合二代測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)，目標(biāo)片段富集效果更佳。附圖說(shuō)明圖1為包含本發(fā)明方法的一個(gè)基因檢測(cè)的詳細(xì)實(shí)施例流程圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例中一例陰性對(duì)照樣本(上圖)和一例陽(yáng)性樣本(下圖)的預(yù)建庫(kù)完成后的agilent2100質(zhì)控結(jié)果。具體實(shí)施方式下面通過(guò)具體實(shí)施方式結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。本發(fā)明旨在提供一種基于酶打斷單管快速建庫(kù)的方法，及該建庫(kù)方法在brca1/2基因突變檢測(cè)中的應(yīng)用，使用本發(fā)明的建庫(kù)方法，能夠一次捕獲brca1/2基因的全部外顯子及鄰近內(nèi)含子序列，一次性檢測(cè)突變、插入、缺失及拷貝數(shù)變異。本發(fā)明的建庫(kù)方法，采用酶打斷法進(jìn)行dna片段化，而且將dna片段化和末端修復(fù)在一個(gè)反應(yīng)管中一步完成，縮減了篩選純化次數(shù)，減少了片段損失。此外，對(duì)于捕獲前的pcr擴(kuò)增程序采用分步法進(jìn)行，更優(yōu)先富集目的片段，后續(xù)的純化也采用了同芯片雜交樣本混庫(kù)(pooling)純化的方法，大大節(jié)省了人力成本。圖1示出了包含本發(fā)明方法的一個(gè)基因檢測(cè)的詳細(xì)實(shí)施例流程圖，該流程包括四個(gè)階段：樣本制備；預(yù)文庫(kù)構(gòu)建；捕獲文庫(kù)構(gòu)建；測(cè)序及數(shù)據(jù)分析。本發(fā)明實(shí)施例的文庫(kù)構(gòu)建方法主要涉及預(yù)文庫(kù)構(gòu)建、捕獲文庫(kù)構(gòu)建兩個(gè)階段。需要說(shuō)明的是，圖1所示的流程顯示了整個(gè)詳細(xì)的基因檢測(cè)流程，而本發(fā)明的基因檢測(cè)文庫(kù)構(gòu)建方法僅是其中的部分步驟，因此本發(fā)明的方法并不受到圖1所示的流程的限制。具體而言，本發(fā)明的基因檢測(cè)文庫(kù)構(gòu)建方法包括：(1)在dna片段化及末端修復(fù)反應(yīng)體系中(圖1中1-tube單管反應(yīng)體系)，在打斷酶、末端修復(fù)酶的作用下，將均一化的dna樣本片段化并末端修復(fù)。末端修復(fù)酶可以包括klenow片段、taq酶和t4多聚核苷酸激酶。末端修復(fù)后的片段化dna兩端能夠與接頭序列連接，例如帶有突出a堿基的片段化dna與互補(bǔ)的接頭序列連接。(2)在接頭連接體系中，在dna連接酶的作用下，將步驟(1)所得的產(chǎn)物與接頭序列連接。需要說(shuō)明的是，在僅有單個(gè)樣本的情況下，接頭序列沒(méi)有什么特別要求；然而，在多個(gè)樣本進(jìn)行混合(pooling)測(cè)序的情況下，接頭序列需要帶有用于區(qū)分不同dna樣本的條形碼序列(barcode)，每一條形碼序列對(duì)應(yīng)一種dna樣本。條形碼序列可以是接頭序列上一段連續(xù)的特定堿基序列，例如隨機(jī)序列，其長(zhǎng)度可以是6-12個(gè)堿基，例如10個(gè)堿基。(3)以步驟(2)所得的接頭連接產(chǎn)物為模板，在dna聚合酶的作用下，使用接頭序列的引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增(圖1中pre-pcr擴(kuò)增)。經(jīng)過(guò)pcr擴(kuò)增以后的文庫(kù)稱(chēng)為預(yù)文庫(kù)，pcr擴(kuò)增能夠增加接頭連接產(chǎn)物的數(shù)量。(4)可選地，將來(lái)源于多個(gè)dna樣本的步驟(3)的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物混合在一起并純化。需要說(shuō)明的是，在僅有單個(gè)樣本的情況下，不需要這一步驟，因此這一步驟是可選的步驟。(5)使用包含brca1/2基因的探針序列與步驟(4)的產(chǎn)物進(jìn)行雜交以捕獲含有上述brca1/2基因的dna片段，并洗脫以獲取雜交捕獲產(chǎn)物。包含brca1/2基因的探針序列按照目前的序列捕獲原理，根據(jù)brca1/2基因的序列情況設(shè)計(jì)即可，這些探針序列可以承載在固體載體，例如芯片或磁珠上，用于雜交捕獲目標(biāo)brca1/2基因片段，并實(shí)現(xiàn)分離。(6)在單鏈環(huán)化體系中，在連接酶的作用下，使雜交捕獲產(chǎn)物的單鏈實(shí)現(xiàn)環(huán)化，得到brca1/2基因檢測(cè)文庫(kù)。熱變性的單鏈通過(guò)兩端連接形成環(huán)化dna，即可用于后續(xù)測(cè)序分析。作為進(jìn)一步改進(jìn)的方案，在步驟(5)和步驟(6)之間，還包括：(5’)以步驟(5)所得的雜交捕獲產(chǎn)物為模板，在dna聚合酶的作用下，使用接頭序列的引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增(圖1中post-pcr擴(kuò)增)，以增加雜交捕獲產(chǎn)物的量。由于純化過(guò)程中會(huì)造成片段的丟失，且環(huán)化受到環(huán)化效率的限制，得到的環(huán)化dna分子可能不足以進(jìn)行測(cè)序，在此情況下，進(jìn)行一步pcr擴(kuò)增，能夠提高dna分子的數(shù)量，以便有效地進(jìn)行測(cè)序。本發(fā)明實(shí)施例的建庫(kù)方法，采用酶打斷法片段化dna替代傳統(tǒng)物理打斷方法，不僅減少了儀器投入及維護(hù)成本，而且簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作，節(jié)約了人力與時(shí)間成本。dna片段化過(guò)程與末端修復(fù)及加a在一個(gè)反應(yīng)管中一步完成，減少了一般流程中片段化后需要片段篩選的步驟，更減少了片段損失。酶打斷及單管建庫(kù)的方法步驟簡(jiǎn)單，易于操作，降低成本節(jié)約時(shí)間的同時(shí)也降低了多次操作易引起的污染和損失。此外，該發(fā)明涉及的建庫(kù)方法中捕獲前的pcr擴(kuò)增程序采用分步法進(jìn)行，更優(yōu)先富集目的小片段。本發(fā)明實(shí)施例的建庫(kù)方法，采用探針捕獲方式能夠富集brca1與brca2基因的全部外顯子及鄰近內(nèi)含子序列，結(jié)合二代測(cè)序技術(shù)可一次性檢出brca1/2基因的突變、缺失、插入及拷貝數(shù)變異，不僅降低了人工及成本投入并且克服了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)合一代測(cè)序法，難以檢測(cè)五個(gè)核苷酸以上的插入或缺失及拷貝數(shù)變異檢測(cè)準(zhǔn)確度低的缺點(diǎn)。此外，備選采用無(wú)需pcr(pcr-free)的方法，即無(wú)需post-pcr擴(kuò)增的方法，對(duì)捕獲后的文庫(kù)直接進(jìn)行環(huán)化，減少了實(shí)驗(yàn)步驟的同時(shí)大大減少pcr擴(kuò)增可能引起的錯(cuò)誤引入。以下通過(guò)實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案和技術(shù)效果，應(yīng)當(dāng)理解，實(shí)施例僅是示例性的，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。實(shí)施例1本實(shí)施例采用8個(gè)樣本進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，采用包含brca1/2基因的nimblegen芯片進(jìn)行雜交捕獲并結(jié)合高通量測(cè)序儀bgiseq-500平臺(tái)檢測(cè)brca1/2基因snv、indel及cnv三種類(lèi)型變異。具體操作流程如下：1.樣本制備1.1樣本提取及定量：利用qiagen公司dna提取試劑盒從血液樣本及細(xì)胞系中提取gdna，取1μl進(jìn)行qubiths定量。超過(guò)100ng/μl的需要將樣本稀釋后重新定量，不足15ng/μl的用ampurexp磁珠純化回收的方法富集。1.2樣本均一化：每樣本分別取200ng用nf水(nuclease-freewater)稀釋到15μl，轉(zhuǎn)移到新的pcr管中，用于建庫(kù)。2.dna片段化和末端修復(fù)2.1試劑準(zhǔn)備：提前五分鐘在冰上配制如下反應(yīng)液，所需試劑如表1所示：表12.2pcr儀程序設(shè)置，如表2所示：表2步驟溫度時(shí)間步驟137℃20分鐘步驟275℃15分鐘步驟34℃鎖定設(shè)好程序后，點(diǎn)擊開(kāi)啟，再立即點(diǎn)擊暫停。確保在開(kāi)始dna片段化時(shí)溫度到達(dá)37℃。2.3將12μl步驟2.1中反應(yīng)液加入每個(gè)均一化后的樣本中，混勻，離心后馬上置于冰上。2.4將樣品置入pcr儀中反應(yīng)，重新啟動(dòng)反應(yīng)程序。3.ad153接頭連接3.1提前取出ad153接頭在冰上融化并提前五分鐘配制如下連接反應(yīng)液，成分如表3所示：表3試劑名稱(chēng)使用量/反應(yīng)atp(100mm)(life)1μlpnkbuffer(enzymatics)4.5μl連接酶(enzymatics)1.4μl50％peg8000(emeraldbiosystems)17μl補(bǔ)水至總量46μl3.2pcr儀設(shè)置，需預(yù)先設(shè)置程序，如表4所示：表4步驟溫度時(shí)間步驟123℃60分鐘步驟212℃鎖定3.3接頭連接操作：3.3.1在上一步反應(yīng)液按需要將帶有不同條形碼序列(barcode)的ad153接頭分裝到相應(yīng)樣本中，每個(gè)樣本中分別加入ad153接頭(10μm)4μl，移液器吹打數(shù)次。接頭序列見(jiàn)表5：表53.3.2再將46μl連接反應(yīng)液，加入到各個(gè)樣本中，混勻，離心。3.3.3將樣品置于pcr儀上反應(yīng)，點(diǎn)擊開(kāi)始。3.4反應(yīng)產(chǎn)物純化3.4.1提前半小時(shí)取出xpbeads于室溫平衡，混勻，備用。3.4.2連接反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管，每管中加入40μl的ampurexp磁珠；混勻，室溫靜置5分鐘。3.4.3瞬時(shí)離心，將離心管置于磁力架上，5-10分鐘后，待磁珠吸附完全，小心吸去上清，避免吸到磁珠。3.4.4離心管保持于磁力架上，在每管中加入400μl75％乙醇，移液器輕柔吹打(避免觸碰磁珠)或者上下顛倒磁力架來(lái)清洗磁珠數(shù)次，棄掉上清(避免吸取到磁珠)。3.4.5重復(fù)一次步驟3.4.4。3.4.6離心管取出瞬時(shí)離心再置于磁力架上，用小量程移液器吸去殘留乙醇，室溫晾干。3.4.7用21μl無(wú)酶水重懸磁珠，室溫結(jié)合5分鐘后置于磁力架上，小心吸出上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中。4.pre-pcr：4.1提前5分鐘取出ad153pcr引物和2×kapahifipolymerasemastermix，在冰上配制反應(yīng)液如表6所示：ad153pcr引物序列具體如下：ad153-f:gaacgacatggctacga(seqidno：13)；ad153-r:tgtgagccaaggagttg(seqidno：14)。表64.2pcr儀需預(yù)先設(shè)置程序，如表7所示：表74.3將30μl混勻后的pcr反應(yīng)液加入步驟3.4.7中的連接產(chǎn)物中，混勻，瞬時(shí)離心。4.4將樣品置于pcr儀上反應(yīng)，點(diǎn)擊開(kāi)始。4.5pcr產(chǎn)物純化：pcr反應(yīng)結(jié)束后用1.2倍xp磁珠純化pcr產(chǎn)物，21μl回收(具體純化操作參照步驟3.4)。5.預(yù)文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)5.1agilent2100檢測(cè)：用于判斷預(yù)文庫(kù)dna的片段大小，通過(guò)本實(shí)施例建立的預(yù)文庫(kù)dna的片段主要分布在100-250bp。需要注意的是，dna片段大小若小于100bp表明可能在片段化反應(yīng)中g(shù)dna的量太少；若大于300bp表明可能在片段化反應(yīng)中g(shù)dna的量太多，酶打斷不充分。圖2示出了本實(shí)施例中一例陰性對(duì)照樣本和一例陽(yáng)性樣本的預(yù)建庫(kù)完成后的agilent2100質(zhì)控結(jié)果，結(jié)果顯示文庫(kù)中目標(biāo)片段集中，大小符合預(yù)期要求。5.2qubit檢測(cè)：取1μl進(jìn)行qubiths定量檢測(cè)，判斷預(yù)文庫(kù)的濃度，用于混庫(kù)純化。雜交預(yù)文庫(kù)dna的總量應(yīng)≥200ng。6.雜交捕獲6.1雜交前混庫(kù)及純化：6.1.1每8個(gè)樣本為一組進(jìn)行混合，共1～3μg補(bǔ)水至160μl。6.1.2可選步驟：加入0.6倍(范圍可浮動(dòng))xp磁珠，靜止5min后，瞬時(shí)離心。將離心管置于磁力架上，待上清澄清，吸取上清于新的離心管中。再次加入0.6倍(范圍可浮動(dòng))xp磁珠進(jìn)行純化，21μl進(jìn)行回收。6.1.3取1μl進(jìn)行qubiths定量。6.2雜交反應(yīng)(使用nimblegen芯片)實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：6.2.1打開(kāi)95℃溫浴儀保持恒溫。6.2.2從-15℃到-25℃取出4.5μl探針，冰上解凍。6.2.3將準(zhǔn)備混合的pre-pcr文庫(kù)要盡量在冰上解凍。6.2.4將蒸干儀調(diào)至60℃，保持恒溫。6.2.5將pcr儀設(shè)置為47℃保持，需熱蓋溫度為57℃。6.2.6將水浴鍋調(diào)至47℃保持恒溫。操作流程：6.2.7每組混合樣本取1μg于新的1.5mlep管中，依次加入樣本處理體系c中的cot-1dna(nimblegen)及阻斷序列(block)，見(jiàn)表8。6.2.8放入60℃以上的蒸干儀中加熱蒸干。6.2.9在蒸干的管子中加入雜交緩沖液，見(jiàn)表8。6.2.10將ep管充分震蕩混勻，高速離心10s，95℃10min使dna變性。6.2.11將變性dna和4.5μl探針(液相探針，是針對(duì)性設(shè)計(jì)的包含brca1/2的nimblegen探針)一同轉(zhuǎn)入0.2ml管中。6.2.12震蕩3s，高速離心10s。6.2.13將樣本放于47℃pcr儀中保持24小時(shí)，熱蓋溫度為57℃(比雜交溫度高10℃)。表8阻斷序列如下表9：表97.洗脫使用nimblegen芯片配套的雜交洗脫試劑盒(seqcapezhybridizationandwashkit)，按照操作說(shuō)明，進(jìn)行洗脫，具體包括如下步驟：實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備7.1試劑準(zhǔn)備：7.1.1取40μl10xstringentwashbuffer(嚴(yán)格洗脫緩沖液)加入360μlpcr級(jí)水至1x。7.1.2取30μl10xwashbufferⅰ加入270μlpcr級(jí)水至1x。7.1.3取20μl10xwashbufferⅱ加入180μlpcr級(jí)水至1x。7.1.4取20μl10xwashbufferⅲ加入180μlpcr級(jí)水至1x。7.1.5取200μl2.5xbeadswashbuffer加入300μlpcr級(jí)水至1x。7.1.6將1x的stringentwashbuffer與washbufferi放入47℃水浴鍋中保持溫度。試劑分裝見(jiàn)下表10：表10試劑名稱(chēng)單個(gè)樣本用量(μl)1xwashbuffer#1(47℃)1201xstringentbuffer(47℃)4401xwashbuffer#1(rt)2201xwashbuffer#2(rt)2201xwashbuffer#3(rt)2207.2磁珠準(zhǔn)備：7.2.1磁珠使用之前室溫平衡30min，渦旋振蕩15s。7.2.2向新1.5mlep管中加入100μl磁珠，混勻后放在磁力架上，約5min后液體澄清吸棄上清，加入200μl1xbeadwashbuffer，渦旋振蕩10s，重新放到磁力架上，待液體澄清后將液體吸棄。重復(fù)洗滌一次。7.2.3用100μl1xbeadwashbuffer進(jìn)行重懸。將重懸好的磁珠轉(zhuǎn)入0.2ml管中，放置磁力架上，吸棄上清，余下的磁珠準(zhǔn)備結(jié)合捕獲到的dna。7.3雜交后洗脫：7.3.1在雜交體系中加入準(zhǔn)備好的磁珠，混勻。7.3.2混合物47℃45min，(熱蓋57℃)，每15min渦旋振蕩3s，總共振蕩3次。7.3.3轉(zhuǎn)管：加入100μl47℃1xwashbufferi，渦旋振蕩10s。將混合物從0.2ml管轉(zhuǎn)到1.5ml管，放在磁力架上，液體澄清后去上清。7.3.447℃洗脫：加入200μl47℃1xstringentwashbuffer，上下顛倒10次混勻后47℃反應(yīng)5min。重復(fù)洗滌一次，總共洗滌兩次。將管放置磁力架上，液體澄清后吸棄液體。7.3.4常溫洗脫：加200μl室溫1xwashbufferi渦旋振蕩2min，將管子放在磁力架上，吸棄上清。加200μl室溫1xwashbufferii，渦旋振蕩1min。將管子放在磁力架上，吸棄上清。加200μl室溫1xwashbufferiii，渦旋振蕩30s。將管子放在磁力架上，吸棄上清。7.3.5回收：將管子取下，每管加入95μlpcr級(jí)水回溶?；厝荏w積根據(jù)需要可以進(jìn)行調(diào)整。8.post-pcr8.1試劑準(zhǔn)備：提前10分鐘取出ad153pcr引物和2×kapahifipolymerasemastermix，配制反應(yīng)液，見(jiàn)表11：表118.2pcr儀需預(yù)先設(shè)置程序，如下表12：表128.3post-pcr反應(yīng)：將post-pcr反應(yīng)液加入步驟7.3.5中的重懸磁珠中，用移液器輕輕吹打混勻，不要產(chǎn)生氣泡，不離心，將其置于設(shè)置好的pcr儀中，點(diǎn)擊開(kāi)始。8.4post-pcr產(chǎn)物純化：反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管，瞬時(shí)離心，將離心管置于磁力架上，5-10分鐘后，待磁珠吸附完全，將上清全部轉(zhuǎn)移至新離心管中，每管中加入120μl的xp磁珠進(jìn)行純化。用41μl1×te(低edta，ph8.0)重懸磁珠，室溫結(jié)合5分鐘后置于磁力架上，小心吸出上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中。8.5取1μl進(jìn)行qubiths定量，濃度不應(yīng)少于4ng/μl。9.單鏈環(huán)化9.1配制環(huán)化反應(yīng)液，如表13所示：表139.2pcr儀預(yù)先設(shè)置程序，如表14所示：表14步驟溫度時(shí)間步驟195℃5分鐘步驟24℃鎖定9.3另一pcr儀需預(yù)先設(shè)置程序，如表15所示：表15步驟溫度時(shí)間步驟137℃20-30分鐘步驟212℃鎖定9.4取160ngpost-pcr產(chǎn)物，用1×te(低edta，ph8.0)定容至48ul，混勻。置于步驟9.2設(shè)置好的pcr儀中，點(diǎn)擊開(kāi)始。9.5將9.1步驟中配制的11.8μl環(huán)化反應(yīng)液加入到上述dna反應(yīng)液中，混勻，瞬時(shí)離心。將反應(yīng)管置于9.3步驟中設(shè)置好的在pcr儀中，點(diǎn)擊開(kāi)始。10.反應(yīng)完成，文庫(kù)出庫(kù)，進(jìn)行質(zhì)控檢測(cè)。11.上機(jī)進(jìn)行測(cè)序和數(shù)據(jù)分析本實(shí)施例采用nimblegen芯片雜交的8例樣本的具體檢測(cè)結(jié)果如下表16：表16結(jié)果顯示：7例陽(yáng)性樣本包括brca1/2無(wú)義突變、移碼突變及brca1的cnv變異均正確檢測(cè)，該結(jié)果與sanger檢測(cè)結(jié)果或qpcr檢測(cè)結(jié)果一致。說(shuō)明本實(shí)施例的建庫(kù)方法及試劑盒具有很好的檢測(cè)性能。實(shí)施例2本實(shí)施例采用8個(gè)樣本進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，采用包含brca1/2基因的bgi芯片進(jìn)行雜交捕獲并結(jié)合高通量測(cè)序儀bgiseq-500平臺(tái)檢測(cè)brca1/2基因snv、indel及cnv三種類(lèi)型變異。具體操作流程如下：步驟1至5同實(shí)施例1。6.雜交捕獲6.1雜交前混庫(kù)及純化：6.1.1每8個(gè)樣本為一組進(jìn)行混合，共1～3μg補(bǔ)水至160μl。6.1.2可選步驟：加入0.6倍(范圍可浮動(dòng))xp磁珠，靜止5min后，瞬時(shí)離心。將離心管置于磁力架上，待上清澄清，吸取上清于新的離心管中。再次加入0.6倍(范圍可浮動(dòng))xp磁珠進(jìn)行純化，21μl進(jìn)行回收。6.1.3取1μl進(jìn)行qubiths定量。6.2雜交反應(yīng)(使用bgi芯片)實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：雜交及洗脫試劑中以下組分可購(gòu)買(mǎi)自bgi雜交洗脫試劑(1rxn)hybrid&washreagent(1reaction)散裝貨號(hào)：85-05504-00，包括bgiblock#1、bgiblock#2、bgihyb#1(bgi)、bgihyb#2(bgi)、bgihyb#3(bgi)、bgihyb#4(bgi)、rnaseblock(bgi)、bindingbuffer(bgi)、washbuffer#1(bgi)、washbuffer#2(bgi)。6.2.1打開(kāi)95℃溫浴儀保持恒溫。6.2.2取出探針，冰上解凍。6.2.3將準(zhǔn)備混合的pre-pcr文庫(kù)要盡量在冰上解凍。操作流程：6.2.4在pcr管中進(jìn)行樣本處理體系和雜交反應(yīng)液制備，見(jiàn)表17。6.2.4.1按照表17配制的樣本處理體系，分別加入到上一步反應(yīng)純化得到的每組20μl的混庫(kù)(pooling)的樣本中，用移液器混合均勻，瞬間離心，95℃下孵育5min使dna變性，65℃恒溫保持。6.2.4.2按照表17配制雜交反應(yīng)液1，配好后置于已達(dá)到65℃的熱循環(huán)儀(熱蓋溫度為105℃)上孵育5分鐘以上，使其保持在65℃恒溫。6.2.4.3按照表17在冰上配制雜交反應(yīng)液2，放入已達(dá)到65℃的熱循環(huán)儀(熱蓋溫度為105℃)上孵育2分鐘以上，使其保持在65℃恒溫。表17注：①阻斷序列a和阻斷序列b同實(shí)施例1。阻斷序列a是標(biāo)簽阻斷序列(indexblock)，用來(lái)封閉標(biāo)簽(index)序列；阻斷序列b是接頭阻斷序列，主要是封閉與標(biāo)簽序列對(duì)應(yīng)的序列(一般在文庫(kù)單鏈的5'端)。它們的作用主要有兩個(gè)：封閉非捕獲區(qū)域，保證捕獲的特異性；以及保持被捕獲序列單鏈，即保證捕獲的特異性和多樣性。②panel設(shè)計(jì)原則：根據(jù)待檢測(cè)靶基因(如brca1/2)的特異性核酸序列合成初始探針。初始探針為一段特異性dna序列，兩側(cè)為擴(kuò)增片段。得到初始探針片段后，根據(jù)擴(kuò)增引物擴(kuò)增探針，隨后將擴(kuò)增后的雙鏈dna轉(zhuǎn)錄成單鏈rna，并添加生物素標(biāo)記。探針設(shè)計(jì)要求探針覆蓋待檢測(cè)基因組區(qū)域，探針長(zhǎng)度為個(gè)堿基，探針序列根據(jù)靶基因序列的正義鏈進(jìn)行設(shè)計(jì)；探針gc含量一般在20～80％范圍內(nèi)，探針兩端不存在互補(bǔ)結(jié)構(gòu)。③bgiblock#1與bgiblock#2是封閉一些同源性較高的非特異性序列，近似cot-1dna。cot-1dna通常作為dna競(jìng)爭(zhēng)性阻斷劑，在基因組雜交中阻斷可能引起非特異性雜交的重復(fù)序列。6.2.5保持所有pcr管在65℃，打開(kāi)pcr儀，迅速轉(zhuǎn)移13μl步驟6.2.4.2配制的雜交反應(yīng)液1到上述已加入6.2.4.1提到的混庫(kù)樣本的混合液中(每次只操作1組混庫(kù)樣本)，吹打數(shù)次混勻(勿引入氣泡)，蓋好管蓋，依次加完所有樣本，65℃孵育至少2分鐘。6.2.6保持所有pcr管在65℃，將步驟6.2.5中加好的混合反應(yīng)液，取39μl迅速轉(zhuǎn)移至對(duì)應(yīng)的雜交反應(yīng)液2的管中，移液器吹打5-10次混勻，蓋好管蓋，此時(shí)每個(gè)pcr管中反應(yīng)液體積為約46μl。依次加完所有樣本后從熱循環(huán)儀上移走空管，蓋好熱循環(huán)儀蓋(熱蓋溫度為105℃)，計(jì)時(shí)，保持樣本在65℃孵育雜交16-48小時(shí)(可以根據(jù)需要選擇時(shí)間，推薦16或24h)。7洗脫7.1提前2h將水浴鍋調(diào)至65℃，水溫穩(wěn)定后為每個(gè)雜交反應(yīng)準(zhǔn)備1.8mlbgiwashbuffer2置于水浴鍋中預(yù)熱；7.2用漩渦混合儀劇烈振蕩重懸dynabeadsm-280streptavidinbeads(life公司)至混勻；7.3每一個(gè)雜交反應(yīng)取50μldynabeadsm-280streptavidinbeads于一新的2.0ml離心管；7.4將200μlbgibindingbuffer加入磁珠中，用漩渦混合儀劇烈振蕩5秒鐘重懸磁珠；7.5將離心管置于磁力架上2min，待液體完全澄清；小心吸取并棄去上清；7.6重復(fù)步驟7.4到步驟7.5兩次；加入200μlbgibindingbuffer重懸磁珠；7.7經(jīng)16h孵育后，繼續(xù)保持雜交混合液于pcr儀上，逐一使用移液器快速吸取樣本(如果操作多個(gè)樣本，則可以完成6-8個(gè)反應(yīng)后關(guān)閉熱蓋5min，然后繼續(xù))；7.8從pcr儀中直接將全部雜交混合液轉(zhuǎn)移到準(zhǔn)備好的磁珠中，上下顛倒離心管3到5次直到混勻；7.9將裝有雜交混合液和磁珠的離心管對(duì)稱(chēng)的固定于垂直混勻儀或手工上下顛倒混勻，室溫下孵育30min；7.10將樣品從混勻裝置取下，瞬時(shí)離心5s確保管蓋上沒(méi)有液體殘留；7.11將2.0ml離心管轉(zhuǎn)移放置在磁力架上，靜置3-5min待液體完全澄清，小心吸取并棄去上清；7.12用500μlbgiwashbuffer1重懸磁珠，并于漩渦混合儀上振蕩5秒混勻樣品，室溫下孵育樣品15min；7.13將離心管瞬時(shí)離心3s，然后放置在磁力架上，靜置3-5min待液體完全澄清，小心吸取并棄去上清；7.14用500μl預(yù)熱至65℃的bgiwashbuffer2重懸磁珠，并于漩渦混合儀上振蕩5秒以混勻樣品，將其置于恒溫混合儀中65℃孵育10min；7.15顛倒離心管以混勻樣品，瞬時(shí)離心3s，然后將其放置在磁力架上，靜置3-5min待液體完全澄清，小心吸取并棄去上清；7.16重復(fù)步驟7.14到步驟7.15兩次；7.17用45μl無(wú)核酸酶的水重懸磁珠；也可以根據(jù)需要調(diào)整回溶體積。步驟8至11同實(shí)施例1。本實(shí)施例采用bgi芯片雜交的8例樣本的具體檢測(cè)結(jié)果如下表18：表18樣本名稱(chēng)突變類(lèi)型基因檢出變異陽(yáng)性標(biāo)品g移碼突變brca1c.[1201delg]陽(yáng)性標(biāo)品h移碼突變brca1c.[797_798deltt]陽(yáng)性標(biāo)品i移碼突變brca1c.[3751_3754deltgtc]陽(yáng)性標(biāo)品j移碼突變brca2c.[6198_6199deltt]陽(yáng)性標(biāo)品k錯(cuò)義突變brca1c.[181t>g]陽(yáng)性標(biāo)品l錯(cuò)義突變brca1c.[4327c>g]臨床樣本a2snv/snp位點(diǎn)全部檢出，但無(wú)陽(yáng)性位點(diǎn)陰性對(duì)照品snv/snp位點(diǎn)全部檢出，但無(wú)陽(yáng)性位點(diǎn)結(jié)果顯示：6例陽(yáng)性標(biāo)品包括brca1/2錯(cuò)義突變、移碼突變均正確檢測(cè)，該結(jié)果與sanger檢測(cè)結(jié)果一致。說(shuō)明本實(shí)施例的建庫(kù)方法及試劑盒具有很好的檢測(cè)性能。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。sequencelisting<110>深圳華大基因股份有限公司，天津華大醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司，廣州華大基因醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司，華大生物科技（武漢）有限公司<120>一種brca1/2基因檢測(cè)文庫(kù)的構(gòu)建方法和試劑盒<130>17i23988<160>14<170>patentinversion3.3<210>1<211>58<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(32)..(41)<223>nisa,c,g,ort<400>1agtcggaggccaagcggtcttaggaagacaannnnnnnnnncaactccttggctcaca58<210>2<211>38<212>dna<213>人工序列<400>2ttgtcttcctaaggaacgacatggctacgatccgactt38<210>3<211>17<212>dna<213>人工序列<400>3gaacgacatggctacga17<210>4<211>58<212>dna<213>人工序列<400>4agtcggaggccaagcggtcttaggaagacaaaccaaatgatcaactccttggctcaca58<210>5<211>58<212>dna<213>人工序列<400>5agtcggaggccaagcggtcttaggaagacaatgtcataaatcaactccttggctcaca58<210>6<211>58<212>dna<213>人工序列<400>6agtcggaggccaagcggtcttaggaagacaattaattaaggcaactccttggctcaca58<210>7<211>58<212>dna<213>人工序列<400>7agtcggaggccaagcggtcttaggaagacaagactcactgacaactccttggctcaca58<210>8<211>58<212>dna<213>人工序列<400>8agtcggaggccaagcggtcttaggaagacaaataaggcagtcaactccttggctcaca58<210>9<211>58<212>dna<213>人工序列<400>9agtcggaggccaagcggtcttaggaagacaattgatagattcaactccttggctcaca58<210>10<211>58<212>dna<213>人工序列<400>10agtcggaggccaagcggtcttaggaagacaaccttcctggtcaactccttggctcaca58<210>11<211>58<212>dna<213>人工序列<400>11agtcggaggccaagcggtcttaggaagacaaaatatctctccaactccttggctcaca58<210>12<211>58<212>dna<213>人工序列<400>12agtcggaggccaagcggtcttaggaagacaacatgtttccccaactccttggctcaca58<210>13<211>17<212>dna<213>人工序列<400>13gaacgacatggctacga17<210>14<211>17<212>dna<213>人工序列<400>14tgtgagccaaggagttg17當(dāng)前第1頁(yè)12